基因芯片技術(shù)在耐藥結(jié)核病臨床診斷中的應(yīng)用價(jià)值研究

馮剛

（連云港市第四醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 連云港 222000）

耐藥結(jié)核病是全球性公共衛(wèi)生問題[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織估算,全球每年約有37.8萬例新發(fā)耐多藥結(jié)核病[2]。中國(guó)是耐藥結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家，每年大概新發(fā)11萬耐多藥結(jié)核病[3]。利福平與異煙肼是目前抗結(jié)核的主要一線藥,其耐藥性檢測(cè)對(duì)結(jié)核病患者的治療有重要意義[4]。傳統(tǒng)比例法藥物敏感性試驗(yàn)診斷結(jié)核病耐藥性,雖靈敏度較高但實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)[5,6]，往往需要數(shù)月時(shí)間，不能滿足臨床診斷需求[7]。因此，快速耐藥檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用是當(dāng)前結(jié)核病控制的關(guān)鍵[8]。

基因芯片方法利用基因雜交技術(shù),通過檢測(cè)標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌rpoB、katG/inhA基因,可以在8h內(nèi)判定其對(duì)利福平及異煙肼兩種抗結(jié)核藥物的耐藥性[9,10]。研究報(bào)道基因芯片方法診斷結(jié)核病耐藥性的靈敏度和特異性高,適用于耐藥結(jié)核病臨床診斷[11]。本研究通過用該方法在連云港四院檢測(cè)肺結(jié)核患者陽性痰標(biāo)本,檢測(cè)是否含有結(jié)核分枝桿菌及其對(duì)利福平和異煙肼的耐藥性,初步分析該技術(shù)的檢測(cè)效能，探討其在地市級(jí)臨床結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室的推廣應(yīng)用價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 連續(xù)納入2016年1月-2018年12月連云港地區(qū)各區(qū)縣發(fā)現(xiàn)的所有肺結(jié)核病例，共有2018例涂片陽性患者的痰樣本運(yùn)送到連云港第四醫(yī)院進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)分析。詳細(xì)記錄從痰樣本留取到實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的時(shí)間。

1.2 方法

1.2.1 痰標(biāo)本處理 痰標(biāo)本采用N-乙酰-L半胱氨酸-NaOH(NALC—NaOH)消化液處理，使用磷酸鹽緩沖液中和離心后，傾倒磷酸鹽緩沖液并重懸菌液沉淀至2ml，備用。

1.2.2 培養(yǎng) 取0.1ml標(biāo)本消化液接種2支羅氏中性固體培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～8周觀察結(jié)果，培養(yǎng)陽性菌株用于藥物敏感性試驗(yàn)。

1.2.3 比例法藥物敏感性試驗(yàn) 采用比例法將培養(yǎng)陽性分離菌株研磨制成1mg/ml的混懸液,再分別稀釋至10～2mg/ml和10～4mg/ml,分別使用22 SWG標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)挑取一滿環(huán)（即0.01ml）的混懸液接種至含利福平和異煙肼的培養(yǎng)基中，用相同方法接種對(duì)照組培養(yǎng)基。置于36±1℃條件下連續(xù)培養(yǎng)4周后觀察結(jié)果，計(jì)數(shù)培養(yǎng)基上的菌落數(shù)并計(jì)算耐藥率。耐藥率（%）＝（含藥培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)／對(duì)照培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)）×100%。耐藥率＜1%為敏感，耐藥率＞1%為耐藥。

1.2.4 基因芯片耐藥檢測(cè) 取1ml經(jīng)4%氫氧化鈉處理后的消化液加入1.5ml離心管中,以12000r/min離心5min，棄上清液后加1ml磷酸鹽緩沖液，震蕩混勻后以12000r/min離心5min，棄上清液后加入80μl核酸提取液，充分混勻，然后移入核酸提取管中，旋渦振蕩充分混勻，置于超聲震蕩儀中處理5min，95℃干浴15min，12000r/min離心1min備用。按試劑盒操作說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增、芯片洗滌干燥、芯片雜交、芯片掃描和結(jié)果判讀等。

1.3 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 22.0軟件對(duì)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,采用四格表的形式計(jì)算敏感度和特異度,評(píng)價(jià)基因芯片檢測(cè)對(duì)利福平和異煙肼耐藥性的檢測(cè)效能。差異檢驗(yàn)經(jīng)配對(duì)卡方檢驗(yàn)（McNemar Test），P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。還使用Cohen的kappa（κ）系數(shù)評(píng)估了傳統(tǒng)藥敏實(shí)驗(yàn)與基因芯片技術(shù)之間的一致性程度，κ>0.75表示這兩種方法的一致性非常好，0.4<κ<0.75表示這兩種方法的一致性良好。κ<0.4表示這兩種方法的一致性較差。

2 結(jié)果

2.1 病歷納入情況 對(duì)收集的2018例涂陽病例的痰標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)，341例培養(yǎng)陰性（16.9%）,17例污染（0.8%）。1660例培養(yǎng)陽性樣本進(jìn)行比例法藥敏試驗(yàn)，241例非結(jié)核分枝桿菌，8例結(jié)果無法判讀，1411例獲得耐藥結(jié)果。2018例病例的涂陽痰樣本進(jìn)行基因芯片檢測(cè)，201例為非結(jié)核分枝桿菌（10.0%）,155例結(jié)果無法判讀（7.7%），1662例獲得耐藥檢測(cè)結(jié)果。

2.2 基因芯片檢測(cè)痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平的耐藥性分析 以固體藥敏試驗(yàn)為標(biāo)準(zhǔn)，共計(jì)有1333例可以進(jìn)行基因芯片耐藥檢測(cè)對(duì)比分析?；蛐酒瑱z測(cè)利福平耐藥的靈敏度和特異度分別為82.1%和97.5%。見表1。

表1 基因芯片檢測(cè)利福平耐藥的效能分析

2.3 基因芯片檢測(cè)痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌對(duì)異煙肼的耐藥性分析 以固體藥敏試驗(yàn)為標(biāo)準(zhǔn)，共計(jì)有1333例可以進(jìn)行基因芯片耐藥檢測(cè)對(duì)比分析。基因芯片檢測(cè)異煙肼耐藥的靈敏度和特異度分別為76.8%和96.0%。見表2。

表2 基因芯片檢測(cè)異煙肼耐藥的效能分析

2.4 基因芯片檢測(cè)失敗樣本分析2018例涂陽痰樣本全部進(jìn)行基因芯片檢測(cè)，155例耐藥檢測(cè)結(jié)果為無分枝桿菌或無法判讀（7.7%）。其中85.8%的樣本涂片結(jié)果分布在2+以下。見表3。

表3 基因芯片檢測(cè)失敗樣本涂片結(jié)果分布

3 討論

目前越來越多的新檢測(cè)技術(shù)可進(jìn)行結(jié)核病及耐藥結(jié)核病的早期診斷和鑒定,每種檢測(cè)技術(shù)各有利弊[12-14]?；蛐酒投嗨幵噭┛芍苯佑糜谔狄杭捌渌喾N臨床標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測(cè)。

基因芯片法不僅能用于結(jié)核分枝桿菌的鑒定,且相對(duì)于傳統(tǒng)比例法極大地縮短了結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測(cè)的時(shí)間。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[15-17]，以比例法藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果為判斷標(biāo)準(zhǔn),檢測(cè)利福平耐藥性的靈敏度和特異度分別為84.4%和97.7%，檢測(cè)異煙肼耐藥性的靈敏度和特異度分別為80.9%和97.4%。本次研究結(jié)果顯示，基因芯片檢測(cè)利福平耐藥的靈敏度、特異度和kappa分別為82.1%、97.5%和0.67?；蛐酒瑱z測(cè)異煙肼耐藥的靈敏度、特異度和kappa分別為76.8%、96.0%和0.65，兩種方法的結(jié)果顯示出良好的一致性。效能結(jié)果與其它文獻(xiàn)所示數(shù)據(jù)接近[18]，提示基因芯片法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平及異煙肼的耐藥性具有較好的靈敏度和特異度，亦有較好的重復(fù)性。

研究報(bào)道，基因芯片檢測(cè)的靈敏度與標(biāo)本中分枝桿菌的數(shù)量呈正相關(guān)[19]。本次試驗(yàn)中有155例(7.7%)樣本基因檢測(cè)結(jié)果失敗，其中99例樣本檢測(cè)為無分枝桿菌,提示基因芯片法實(shí)驗(yàn)成功與否還與標(biāo)本中存在的分枝桿菌實(shí)際數(shù)量有關(guān)，155例樣本中有133例標(biāo)本涂片鏡檢陽性程度較低（≤2+）。

基因芯片法可以同時(shí)檢測(cè)利福平和異煙肼兩種抗結(jié)核藥物的耐藥性,故此法亦可用于耐多藥肺結(jié)核患者的快速診斷。與傳統(tǒng)比例法藥敏實(shí)驗(yàn)相比，基因芯片法具有以下優(yōu)點(diǎn):⑴基因芯片技術(shù)具有分子生物學(xué)的高靈敏度,同時(shí)結(jié)合了生物芯片技術(shù)的高通量性,相對(duì)于比例法大大縮短了檢測(cè)時(shí)間,能夠在8h內(nèi)完成結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測(cè)，因此可以更早地為臨床醫(yī)生制定用藥方案提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)[20]，并縮短了實(shí)驗(yàn)室工作人員的操作時(shí)間;⑵本方法是針對(duì)結(jié)核分枝桿菌核酸進(jìn)行檢測(cè)分析，并不需要對(duì)大量活菌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，因此，此方法比傳統(tǒng)比例法藥敏試驗(yàn)更安全。但基因芯片法亦有一定的缺點(diǎn)，操作流程較比例法藥敏試驗(yàn)更為繁瑣，因此對(duì)實(shí)驗(yàn)室操作人員的技術(shù)要求更高，且設(shè)備價(jià)格昂貴，檢測(cè)試劑、耗材的成本較高，對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境也有較高的要求。

綜上所述，初步研究結(jié)果表明相對(duì)于傳統(tǒng)比例法藥敏實(shí)驗(yàn)基因芯片檢測(cè)周期短，操作相對(duì)復(fù)雜，在檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌同時(shí)可以準(zhǔn)確檢測(cè)利福平和異煙肼的耐藥性，對(duì)結(jié)核病尤其是耐多藥結(jié)核病的早期診斷和治療具有十分重要的意義。