右美托咪定抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞Parthanatos死亡

谷 宇 堯永華 陸殿宇

急性腎損傷(Acute kidney injury, AKI)是一種常見的臨床并發(fā)癥，以腎小球濾過率突然下降為主要特征。近年來盡管腎臟替代療法等支持治療取得了較大進(jìn)步，AKI 發(fā)生5年后死亡率仍高達(dá)50%[1]。腎缺血再灌注損傷(Renal ischemia reperfusion injury, RIRI)是引發(fā)AKI的主要原因，可見于許多臨床情況下，如腎移植、部分腎切除、心臟手術(shù)、敗血癥等[2]。既往多項研究指出，RIRI過程中腎小管上皮細(xì)胞主要發(fā)生凋亡和壞死，然而采取相應(yīng)的干預(yù)性治療措施并不能有效降低患者的發(fā)病率及死亡率[3]。因此，深入探討RIRI的致病機(jī)制，尋找有效的防治方法仍是臨床亟待解決的難題。

新近研究發(fā)現(xiàn)DNA損傷參與多種疾病的細(xì)胞損傷和死亡過程，尤其在缺血再灌注損傷(Ischemia reperfusion injury, IRI)相關(guān)的細(xì)胞死亡中起重要作用[4-5]。輕度細(xì)胞DNA損傷可以通過活化多聚ADP 核糖聚合酶-1(PolyADP-ribose polymerase-1, PARP-1)完全修復(fù)；較嚴(yán)重DNA損傷會引發(fā)細(xì)胞凋亡；而廣泛嚴(yán)重的DNA損傷會引發(fā)一種獨(dú)特的細(xì)胞死亡形式——PARP-1依賴性細(xì)胞死亡(Parthanatos)。最近有研究提示Parthanatos可能是IRI細(xì)胞死亡的重要形式。本研究旨在探討Parthanatos與RIRI病理過程之間的關(guān)系，為進(jìn)一步尋找有效藥物干預(yù)Parthanatos死亡并防治AKI打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

正常人腎小管上皮細(xì)胞HK-2(中國典型培養(yǎng)物保藏中心)；胎牛血清，胰蛋白酶(Gibco)；右美托咪定(Dexmedetomidine, Dex, 江蘇恒瑞)；CCK-8檢測試劑盒(Dojindo)；LDH試劑盒(Roche)；活性氧(reactive oxygen species, ROS)檢測試劑(Sigma-Aldrich)；Trizol試劑(Invitrogen)；ReverTra Ace qPCR RT Master Mix和SYBR? Green Realtime PCR Master Mix(TOYOBO)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及H/R處理 我們采用人腎小管上皮細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(Hypoxia/Reoxygenation, H/R)模型模擬RIRI。細(xì)胞培養(yǎng)箱(溫度37 ℃, 濕度90%, 95%空氣+5%CO2)內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。HK-2細(xì)胞培養(yǎng)至融合約80%，進(jìn)行H/R處理，細(xì)胞更換為無糖無血清培養(yǎng)基，放入濕潤的缺氧培養(yǎng)箱(Galaxy 48R; Eppendorf, Hamburg, 德國)進(jìn)行低氧(95% N2+5% CO2)處理24 h，隨后取出放入常氧環(huán)境進(jìn)行復(fù)氧處理4 h，即缺氧24 h復(fù)氧4 h(H/R)處理。

1.2.2 實(shí)驗分組及藥物處理 細(xì)胞用隨機(jī)數(shù)字表分為4組：對照組(Control)組、Dex組、H/R組、Dex+H/R組，每組n=5。Dex組和Dex+H/R組預(yù)先用含1 nmol/L右美托咪定的培養(yǎng)基處理1 h，隨后Dex組更換為普通培養(yǎng)基放回常氧培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，Dex+H/R組則更換為無糖無血清培養(yǎng)基放入低氧培養(yǎng)箱進(jìn)行H/R處理。

1.2.3 細(xì)胞活力和LDH釋放檢測 將HK-2細(xì)胞接種于96孔板，細(xì)胞密度約5 000個/孔。不同處理完成后，應(yīng)用細(xì)胞計數(shù)(Cell Counting Kit-8, CCK-8)試劑盒和乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase, LDH)試劑盒，按照試劑盒說明書進(jìn)行具體操作，使用酶標(biāo)儀檢測檢測細(xì)胞活力以及LDH釋放情況。

1.2.4 檢測細(xì)胞內(nèi)ROS含量 細(xì)胞接種于24孔板，各組處理完畢后，應(yīng)用2,7-二氯熒光素二乙酸脂(2,7-dichlorofluorescein diacetate, DCFH-DA)檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

1.2.5 實(shí)時定量PCR(qRCR) 應(yīng)用Trizol試劑(Invitrogen)提取細(xì)胞中總RNA，NanoDrop-1000分光光度計檢測RNA量和濃度，ReverTra Ace qPCR RT Master Mix(TOYOBO)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，SYBR? Green Realtime PCR Master Mix(TOYOBO)以及Roche LightCycler 1.1行qRCR定量分析PARP-1mRNA和凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis Inducing Factor, AIF)mRNA變化，使用GAPDH作為管家基因。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，組間比較使用單因素方差分析，P<0.05表明差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 實(shí)驗使用的引物序列

2 結(jié)果

2.1 Dex能明顯減輕H/R處理導(dǎo)致的HK-2細(xì)胞損傷

與Control組相比，H/R處理能明顯降低HK-2細(xì)胞的活力(P<0.05)，而應(yīng)用1 nmol/L Dex預(yù)處理1 h后再行H/R處理，能明顯提升HK-2細(xì)胞的活力(P<0.05)，Dex本身對HK-2細(xì)胞的活力無明顯作用。見圖1。

注：*與對照組比較有顯著差異，P<0.05；#與H/R組比較有顯著統(tǒng)計學(xué)差異，P<0.05

與Control組相比，H/R處理能明顯增加細(xì)胞LDH的釋放(P<0.05)，而應(yīng)用1 nmol/L Dex預(yù)處理1 h后再行H/R處理，能明顯降低HK-2細(xì)胞LDH的釋放(P<0.05)，Dex本身對HK-2細(xì)胞LDH的釋放無明顯作用。見圖2。

注：*與對照組比較有顯著差異，P<0.05；#與H/R組比較有顯著統(tǒng)計學(xué)差異，P<0.05

2.2 Dex能明顯抑制H/R處理HK-2細(xì)胞內(nèi)ROS含量的增多

與Control組相比，H/R處理能明顯增加細(xì)胞內(nèi)ROS的含量(P<0.05)，而應(yīng)用1 nmol/L Dex預(yù)處理能明顯抑制H/R處理HK-2細(xì)胞內(nèi)ROS含量的增加(P<0.05)，Dex本身對HK-2細(xì)胞ROS的含量無明顯作用。見圖3。

注：*與對照組比較有顯著差異，P<0.05；#與H/R組比較有顯著統(tǒng)計學(xué)差異,P<0.05

2.3 Dex能明顯抑制H/R處理HK-2細(xì)胞內(nèi)PARP-1mRNA和AIF mRNA表達(dá)

與Control組相比，H/R處理能明顯提升細(xì)胞內(nèi)PARP-1 mRNA和AIF mRNA表達(dá)(P<0.05)，而應(yīng)用1 nmol/L Dex預(yù)處理能明顯抑制H/R處理HK-2細(xì)胞內(nèi)PARP-1 mRNA和AIF mRNA表達(dá)(P<0.05)，Dex本身對HK-2細(xì)胞PARP-1 mRNA和AIF mRNA表達(dá)無明顯作用。見圖4。

注：*與對照組比較有顯著差異，P<0.05；#與H/R組比較有顯著統(tǒng)計學(xué)差異，P<0.05

3 討論

AKI的病理學(xué)特征主要是腎小管上皮細(xì)胞損傷和死亡[6]。既往研究認(rèn)為壞死和凋亡是AKI腎細(xì)胞最重要的死亡方式[7]。RIRI不同階段細(xì)胞死亡的主要形式不同，短暫腎缺血導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，而長期持續(xù)的腎缺血則造成細(xì)胞的壞死[8]。然而針對壞死和凋亡的干預(yù)治療并未有效改善RIRI患者的預(yù)后。近年來研究發(fā)現(xiàn)，DNA損傷與多種疾病的細(xì)胞損傷和死亡相關(guān)，尤其在器官缺血性疾病中似乎扮演著重要的角色[4-5]。

DNA儲存著生命體賴以生存和繁衍的遺傳信息，其完整性的維系對個體生存和物種穩(wěn)定起著至關(guān)重要的作用。然而，在生命進(jìn)程中DNA難免會受到多種外源性(如紫外線輻射和電離輻射)以及內(nèi)源性(如ROS)損傷因素的攻擊，進(jìn)而引起DNA損傷[9-11]。據(jù)報道，ROS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激是引起細(xì)胞DNA損傷的重要因素[12]。我們的前期研究已經(jīng)證實(shí)RIRI過程中會產(chǎn)生大量的ROS[13]。因此我們推測RIRI中發(fā)生的嚴(yán)重氧化應(yīng)激可能造成腎細(xì)胞DNA損傷，甚至直接導(dǎo)致細(xì)胞死亡。PARP-1是一種能感應(yīng)DNA損傷的核蛋白酶。PARP-1在細(xì)胞DNA氧化損傷中具有雙向作用：促進(jìn)DNA損傷修復(fù)與細(xì)胞存活以及誘導(dǎo)Parthanatos死亡。過多ROS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激會造成持續(xù)的DNA損傷，導(dǎo)致PARP-1過度活化，消耗細(xì)胞內(nèi)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和ATP，引起能量耗竭及線粒體功能障礙，最終引發(fā)AIF介導(dǎo)的Parthanatos死亡[14]。本研究建立與動物RIRI模型相對應(yīng)的細(xì)胞H/R模型，排除了神經(jīng)體液的影響，直接探討其對細(xì)胞DNA損傷和細(xì)胞Parthanatos死亡的影響。研究發(fā)現(xiàn)，H/R能明顯誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS的過量產(chǎn)生，同時Parthanatos死亡關(guān)鍵基因PARP-1和AIF的表達(dá)明顯也增高，這與細(xì)胞活力的降低以及LDH釋放的增加具有明顯的同步性。提示Parthanatos死亡可能與H/R導(dǎo)致的腎細(xì)胞活力下降以及細(xì)胞死亡關(guān)系密切。

Dex是一種高選擇性的α2腎上腺素能受體(α2-AR)激動劑，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮和抗交感神經(jīng)的活性，廣泛應(yīng)用于臨床麻醉及重癥醫(yī)學(xué)[15-17]。近年來，Dex在抑制氧化應(yīng)激和全身炎癥反應(yīng)、降低細(xì)胞死亡等方面的作用受到越來越多的關(guān)注[18-22]。本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用Dex能明顯抑制H/R腎細(xì)胞內(nèi)ROS含量的增加，同時還顯著降低H/R腎細(xì)胞內(nèi)PARP-1和AIF的表達(dá)，提示Dex可能通過減輕氧化應(yīng)激，進(jìn)而降低Parthanatos死亡的發(fā)生。這與Dex預(yù)處理可明顯增加H/R腎細(xì)胞活力、降低腎細(xì)胞LDH釋放的結(jié)果相吻合。

綜上所述，我們認(rèn)為腎細(xì)胞缺氧復(fù)氧過程中Parthanatos死亡可能具有重要作用，而Dex可能通過抑制ROS的產(chǎn)生降低Parthanatos死亡的發(fā)生。