肺纖方對小鼠肺纖維化模型及NIH3T3成纖維細胞作用機制的研究

謝 緯 唐明文 郭竹英 陳 生 黃俊浩 曾梓苑

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種病因不明、慢性進行性纖維化性間質(zhì)性肺炎，病變局限于肺臟，其肺組織學(xué)及胸部高分辨CT表現(xiàn)為以普通型間質(zhì)性肺炎(UIP)為特征的一種慢性間質(zhì)性肺疾病，主要表現(xiàn)為彌漫性肺泡炎、肺泡單位結(jié)構(gòu)紊亂和肺纖維化[1]。在各種形式的間質(zhì)性肺病中，IPF作為最常見的特發(fā)性間質(zhì)性肺炎，IPF因其獨特的不良預(yù)后和對傳統(tǒng)療法無反應(yīng)性而受到較多關(guān)注[2]。至今導(dǎo)致IPF發(fā)生的病因和發(fā)病機制尚不明確，對于IPF 目前尚無肯定顯著有效的治療藥物，目前治療藥物主要有糖皮質(zhì)激素、吡非尼酮、尼達尼布和N-乙酰半胱氨酸等，但療效仍不理想，且部分藥物不良反應(yīng)大。肺移植可以延長具有適應(yīng)癥IPF患者的生存期，改善其生活質(zhì)量，提高其生存率，但技術(shù)要求高，供體稀缺，費用昂貴，限制了肺移植在臨床上的實施[1]。中醫(yī)藥治療IPF有其獨特的優(yōu)勢并展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。目前已經(jīng)有不少關(guān)于中醫(yī)藥治療肺纖維化的實驗和臨床研究[3]，但關(guān)于中藥對成纖維細胞的影響未見相關(guān)報道。本研究通過前期探索應(yīng)用博來霉素建立肺纖維化小鼠模型結(jié)果的基礎(chǔ)上[4]，以博來霉素(8 mg/kg)建立肺纖維化小鼠模型，觀察中藥肺纖方干預(yù)后對小鼠肺泡炎和肺纖維化程度的影響，同時擬通過體外細胞培養(yǎng)的方法來探討不同濃度的肺纖方煎劑對細胞增殖的影響以及是否存在抑制成纖維細胞CyclinDl表達和改善MMPs/TIMPs系統(tǒng)失衡等可能，進一步探討其可能存在的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

SPF級雄性KM小鼠，體重20～22 g，由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供；小鼠NIH3T3細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司；肺纖方煎劑(桃仁10 g、紅花10 g、當歸10 g、生地黃10 g、牛膝10 g、川芎10 g、桔梗10 g、赤芍10 g、枳殼10 g、柴胡10 g、黃芪30 g、黨參15 g、法半夏10 g、化橘紅10 g、茯苓10 g、石菖蒲10 g、膽南星10 g、天竺黃10 g、甘草10 g組成，由深圳市中醫(yī)院提供)，本院制備，劑型為濃縮袋裝煎液(為成人劑量150 毫升/袋，按1 g/mL劑量，每天2次，每次1袋，按成人60 kg體質(zhì)量計算，給藥量相當于5 g/kg，中劑量組為原液再次濃煎成一半劑量制備，以此法再次濃縮制備高劑量中藥液)；注射用鹽酸博萊霉素(上海生工；A606211)；甲潑尼龍(主要成分甲潑尼龍琥珀酸鈉；Pfizer Manufacturing Belgium NV；注冊證號H20170197)；羥脯氨酸(Hydroxyproline，Hyp)測定試劑盒；兔抗小鼠CyclinD1多克隆抗體(ab16663)；兔抗小鼠MMP2多克隆抗體(ab97779)；兔抗小鼠TIMP1多克隆抗體(ab38978)；以上抗體購自abcam 公司。

1.2 模型制備及分組

雄性KM小鼠60只，正常飼養(yǎng)1周后，其中取出50只小鼠，隨機分為模型組、甲潑尼龍組、肺纖方低、中、高劑量組，每組10只，使用腹腔注射水合氯醛(400 mg/kg)麻醉后固定于操作臺，以動物喉鏡壓下小鼠舌根暴露聲門，將霧化器(針頭灌胃器)從聲門插入氣管噴入博來霉素溶液(8 mg/kg)，間隔10 d后第二次給同等劑量博萊霉素造模，第二次給藥14 d(第一次給藥后24 d)后成模[3]；成模后第二天(即第一次給藥第25天)將造模動物隨機分為5組：模型組、甲潑尼龍組、肺纖方低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組各10只。空白對照組10只小鼠用相同的方法氣管內(nèi)霧化等容生理鹽水，25 d后給予開始每天給予相同體積(和低劑量中藥煎劑等同)生理鹽水灌胃14 d；肺纖方低、中、高劑量組每日分別給予肺纖方高、中、低劑量(20、10、5 g/kg)q12h灌胃；模型組給予相同體積生理鹽水(和低劑量中藥煎劑等同)灌胃,qd；甲潑尼龍組給予甲潑尼龍1 mg/kg溶于相同體積生理鹽水(和低劑量中藥煎劑等同)灌胃,qd；治療14 d后上述各組小鼠于第38天后處死，留取肺臟標本。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1 肺組織染色及肺泡炎及纖維化評價方法 常規(guī)肺病理組織標本固定、脫水、透明、包埋、切片，分別進行HE及Masson染色，鏡下觀察HE及Masson染色結(jié)果并照相。根據(jù)肺泡炎評價方法[5]：3級:重度改變，病變范圍占全肺的50%以上，計3分；2級：中度改變，病變范圍占全肺的 20%～50%，計2分；1 級：輕度改變，病變范圍小于全肺的20%，計1分；0級：無明顯病理改變，肺泡結(jié)構(gòu)正常，肺泡透亮，計0分。根據(jù)纖維化程度評價方法[6]，纖維化程度：8級：完全纖維化，計8分；7級：肺泡腔充斥纖維組織，出現(xiàn)肺大皰，計7分；6級：纖維灶面積大于50%，計6分；5級：纖維灶面積大于10%～50%，計5分；4級：纖維灶面積小于10%，計4分；3 級：連續(xù)纖維區(qū)域，計3分；2級：明顯纖維化出現(xiàn)，計2分；1級：肺泡輕微腫脹，局部輕微纖維出現(xiàn)，計1分；0級：正常肺，計0分。

1.3.2 小鼠肺組織羥脯氨酸(Hyp)測定 將小鼠處死后剖開取右肺中葉組織，使用4 ℃生理鹽水進行沖洗，濾紙吸濕后，稱取0.3 g，采用微量電動組織勻漿器研磨，如光鏡下未見完整細胞后即可將其制成10%的肺組織勻漿。4 ℃環(huán)境下6 000 r/min離心5 min，提取上清液并置于-20 ℃條件下保存，用比色法測定Hyp含量。

1.3.3 小鼠NIH3T3成纖維細胞培養(yǎng) 通過將含10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在濕飽和的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長到90%時用胰蛋白酶消化，取對數(shù)生長期的細胞種于孔板中，待細胞貼壁后，分別進行不同處理。分為對照組、肺纖方低濃度劑量組、肺纖方中濃度劑量組、肺纖方高濃度劑量組，分別給予肺纖方煎劑低濃度劑量(終濃度5 μg/mL)、中濃度劑量(終濃度10 μg/mL)、高濃度劑量(終濃度20 μg/mL)，對照組在同樣條件下給予相同體積的生理鹽水進行干預(yù)，一定時間點后進行相關(guān)檢測。

1.3.4 MTS法檢測肺纖方對細胞存活力的影響 將處于對數(shù)生長期的NIH3T3細胞用胰蛋白酶消化，消化后對細胞進行計數(shù)，調(diào)整細胞濃度以2×104接種于96孔板中，舍棄周邊孔。待細胞貼壁后，吸出培養(yǎng)基，分別換為含有低、中、高濃度的肺纖方的培養(yǎng)基和基礎(chǔ)培養(yǎng)基。每組設(shè)3個復(fù)孔。分別在4、24、48、72 h每孔中加入10 μL的MTS檢測溶液。37 ℃孵育3 h，用酶標儀于490 nm波長檢測吸光度值(A)。R細胞存活=A加藥細胞/A對照細胞。

1.3.5 平板克隆形成實驗 接種對數(shù)期細胞到10 cm培養(yǎng)皿，每個皿接種1×104個細胞。接種完后十字晃動使細胞均勻分散，放入細胞培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)1～2周，期間觀察細胞生長情況，以免生長過度。單個細胞在體外持續(xù)增殖6代以上，其后代所組成的細胞群體，成為克隆或集落。染色：預(yù)冷的PBS洗滌兩次；甲醇固定15 min，棄去固定液；Giemsa 染色10 min；自來水沖洗，空氣干燥后計數(shù)?？寺⌒纬陕?克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。

1.3.6 Western blot法測定細胞CyclinD1、MMP2、TIMP1蛋白的表達水平 培養(yǎng)對數(shù)生長期的NIH3T3細胞系于6孔板中，經(jīng)不同濃度的肺纖方煎劑干預(yù)48 h后，用細胞組織裂解液RIPA提取細胞總蛋白，行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF濾膜，5%脫脂奶粉封閉，加入CyclinD1、MMP2、TIMP1和GAPDH抗體，4 ℃過夜孵育；第二天洗滌后加入HRP標記的二抗，孵育1 h；用濾紙拭去膜上過多的液體，加上發(fā)光底物均勻覆蓋在PVDF膜上，避光反應(yīng)3～5 min。Bio-Rad化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)取像，用Scion Image軟件對蛋白條帶進行光密度分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0版統(tǒng)計軟件分析，計量數(shù)據(jù)中符合正態(tài)分布的資料以均數(shù)±標準差表示，通過單因素方法分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺病理組織學(xué)觀察

2.1.1 肺組織肺泡炎及肺纖維化評分比較 與對照組比較，模型組肺泡炎及肺纖維化評分顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，甲潑尼龍組和肺纖方各劑量組肺泡炎及肺纖維化評分降低(P<0.05)，且隨著肺纖方劑量的升高，肺纖方各劑量組肺泡炎及肺纖維化評分逐漸降低，呈劑量依賴性(P<0.05)；與甲潑尼龍組比較，肺纖方低、中劑量組肺泡炎及肺纖維化評分升高(P<0.05)，肺纖方高劑量組肺泡炎及肺纖維化評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。

表1 各組小鼠肺泡炎及肺纖維化評分比較

2.1.2 HE染色 ①A1對照組:肺組織結(jié)構(gòu)正常。②A2對照組:肺泡間隔明顯增厚,大量炎性細胞浸潤,重度纖維組織增生,可見大量成纖維細胞聚集,病變區(qū)肺泡結(jié)構(gòu)破壞紊亂,肺泡間隔變薄或斷裂。③A3甲潑尼龍組:肺泡間隔略增厚,少量纖維組織增生及炎性細胞浸潤,肺泡結(jié)構(gòu)基本正常。④A4肺纖方低劑量組:肺泡間隔明顯增厚,纖維組織增生明顯,可見較多炎性細胞浸潤及成纖維細胞聚集,部分肺泡結(jié)構(gòu)破壞,肺泡間隔變薄或斷裂。⑤A5肺纖方中劑量組:肺泡間隔輕-中度增厚,輕到中度度纖維組織增生,可見少量炎性細胞浸潤,部分肺泡結(jié)構(gòu)破壞，較低劑量組減輕。⑥A6肺纖方高劑量組:肺泡間隔輕微增厚,少量纖維組織增生及炎性細胞浸潤,肺組織形態(tài)接近正常(見圖1)。

2.1.3 Masson染色 ①B1對照組:除支氣管及血管壁偶有膠原沉積外,肺泡間隔無明顯膠原纖維增生。②B2對照組:肺泡間隔中可見大量膠原纖維增生。③B3甲潑尼龍組:肺泡間隔中可見少量膠原纖維增生。④B4肺纖方低劑量組:肺泡間隔中可見中等量-大量膠原纖維增生。⑤B5肺纖方中劑量組:肺泡間隔中可見少量-中等量膠原纖維增生。⑥B6肺纖方高劑量組:肺泡間隔中可見少量膠原纖維增生(見圖2)。

2.2 肺組織羥脯氨酸(Hyp)含量

實驗結(jié)果顯示，隨著肺纖方劑量的增加，小鼠Hyp含量隨之降低，但高劑量組Hyp仍明顯高于對照組(P<0.05)，低劑量組Hyp含量明顯低于模型組(P<0.05)(見表2)。

表2 各組肺組織Hyp含量比較

2.3 對NIH3T3細胞的存活率影響

MTS檢測實驗結(jié)果顯示：藥物干預(yù)4 h時，肺纖方各劑量組細胞存活率與對照組相比，差異無顯著統(tǒng)計學(xué)意義；干預(yù)24 h及以上，肺纖方各劑量組與對照組相比，能明顯抑制細胞的存活率，且隨時間延長(72 h)，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但肺纖方不同濃度的抑制作用差異不明顯。實驗結(jié)果表明肺纖方具有抑制NIH3T3細胞的增殖能力，且呈時間依賴，但無濃度依賴性(見表3及圖3)。

圖3 MTS法檢測肺纖方對細胞存活率的影響

2.4 平板克隆形成實驗

NIH3T3成纖維細胞經(jīng)1周培養(yǎng)形成類圓形細胞集落，后逐漸增大。培養(yǎng)2周結(jié)果：與對照組(C1)相比，肺纖方低劑量組(C2)、中劑量組(C3)、高劑量組(C4)NIH3T3成纖維細胞克隆數(shù)均明顯降低(P<0.05)，但隨著肺纖方濃度劑量增加，細胞克隆數(shù)略有增加，證實肺纖方可抑制NIH3T3成纖維細胞的增殖能力，但各藥物濃度劑量組比較差異不明顯(P>0.05)(見圖4)。

圖4 平板克隆形成實驗結(jié)果

2.5 Western blot法測定細胞CyclinD1、MMP2、TIMP1蛋白的表達水平的影響

與正常對照組相比，肺纖方各組對CyclinD1和MMP2蛋白的表達均有下調(diào)，且一定范圍內(nèi)隨藥物濃度增加，CyclinD1蛋白表達下調(diào)越明顯；同時肺纖方各組TIMP1蛋白的表達有所增加，但是差異不顯著；而肺纖方各組GAPDH條帶灰度比值無明顯差異(見圖5)。

圖5 Western blot法測定細胞CyclinD1、MMP2、TIMP1蛋白的表達水平的影響

3 討論

IPF是一種病因不明、以UIP為特征的一種慢性間質(zhì)性肺疾病,IPF患者從診斷開始中位生存期僅 2～3 年[1]。在目前尚缺乏有效治療藥物情況下，中醫(yī)藥在改善患者癥狀、提高患者生活質(zhì)量、減輕患者病情等方面取得一定的療效，并開展了大量的實驗研究[3]。筆者2014年入選廣東省首批名中醫(yī)師承項目學(xué)術(shù)繼承人，跟師“龍江醫(yī)派”學(xué)術(shù)傳承人曲敬來教授，通過長期跟師學(xué)習，總結(jié)曲教授對肺纖維化臨床經(jīng)驗，認為肺纖維化中醫(yī)屬“肺痹、肺痿”范疇，其基本病機為“氣虛痰結(jié)絡(luò)瘀”，為本虛標實、虛實夾雜之證，臨床突出“虛、痰、瘀”等病理特點[7]。治療上強調(diào)益氣滌痰逐瘀為基本大法，結(jié)合“怪病多痰”、“百病多由痰作祟”、“久病從痰論治”、“胸中血府血瘀之證”的觀點，以血府逐瘀湯合滌痰湯、補中益氣湯組成肺纖方主方，進行辨證論治，取得一定療效。

肺纖維化是多種肺部疾病的共同結(jié)局，其特征是的成纖維細胞增殖活化和細胞外基質(zhì)(ECM)過度沉積，導(dǎo)致正常肺泡結(jié)構(gòu)破壞[8-10]。成纖維細胞作為細胞外基質(zhì)(ECM)合成及分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)、基金蛋白酶組織抑制因子(TIMPs)的主要細胞，其活化、增殖以及通過釋放介質(zhì)及產(chǎn)生細胞外基質(zhì)(ECM)在肺纖維化發(fā)病機制中起決定性作用[11]?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)具有促進細胞外基質(zhì)降解的作用，而TIMPs可抑制MMPs活性。研究表明, MMPs與TIMPs的過度高表達以及 MMPs/TIMPs的比例失衡是纖維化發(fā)生及發(fā)展的關(guān)鍵[12], 其中以 MMP2/TIMP1為代表。生理情況下，肺內(nèi)膠原蛋白的合成和降解處于平衡狀態(tài)。肺纖維化過程中，成纖維細胞能夠分泌MMPs，MMPs/TIMPs比例升高，其中MMP2/MMP9可降解肺泡壁ECM和基底膜中的蛋白，使更多的成纖維細胞、炎癥細胞移行侵入肺間質(zhì)并增殖，分泌更多的MMPs，MMPs可以促進異常上皮細胞的遷移和其他異常的修復(fù)過程，而且可以增加肺水平或促纖維化介質(zhì)活動或減少肺抗纖維化介質(zhì)水平，加重纖維化[13-14]。

在細胞增殖周期中，有兩個關(guān)鍵性限制點(G1/S期和G2/M期限制點)，CyclinD1作為G1期中兩個關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白之一[15]，在細胞周期進程中起重要的正性調(diào)節(jié)作用，CyclniD1表達增加可推動細胞周期跨越R點，由S期向G1期轉(zhuǎn)換，推動細胞的有絲分裂，促進細胞增殖[16]。有研究指出IPF患者體內(nèi)RhoA介導(dǎo)的成纖維細胞CyclinD1表達增加，進而導(dǎo)致成纖維細胞數(shù)目的增殖[17]。因此，通過針對抑制成纖維細胞病態(tài)增殖的研究對于IPF的治療有一定的研究價值。

本研究應(yīng)用前期造博萊霉素二次造模建立穩(wěn)定肺纖維化小鼠模型，給予不同劑量肺纖方煎劑干預(yù)，對肺組織切片進行肺泡炎及肺纖維化評分，并測定肺組織羥脯氨酸含量，評價肺纖方對小鼠模型肺泡炎及纖維化的影響。研究結(jié)果顯示：采用肺纖方干預(yù)的小鼠評分和羥脯氨酸含量均明顯低于模型組(P<0.05)，且上述指標值隨著肺纖方劑量的增加而降低，HE染色和Masson染色結(jié)果亦顯示采用肺纖方干預(yù)小鼠肺組織肺泡炎和纖維化程度均有明顯改善，但與強的松組無顯著統(tǒng)計學(xué)差異，結(jié)果提示肺纖方對于抑制小鼠肺纖維化程度有一定作用，且具有一定的濃度依賴性。同時本研究對小鼠NIH3T3成纖維細胞培養(yǎng)并進行平板克隆形成實驗和Western blot測定細胞蛋白的表達水平，結(jié)果顯示，肺纖方可明顯抑制NIH3T3成纖維細胞增殖，對CyclinD1和MMP2蛋白的表達均有下調(diào)，且一定范圍內(nèi)隨藥物濃度增加，CyclinD1蛋白表達下調(diào)越明顯；同時提高TIMP1蛋白的表達，但是各組差異不顯著；而肺纖方各組GAPDH條帶灰度比值無明顯差異。結(jié)合上述實驗研究結(jié)果表明，肺纖方能有效抑制NIH3T3細胞的增殖，對于抑制CyclinD1蛋白的表達和MMP2/TIMP1產(chǎn)生一定逆調(diào)節(jié)作用，一定程度反向調(diào)節(jié)MMP2/TIMP1比率，促進失衡MMPs/TIMPs比例的恢復(fù)。進一步說明肺纖方可能參與矯正MMPs/TIMPs比例，并阻斷成纖維細胞持續(xù)遷移激活狀態(tài)的作用機制。

綜上所述，中藥復(fù)方肺纖方能夠有效抑制博來霉素致小鼠肺泡炎和肺纖維化，降低其纖維化程度；同時可抑制NIH3T3細胞的增殖和矯正失衡MMPs/TIMPs比例，提示肺纖方可能通過抑制成纖維細胞持續(xù)遷移激活狀態(tài)，從而改善肺纖維化，為進一步研究中藥復(fù)方治療肺纖維化的作用機制提供理論和實驗依據(jù)。