Foxp3基因在URSA患者外周血中的表達(dá)及其臨床意義

張小燕，李曉麗，李雪華，黃娟

（1.平頂山市第一人民醫(yī)院產(chǎn)房，河南 平頂山 467000；2.平頂山市第一人民醫(yī)院婦一科，河南 平頂山 467000）

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)是臨床常見的一種妊娠并發(fā)癥，已嚴(yán)重影響人類生殖健康，其病因較為復(fù)雜，其中一半以上復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者病因不明,因而稱為原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）[1,2]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 （regulatory T cell，Treg）在正常妊娠的維持中發(fā)揮重要調(diào)控作用,其中叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子P3（Forkhead box P3，F(xiàn)oxp3）在Treg細(xì)胞中特異性表達(dá)并可作為標(biāo)志性分子[3]。既往研究顯示Foxp3基因多態(tài)性與URSA的發(fā)生密切相關(guān)[4,5]。但Foxp3基因在URSA發(fā)生過程中的調(diào)控作用尚未闡明。因此，本研究主要探討Foxp3基因在URSA患者外周血中的表達(dá)及其臨床意義，為URSA的診斷及治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年9月-2018年9月本院收治的55例URSA早孕婦女作為研究組，所有研究對象符合相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)：連續(xù)2次或超過2次自然流產(chǎn)；無死產(chǎn)、活產(chǎn)史；檢查后無與流產(chǎn)相關(guān)的常見發(fā)病原因[6]。研究組患者年齡25～45歲，平均年齡33.49±6.12歲。同時選取同期50例正常早孕婦女為對照組，所有婦女均無遺傳與自然流產(chǎn)史，無死胎或解剖，無內(nèi)分泌異常，懷孕期間未發(fā)生生殖道感染，年齡25～42歲，平均年齡32.46±5.29歲。兩組研究對象年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者知情且簽署同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：無自然流產(chǎn)史；月經(jīng)周期規(guī)律。排除標(biāo)準(zhǔn)：甲狀腺功能異常者；自身免疫性疾病患者；血小板增多癥患者。

1.2 方法

1.2.1 采集樣本及分離單核細(xì)胞 抽取兩組研究對象次日清晨空腹靜脈血5ml，4℃條件下經(jīng)3000r/min離心5min，收集血液樣本置于抗凝管內(nèi)，放入-20℃冰箱內(nèi)保存。采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細(xì)胞（PBMCs），調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個/mL。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)檢測外周血中Foxp3 mRNA的表達(dá)水平 采用Trizol法（北京全式金生物技術(shù)有限公司）提取外周血中的總RNA。應(yīng)用Nanodrop2000c超微量分光光度計檢測RNA濃度與純度。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京天根生化科技有限公司）說明書操作將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。Foxp3正向引物5’-CATCCGCCACAACCTGAGTC TG-3’，反向引物5’-CCTGTTCGTCCATCCTCCTT TCCT-3’；β-actin正 向 引 物5’-GCACCACACCTTCTACAATGAGC-3’，反向引物5’-GGATAGCACAGCCTGGATAGCAAC-3’,引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計合成。參照qRT-PCR試劑盒（北京天根生化科技有限公司）說明書配置反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2min，95℃變性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s,共40次循環(huán)。Foxp3以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算Foxp3 mRNA的相對表達(dá)量。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗 （enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測免疫細(xì)胞因子水平采用ELISA法檢測免疫細(xì)胞因子白細(xì)胞介素17（interleukin-17，IL-17）、白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）的水平，檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.4 檢測Th1/Th2型細(xì)胞因子水平 采用ELISA法檢測Th1/Th2型細(xì)胞因子白細(xì)胞介素2（interleukin-2，IL-2）、α干擾素（interferon α，IFN-α）、γ干擾素（interferon γ，IFN-γ）、白細(xì)胞介素4（interleukin-4，IL-4）、白細(xì)胞介素10（interleukin-10，IL-10）的水平，檢測試劑盒購自北京鼎國生物科技有限公司，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血PD-1、Tim-3的表達(dá)水平 收集PBMCs懸液100μl分別加入5μl CD14-FITC、PD-1-PE、Tim-3-PE，設(shè)置同型對照，室溫避光孵育15min,加入2ml Buffer洗滌，4℃條件下經(jīng)3000r/min離心10min，棄上清，加入Buffer重懸細(xì)胞500μl，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測CD14+單核細(xì)胞上T細(xì)胞免疫球蛋白和黏蛋白結(jié)構(gòu)域3（T cell immuno-globulin and mucin domain 3，Tim-3）與程序性細(xì)胞死亡分子-1（programmed death-1，PD-1）的表達(dá)，采用百分比表示。鼠抗人CD14-FITC與PD-1-PE購自美國eBioscience公司;Tim-3-PE購自美國BioLengend公司；同型對照鼠抗人IgG1-FITC/PE購自武漢艾美捷科技有限公司。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS21.0進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料采用檢驗，采用Pearson法分析URSA患者外周血中Foxp3與免疫細(xì)胞因子、Th1/Th2型細(xì)胞因子、PD-1及Tim-3的相關(guān)性，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受試者外周血Foxp3基因表達(dá)量比較與對照組比較，研究組外周血Foxp3 mRNA的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），見表1。

表1 兩組受試者外周血Foxp3基因表達(dá)量比較（）

表1 兩組受試者外周血Foxp3基因表達(dá)量比較（）

注：與對照組比較，*P<0.05。

組別 n對照組研究組50 55 t P Foxp3 mRNA 1.00±0.20 0.52±0.15*13.991 0.000

2.2 兩組受試者外周血免疫細(xì)胞因子水平比較與對照組比較，研究組外周血IL-17、IL-6水平顯著升高，TGF-β水平顯著降低（P＜0.05），見表2。

表2 兩組受試者外周血免疫細(xì)胞因子水平比較（）

表2 兩組受試者外周血免疫細(xì)胞因子水平比較（）

注：與對照組比較，*P<0.05。

組別 n對照組研究組50 55 tP IL-17（pg/mL）IL-6（ng/mL）225.75±36.52 346.57±56.85*12.813 0.000 43.25±10.03 66.24±16.24*8.624 0.000 TGF-β（ng/mL）708.14±55.24 521.03±36.12*20.721 0.000

2.3 兩組受試者外周血Th1/Th2型細(xì)胞因子水平比較 與對照組比較，研究組外周血IL-2、IFN-α、IFN-γ水平顯著升高（P＜0.05），IL-4、IL-10水平顯著降低（P＜0.05），見表3。

表3 兩組受試者外周血Th1/Th2型細(xì)胞因子水平比較（，μg/L）

表3 兩組受試者外周血Th1/Th2型細(xì)胞因子水平比較（，μg/L）

注：與對照組比較，*P<0.05。

組別 n IL-2 IFN-α IFN-γ IL-4 IL-10對照組研究組50 55 t P 4.21±0.52 8.32±1.27*21.310 0.000 5.46±1.13 30.21±5.21*32.882 0.000 503.21±46.57 695.48±46.16*21.227 0.000 26.19±3.21 11.71±2.13*27.464 0.000 28.46±3.16 16.58±3.58*17.952 0.000

2.4 兩組受試者外周血PD-1、Tim-3的表達(dá)水平比較 與對照組比較，研究組外周血PD-1、Tim-3的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），見表4。

表4 兩組受試者外周血PD-1、Tim-3的表達(dá)水平比較（

表4 兩組受試者外周血PD-1、Tim-3的表達(dá)水平比較（

注：與對照組比較，*P<0.05。

組別 n對照組研究組50 55 t P PD-1（%）3.52±0.54 2.03±0.52*14.398 0.000 Tim-3（%）3.50±0.95 2.11±0.62*8.956 0.000

2.5 URSA患者外周血Foxp3與免疫細(xì)胞因子、Th1/Th2型細(xì)胞因子、PD-1及Tim-3的相關(guān)性分析 采用Pearson法分析URSA患者外周血中Foxp3與免疫細(xì)胞因子、Th1/Th2型細(xì)胞因子、PD-1及Tim-3的相關(guān)性，結(jié)果顯示Foxp3與IL-17、IL-6、IL-2、IFN-α、IFN-γ呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），而與TGF-β、IL-4、IL-10、PD-1、Tim-3呈正相關(guān)（P＜0.05），見表5。

表5 Foxp3與免疫細(xì)胞因子、Th1/Th2型細(xì)胞因子、PD-1及Tim-3的相關(guān)性分析（r/P）

3 討論

Th1/Th2、Th17/Treg等細(xì)胞因子失衡可引起免疫系統(tǒng)異常從而參與自身免疫性疾病等多種疾病的發(fā)生及發(fā)展過程，研究表明URSA的發(fā)生與Th17/Treg細(xì)胞失衡有關(guān)[7,8]。因而探究Foxp3基因與Th1/Th2、Th17/Treg等免疫細(xì)胞因子的相關(guān)性具有重要意義。

Foxp3基因位點多態(tài)性可增加原發(fā)性高血壓發(fā)生的風(fēng)險[9]。研究表明Foxp3基因表達(dá)改變可參與自身免疫性疾病的發(fā)生過程[10-12]。本研究結(jié)果顯示Foxp3基因在URSA患者外周血中表達(dá)下調(diào)，提示Foxp3基因表達(dá)下調(diào)可能促進(jìn)URSA的發(fā)生。研究表明Th17/Treg細(xì)胞相關(guān)因子IL-17、IL-6、TGF-β表達(dá)異常與母體及胎兒間免疫耐受、良好的妊娠結(jié)局密切相關(guān)[13]。本研究結(jié)果顯示研究組患者外周血中IL-17、IL-6水平顯著升高，而TGF-β水平顯著降低，進(jìn)一步分析顯示Foxp3基因與IL-17、IL-6呈負(fù)相關(guān)，F(xiàn)oxp3基因與TGF-β呈正相關(guān)，說明Foxp3基因可能通過作用于IL-17、IL-6、TGF-β細(xì)胞調(diào)節(jié)URSA患者免疫抑制性。提示Foxp3基因的直接或間接調(diào)節(jié)可能是由于Th17/Treg細(xì)胞免疫功能障礙的作用，進(jìn)而影響URSA患者的Th17/Treg細(xì)胞平衡。Th1/Th2型細(xì)胞失衡與妊娠狀態(tài)密切相關(guān)，正常妊娠狀態(tài)時母體趨向于Th2型細(xì)胞因子參與細(xì)胞免疫應(yīng)答，而病理性妊娠狀態(tài)時母體趨向于Th1細(xì)胞因子參與細(xì)胞免疫應(yīng)答，母體Th1型細(xì)胞因子過度表達(dá)可促進(jìn)自然流產(chǎn)的發(fā)生，Th1型細(xì)胞因子主要為IL-2、IFNα、IFN-γ，其中IL-2可增強(qiáng)T細(xì)胞殺傷活性并可誘導(dǎo)T細(xì)胞分泌IFN-α、IFN-γ等，IFN-γ還可抑制人絨毛膜外滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵入從而導(dǎo)致胚胎著床失敗[14]。Th2型細(xì)胞因子主要包括IL-4、IL-10，IL-4可影響自然殺傷細(xì)胞的應(yīng)答及淋巴因子的殺傷活性，IL-10屬于抗炎抑制并可參與參與機(jī)體免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng)，Th2型細(xì)胞因子可抑制Th1型細(xì)胞因子的表達(dá)，研究表明Th2型細(xì)胞因子在維持正常妊娠過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[15]。本研究結(jié)果顯示研究組患者外周血中IL-2、IFN-α、IFN-γ水平顯著升高，IL-4、IL-10水平顯著降低，說明妊娠刺激母體免疫系統(tǒng)后促使免疫系統(tǒng)分泌異常從而促進(jìn)URSA的發(fā)生。本研究進(jìn)一步分析顯示Foxp3基因與IL-2、IFN-α、IFN-γ呈負(fù)相關(guān)，F(xiàn)oxp3基因與IL-4、IL-10呈正相關(guān)，提示Foxp3基因表達(dá)量降低可能通過引起免疫平衡失調(diào)而增加危險因子及減少保護(hù)因子從而促進(jìn)URSA的發(fā)生及發(fā)展。相關(guān)報道指出PD-1、Tim-3屬于T細(xì)胞負(fù)性調(diào)節(jié)因子，并可負(fù)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞反應(yīng)，Tim-3可抑制巨噬細(xì)胞活化而參與早期免疫反應(yīng)，阻斷Tim-3表達(dá)可降低PD-1基因表達(dá)，進(jìn)一步研究顯示PD-1、Tim-3在URSA患者外周血中表達(dá)量降低，并可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫及體液免疫從而促進(jìn)URSA的發(fā)生[16-19]。與上述研究結(jié)果相似，本研究結(jié)果顯示研究組患者外周血中PD-1、Tim-3的表達(dá)水平顯著降低，進(jìn)一步分析顯示Foxp3基因與PD-1、Tim-3呈正相關(guān)，提示Foxp3基因表達(dá)量降低可能通過抑制PD-1、Tim-3表達(dá)而調(diào)控細(xì)胞免疫及體液免疫從而促進(jìn)URSA的發(fā)生及發(fā)展。

綜上所述，URSA患者外周血中Foxp3基因表達(dá)量降低，其表達(dá)量與Th17/Treg細(xì)胞因子、Th1/Th2型細(xì)胞因子、PD-1、Tim-3密切相關(guān)，推測Foxp3基因可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫及體液免疫而參與URSA的發(fā)生及發(fā)展過程，可為URSA的免疫治療提供理論依據(jù)。但Foxp3基因在URSA的發(fā)生及發(fā)展過程中的作用機(jī)制尚未闡明，本研究將進(jìn)一步探究Foxp3基因?qū)RSA患者外周血單核細(xì)胞功能的影響，以期從免疫反應(yīng)的啟動階段給予干預(yù)進(jìn)而促使免疫反應(yīng)向有利的方向發(fā)展。