同位素內(nèi)標-液相色譜-串聯(lián)質譜法測定動物性食品中氟蟲腈及其代謝物殘留

周鴻，譚洪濤，于暉，李娟，謝慧英

（江西省疾病預防控制中心 江西省食源性疾病診斷溯源重點實驗室，江西 南昌 330029）

氟蟲腈是一種苯基吡唑殺蟲劑[1-3]，可作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)γ-氨基丁酸(GABA)門控氯通道的非競爭性阻斷劑[4]，具有廣譜殺蟲效果，推廣于各行業(yè)的害蟲防治[5,6]。2017年歐洲出現(xiàn)“毒雞蛋”事件，引起國內(nèi)外對氟蟲腈及其代謝物在動物源食品中殘留的關注[7]。氟蟲腈在動物體內(nèi)產(chǎn)生三種代謝產(chǎn)物：氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜[8]（見圖1），而代謝產(chǎn)物的毒性要高于氟蟲腈[9]。由于攝入過量的氟蟲腈對人體神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟、消化系統(tǒng)、甲狀腺均有損害，故歐盟、日本和國際食品法典委員會嚴格規(guī)定了氟蟲腈及其代謝產(chǎn)物的最大殘留限量（MRL）[10,11]，我國也在GB 2763-2019《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定蛋類和禽肉類中氟蟲腈的MRL分別為0.02mg/kg和0.01mg/kg[12]，氟蟲腈殘留量包含氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜總量。

圖1 氟蟲腈及其代謝物的化學結構

目前，測定氟蟲腈及其代謝物的主要方法有氣相色譜法（GC）[13-15]、氣相色譜-質譜法（GC-MS）[16,17]、液相色譜法（HPLC）[18,19]和液相色譜-串聯(lián)質譜法[20-22]。動物性食品具有基質復雜、前處理過程繁瑣、干擾較大、耗時長的特點，針對這一特性，本研究采用PRiME HLB通過式凈化方法[23,24]，省去了傳統(tǒng)固相萃取的活化、平衡和洗脫等步驟，樣品經(jīng)提取后直接過柱，能快速、有效除地去動物性食品中的雜質，有效降低樣品的基質效應，從而提高方法的精密度和靈敏度。同時結合同位素內(nèi)標-UPLC-MS/MS技術，建立了測定動物性食品中氟蟲腈及其代謝物的方法。該方法簡單快捷、靈敏度高，適用于大批量氟蟲腈檢測需求。

1 材料與方法

樣本采集：雞肉和雞蛋均購自本地超市和農(nóng)貿(mào)市場。

2 儀器與方法

2.1 儀器與試劑QTRAP 5500質譜儀（美國SCIEX公司）；高速低溫離心機（德國Sigma公司）；渦旋振蕩器（德國Heidolph公司）；Oasis PRiME HLB SPE（300mg/3ml，美國Waters公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；MS304S電子天平（梅特勒-托利多公司）。

氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜標準品（濃度為100 μg/ml，德國Dr.Ehrenstorfer公司）；13C215N2-氟蟲腈（First Standard公司）；乙腈和甲酸（色譜純，德國Merck公司）；乙酸銨（阿拉丁公司）、氯化鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司），實驗用水由Milli-Q超純水系統(tǒng)制得。

2.2 標準溶液的配制 分別準確稱取適量氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜和13C215N2-氟蟲腈標準品，用乙腈溶解并定容，配制成質量濃度為100 mg/L的氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜標準儲備液和100 mg/L的內(nèi)標儲備液，于-18°C避光保存；移取氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜和內(nèi)標儲備液，根據(jù)需要用50%乙腈逐級稀釋，配制適當濃度的標準工作液（含氟蟲腈內(nèi)標2 μg/L），現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.3 色譜-質譜條件 色譜柱：BEH C18色譜柱（100mm×2.1mm，1.7μm）；柱溫：40°C；進樣量2μl；流動相A：含0.1%（v/v）甲酸的1mmoL乙酸銨溶液，流動相B：甲醇；流速：0.3ml/min。梯度洗脫程序：0～1.0min,25%B；1.0～5.0min,65%B～95%B；5.0～7.0min,95%B；7.1～9.0 min,25%B。進樣體積2μl。

離子源：電噴霧電離（ESI）源，負離子模式：多反應監(jiān)測（MRM）；氣簾氣（Curtain gas）:35.0 L/h；霧化氣（Gas1）：50.0 L/h；加熱輔助氣（Gas2）流量：50.0 L/h；噴霧電壓 （IS）：4500 V；離子源溫度（TEM）500 °C；氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜和13C215N2-氟蟲腈的保留時間、定量離子、定性離子、碰撞能量（CE）、去簇電壓（DP）等質譜參數(shù)見表1。

表1 氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜的質譜參數(shù)

2.4 樣品前處理 新鮮雞蛋去殼后攪拌均勻，雞肉用粉碎機搗碎。稱取2g試樣（精確至0.01g）于50 ml離心管中,加入2.0ml水、10ml 1%（體積分數(shù)）甲酸乙腈溶液、20μl同位素內(nèi)標工作溶液、渦旋振蕩30min,以10000r/min于4°C離心10min,待凈化。

取上層清液2ml過PRiME HLB柱，收集中間流出液于1.5ml離心管中,取0.5ml上述收集液，加入0.5ml水定容至1.0ml,過0.22μm PTFE有機微孔濾膜后，進樣待測定。

3 結果與討論

3.1 質譜與色譜條件的優(yōu)化 各取30 μg/L的單標溶液，用流動注射泵直接注入質譜儀進行質譜參數(shù)的優(yōu)化。由于在氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜的化學結構中存在強吸電子基團，分子較易失去氫質子，負離子模式質譜響應優(yōu)于正離子模式，故采用負離子模式進行檢測。

比較在乙腈-水、甲醇-水、乙腈-含0.1%（v/v）甲酸的水溶液、甲醇-含0.1%（v/v）甲酸的1 mmol乙酸銨水溶液、乙腈-含0.1%（v/v）甲酸的1 mmol乙酸銨水溶液為流動相體系下的峰形及質譜響應效果。結果表明：相同梯度下甲醇體系的分離效果更佳，在流動相中加入甲酸和乙酸銨有利于改善峰形，最終于采用甲醇-含0.1%（v/v）甲酸的1 mmol乙酸銨水溶液為本方法使用的流動相（見圖2）。

圖2 氟蟲腈及其代謝物的色譜圖

3.2 提取溶劑的選擇 根據(jù)化合物的特性，選用甲醇、乙腈、1%（v/v）甲酸甲醇和1%（v/v）甲酸乙腈作為提取溶劑，在陰性樣品中添加5.0 μg/kg混合標準溶液進行提取，內(nèi)標法定量，考察提取回收率（見圖3）。結果表明，以甲醇為提取液時，提取液渾濁且回收更低，乙腈具有更高的蛋白沉淀能力，提取液澄清；加入1%（v/v）甲酸可以減少基質效應，提高回收率，因此本研究選擇1%（v/v）甲酸乙腈作為提取溶劑。

圖3 不同溶劑提取對氟蟲腈及其代謝物回收率的影響

3.3 凈化方法的選擇和基質效應的評價 動物源食品基質復雜，含有大量的脂肪、蛋白和不飽和脂肪酸，這些物質不僅干擾UPLC-MS/MS分析，還影響色譜柱柱效和污染質譜儀。鑒于本實驗的目標提取液為高比例的有機相，采用通過式固相萃取技術凈化樣品，將樣品提取液直接通過PRiME HLB柱，少量的水可使填料中親水基團結構發(fā)生變化，能有效吸附基質干擾物。

為驗證方法，以雞蛋和雞肉為研究對象，將采用PRiME HLB柱凈化方式和直接提取的效果進行比較，評價兩種方法的基質效應（ME）。ME為基質匹配標準曲線與溶劑標準曲線的斜率的比值，比值越接近1，則基質效應越小。本實驗用空白基質提取液配制濃度范圍為0.05 μg/L～20 μg/L基質匹配標準溶液，同時用50%乙腈配制相同濃度的溶劑標準溶液，考察了氟蟲腈及其代謝產(chǎn)物在雞肉和雞蛋中的基質效應，結果列于表2：采用PRiME HLB柱凈化方式效果更佳，ME為0.894～0.992之間，不存在明顯的基質效應。

表2 氟蟲腈及其代謝物的線性、相關系數(shù)、ME、檢出限及定量限

3.4 方法學驗證 對氟蟲腈及其代謝物質量濃度分別為0.05μg/L、0.1μg/L、0.5μg/L、1μg/L、、5μg/L、10μg/L、20 μg/L和氟蟲腈同位素內(nèi)標質量濃度為2 μg/L的系列混合工作液進行測定,以氟蟲腈及其代謝物的定量離子峰面積和氟蟲腈內(nèi)標定量離子峰面積的比值為縱坐標（y），對應的質量濃度的比值為橫坐標（x），繪制標準曲線。氟蟲腈及其代謝物在0.05～20μg/L內(nèi)線性關系良好，相關系數(shù)（r）均大于0.999，以3倍信噪比（S/N=3）和10倍信噪比（S/N=10）確定氟蟲腈及其代謝物的LOD和LOQ分別為0.2μg/kg和0.7μg/kg。

在雞蛋和雞肉樣品中分別添加0.5、5、20μg/kg的氟蟲腈及其代謝物標準，按1.3節(jié)前處理，進行加標回收實驗（n=6），結果表明：方法的平均加標回收率在88.2%～95.1%，RSD為3.3%～7.8%。見表3。

表3 氟蟲腈及其代謝物的平均回收率和精密度

3.5 實際樣品檢測 采用本方法檢測市售20批次雞蛋和10批次雞肉樣品中的氟蟲腈及其代謝物殘留，結果顯示，有4批次雞蛋檢出氟蟲腈砜，含量為0.85～4.9 μg/kg，低于我國所規(guī)定的最大殘留限量。

4 結論

本實驗建立了同位素內(nèi)標-液相色譜-串聯(lián)質譜測定動物性食品中氟蟲腈及其代謝物的定量分析方法。無需復雜樣品前處理過程，采用通過式固相萃取凈化，降低了基質干擾；同時采用同位素內(nèi)標法定量，保證了方法的準確性，定量限和精密度能滿足痕量分析。適用于大批量動物性食品中氟蟲腈及其代謝產(chǎn)物的檢測，為食品監(jiān)管提供了技術支撐。