固相萃取-超高效液相色譜法同時測定豬肉中22 種磺胺類藥物殘留

王宏宇，武云龍，趙棟皓，孫曉亮，李木子，曹旭敏，宋翠平，趙思俊，李 存

（1.天津農(nóng)學院動物科學與動物醫(yī)學院，天津 300384；2.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032；3.山西農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，山西晉中 030801）

磺胺類藥物（sulfonamides，SAs）是一類具有對氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的藥物總稱，具有抗菌譜廣、高效、低毒、價格低廉等特點，在獸醫(yī)臨床應(yīng)用十分廣泛。藥物濫用、誤用及不遵守休藥期規(guī)定，會造成動物源食品中藥物殘留超標，既危害人類健康，還會誘導細菌產(chǎn)生耐藥性。我國和歐盟均已制訂了動物產(chǎn)品中的多種SAs 最高殘留限量（MRL），其中我國規(guī)定SAs 總量不得超過0.1 mg/kg，奶中磺胺二甲基嘧啶不得超過0.025 mg/kg[1]。因此，對SAs 殘留進行準確快速檢測有著重要的食品安全意義[2]。

隨著藥物殘留檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，SAs 的前處理和檢測方法越來越多。其中：前處理方法除了傳統(tǒng)的液液萃取外，近年來還出現(xiàn)了許多新方法，如固相萃?。⊿PE）法、超聲輔助分散液液微萃取法、磁性多壁碳納米管法、基質(zhì)固相分散法、QuEChERS 法等[3]；檢測方法主要有高效液相色譜二極管陣列檢測法（HPLC-PDA）、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）、酶聯(lián)免疫法等[2，4]。目前，我國已建立了多個檢測標準用于豬肉中SAs 殘留檢測?！缎笄萑庵惺N磺胺類藥物殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（GB/T 20759—2006）中標定了牛肉、羊肉、豬肉、雞肉和兔肉中16 種SAs 殘留量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法，《水產(chǎn)品中17 種磺胺類及15 種喹諾酮類藥物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（農(nóng)業(yè)部1077 號公告-1-2008）規(guī)定了17 種SAs 殘留量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。但這些方法一次檢測的藥物種類較少，成本相對較高，且基質(zhì)效應(yīng)的存在會影響檢測結(jié)果的準確度和靈敏度[5]。本研究擬采用固相萃取-超高效液相色譜法（SPE-UPLC-PDA），建立豬肉中22 種SAs 的一次性殘留檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器設(shè)備 AcquityTMUPLC-PDA 超高效液相色譜儀-二極管陣列檢測器，美國Waters公司；氮吹儀，美國Organomation 公司；漩渦混合儀，美國Talboys 公司；Milli-Q 純水儀，德國Millipore 公司；5804R 高速冷凍離心機，德國Eppendorf 公司；固相萃取裝置、MCX 固相萃取柱（60 mg、3 mL），德國CNW 公司。

1.1.2 主要藥品試劑 磺胺甲惡唑（sulfamethoxazole，純 度＞94%）、磺胺胍（sulfaguanidine，純度＞98%）、磺胺醋酰（sulfacetamide，純度＞97%）、磺胺吡啶（sulfapyridine，純度＞98%）、磺胺嘧啶（sulfadiazine，純度＞99%）、磺胺二甲異嘧啶（sulfisomidine，純度＞98%）、磺胺二甲惡唑（sulfamoxole，純度＞98.5%）、磺胺二甲異惡唑（sulfisoxazole，純度＞98%）、磺胺曲沙唑（sulfatroxazole，純度＞99%）、磺胺對甲氧嘧啶（sulfameter，純度＞95%）、磺胺間甲氧嘧啶（sulfamonomethoxine，純度＞96%）、磺胺甲氧吡嗪（sulfalen，純度＞97%）磺胺間二甲氧嘧啶（sulfamethazine，純度＞99%）、磺胺苯（sulfabenz，純度＞96%）、磺胺苯吡唑（sulfaphenazole，純度＞98%）、磺胺苯酰（sulfabenzamide，純度＞97%），均購自德國Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司。磺胺（sulfonamide，純度＞99%）、磺胺喹噁啉（sulfaquinoxaline，純度＞99%）、磺胺鄰二甲氧嘧啶（sulfadoxine，純度＞98%）、磺胺氯噠嗪（sulfachloropyridazine，純度＞97%），均購自Toronto Research Chemicals INC（加拿大）?；前范奏奏ぃ╯ulfamethazine，純度＞98%）、磺胺噻唑（sulfathiazole，純度＞99%）、磺胺氯吡嗪（sulfachloropyrazine，純度＞98%），均購自WITEGA Laboratorien BerlinAdlershof GmbH（加拿大）。甲醇、乙腈均為色譜純，德國Merck 公司；甲酸、甲酸銨均為色譜純，德國CNW 公司；乙酸、氨水均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；試驗用水為超純水，由Milli-Q 純水儀制得。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液配置 分別準確稱取22 種SAs標準品于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制質(zhì)量濃度為100 mg/L 的標準儲備液，于-20 ℃避光保存；分別移取適量標準儲備液，配制1 mg/L 的22 種SAs 混合標準儲備液；分別移取適量的混合標準儲備液，根據(jù)需要用甲醇逐級稀釋為適當濃度的混合標準工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 樣品前處理 準確量取2 g 豬肉于50 mL具塞離心管中，加入8 mL 3%乙酸乙腈以及5 g 均質(zhì)子，渦旋混勻，8 000 r/min 離心7 min，將上清移至新離心管，重復提取1 次，合并2 次上清，待凈化。上清液通過經(jīng)3 mL 甲醇、3 mL 水以及3 mL 3%乙酸乙腈活化的MCX 柱，分別用3 mL 水和3 mL 甲醇淋洗，用真空泵抽干后，以3 mL 5%氨化甲醇洗脫，45 ℃水浴條件下N2吹至近干，用1 mL 0.1%甲酸-乙腈（9:1，V/V）溶液復溶，渦動30 s 后，經(jīng)0.22 μm 針孔式濾膜過濾，UPLCPDA 檢測。

1.2.3 色譜條件 色譜柱：UPLC CSH Fluorophenyl（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；流動相A（簡稱A）：含有10 mmol/L 甲酸銨的0.1%甲酸水；流動相B（簡稱B）：乙腈。流速0.3 mL/min，柱溫35 ℃，二極管陣列檢測器波長270 nm，進樣量10 μL。梯度洗脫程序：0～2.0 min，13%B；＞2.0～3.5 min，13%～15%B；＞3.5～4.5 min，15%B；＞4.5～6.5 min，15%～35%B；＞6.5～8.8 min，35%B；＞8.8～9.0 min，35%～95%B；＞9.0～10.0 min，95%B；＞10.0～10.2 min，95%～13%B；＞10.2～12.0 min，13%B。

1.3 方法評價

1.3.1 試劑標準曲線繪制 配制質(zhì)量濃度分別為2.5、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、250.0 μg/L的試劑標準溶液。經(jīng)UPLC-PDA 進樣分析，以質(zhì)量濃度（μg/L）為橫坐標（X），峰面積（Y）為縱坐標，繪制試劑標準曲線。

1.3.2 檢測限和定量限測定 準確量取2 g 空白樣品，向其中添加不同質(zhì)量濃度的混合標準工作液，按照1.2.2前處理方法對樣品進行處理后上機檢測。以10 倍信噪比（S/N=10）對應(yīng)的樣品濃度作為方法的定量限（limit of quantification，LOQ），以3倍信噪比（S/N=3）對應(yīng)的樣品濃度作為方法的檢測限（limit of detection，LOD）。

1.3.3 添加回收率和精密度測定 準確量取2 g空白樣品，進行3 個水平（1、5、10 倍LOQ）的加標回收試驗；按照1.2.2 前處理方法對樣品進行處理后上機檢測。每個水平做6 個平行，進行3 次批間重復；使用標準曲線進行校正，測定目標藥物濃度，計算回收率、批內(nèi)相對標準偏差和批間相對標準偏差。

1.3.4 實際樣品檢測 采用本試驗建立的方法，對從山東省采集的18 份豬肉樣品進行檢測。18份樣本經(jīng)過3%乙酸乙腈提取、MCX 柱凈化、UPLC-PDA 檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件選擇

由于同分異構(gòu)體藥物分離受限，故在流動相中加入一定量甲酸銨，使其能全部分離所有藥物[6]。

磺胺類藥物屬于兩性化合物，因此采用酸性流動相可使分離效果最佳。試驗采用甲酸銨-甲酸水溶液-乙腈體系作為流動相，用0.1%甲酸-乙腈作為流動相。雖色譜峰尖銳、對稱，但不能分離所有藥物，故在甲酸溶液中加入適量甲酸銨進行考察。結(jié)果顯示，使用含有10 mmol/L 甲酸銨的0.1%甲酸水-乙腈作為流動相，能分離出所有藥物且峰形較好。為了將本試驗中的藥物在盡可能短的時間內(nèi)有效分離，本研究采用UPLC CSH Fluoro-phenyl 色譜柱分離所有藥物，采用PDA 波長270 nm，可使SAs 檢測獲得較高的靈敏度[7]。SAs 標準溶液色譜圖、空白樣品色譜圖和實際樣品加標色譜圖分別見圖1-A、圖1-B、圖1-C。

圖1 標準溶液、空白樣品和實際樣品加標色譜圖

2.2 提取液優(yōu)化

提取動物產(chǎn)品中的SAs 通常采用乙腈、乙酸乙酯等有機溶劑或磷酸鹽水溶液進行[8-9]。為了獲得滿意的回收率和較好的選擇性，本試驗選擇有機溶劑和水溶液作為提取液進行優(yōu)化比較。

2.2.1 有機溶劑 樣品基質(zhì)中的蛋白質(zhì)等大分子雜質(zhì)會因共萃取效應(yīng)而被提取出來。由于蛋白質(zhì)的最佳吸收波長為280 nm，與SAs 的檢測波長較為相近，因此在紫外檢測時容易影響SAs 檢測的靈敏度和選擇性。相關(guān)研究表明：乙腈可以沉淀牛奶等樣品中的蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)達到等電點沉淀[10]；而采用乙酸乙酯和甲醇進行提取，對組織樣本中目標化合物回收具有良好效果[11]。為此，本研究分別采用乙酸乙酯、甲醇和乙腈提取樣品，經(jīng)MCX柱凈化后，使用UPLC 檢測，統(tǒng)計目標藥物回收率。結(jié)果顯示：乙酸乙酯和甲醇不能完全從樣品中提取藥物，受基質(zhì)中的內(nèi)源物質(zhì)干擾較大，分離不佳，且由于溶劑性質(zhì)原因[12]，大量脂溶性雜質(zhì)溶于提取液中；而使用乙腈作為提取液時，除磺胺、磺胺醋酰外，回收率均高于80%。此外，還對乙腈的酸度進行優(yōu)化分析，通過向提取液中加入乙酸或氨水等調(diào)節(jié)溶液pH。以乙腈、氨化（1%、3%、5%）乙腈、乙酸（1%、3%、5%）乙腈分別提取樣本，比較不同提取液的提取效果。結(jié)果顯示：使用3%乙酸乙腈，可有效提取豬肉組織中的SAs，可獲得較好的回收率；增加乙酸使用量（5%），雖不影響藥物回收率，但會增加萃取中雜質(zhì)的干擾；而減少乙酸使用量（0、1%）時，可使SAs 回收率降低（＜80%）。

2.2.2 水溶液 本試驗對PBS 溶液的提取效果進行了優(yōu)化，分別對PBS 溶液的pH、濃度進行優(yōu)化分析。首先優(yōu)化PBS 提取液pH，分別使用pH3～6的PBS 溶液進行提取。結(jié)果顯示：使用PBS 溶液（pH5）時，可提取豬肉組織中的SAs，并獲得了較好的回收率。增加溶液pH（pH6）時，磺胺醋酰、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺二甲惡唑回收率降低（＜80%）；而降低溶液pH（pH3、pH4），雖不影響藥物回收率，但會增加萃取中雜質(zhì)的干擾，故選擇pH5 的PBS 溶液。此外，還對PBS 溶液濃度進行優(yōu)化分析，分別使用0.1、0.3、0.5、0.7、1.0 mol/L 的PBS 溶液（pH5）提取樣本。結(jié)果顯示：使用0.5 mol/L PBS（pH5）溶液，可提取豬肉組織中的SAs，并獲得了較好回收率；當PBS 溶液濃度過低時，磺胺、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺苯、磺胺對甲氧嘧啶的回收率小于80%；而提高PBS 溶液濃度，對目標藥物回收率沒有明顯影響。故選擇0.5 mol/L PBS（pH5）溶液作為最佳水溶液提取液。

2.2.3 兩種提取液對比 對最優(yōu)的有機溶劑提取液（3%乙酸乙腈）以及水溶液提取液（0.5 mol/L PBS，pH5）進行比較。分別使用兩種提取液提取樣本，經(jīng)MCX 柱凈化后，使用UPLC-PDA 檢測。結(jié)果顯示：以PBS 溶液、酸化乙腈作為提取液時，目標藥物回收率均較高。但在試驗過程中發(fā)現(xiàn)，以PBS 溶液作為提取液，在提取完成的待上樣液中，含有大量白色絮狀物，會堵塞SPE 柱，從而引起流速不穩(wěn)甚至出現(xiàn)流不動的現(xiàn)象，導致試驗結(jié)果平行性較差[13]。因此，本研究選擇3%乙酸乙腈作為豬肉樣品提取液。

2.3 凈化條件優(yōu)化

2.3.1 SPE 固相萃取柱選擇 本研究選取1#（CNW-HLB 柱）、2#（Oasis HLB 柱）、3#（CNW-MCX 柱）、4#（PCX 柱）進行比較。標準添加量為50 μg/kg，經(jīng)甲醇、水和上樣液活化的SPE 柱富集，用甲醇或5%氨化甲醇洗脫，比較各SPE 柱對目標藥物的富集效果。結(jié)果顯示，1～4#的富集比例分別為90%、85%、90%和83%。結(jié)果表明，4 種SPE 柱均可富集SAs，且CNW 公司生產(chǎn)的HLB 柱（1#）以及MCX 柱（3#），對目標藥物的富集效果較好。考慮到在試驗過程中，由于提取液為乙腈，只有在過HLB 柱前氮吹至近干，再使用復溶液復溶后，才可繼續(xù)進行凈化步驟，因而容易導致目標藥物損失[14]，且會浪費大量時間；而MCX 柱，由于其為陽離子交換柱，對pH 較為敏感，以3%乙酸乙腈作為提取液時，可以直接上樣。故選擇3#作為SPE 固相萃取柱。

2.3.2 洗脫液優(yōu)化 按參考文獻[15-16]，選擇4種洗脫液，1%氨化甲醇、3%氨化甲醇、5%氨化甲醇、7%氨化甲醇，各取3 mL 洗脫液過已富集的MCX 固相萃取柱，比較洗脫效果。結(jié)果顯示：5%和7%的氨化甲醇洗脫能力無明顯差異（＞95%），可完全將藥物從柱床中洗脫下來，1%氨化甲醇僅可洗脫下20%～40%，而3%氨化甲醇可洗脫下60%～80%，故選擇5%氨化甲醇作為洗脫溶液。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限以不同濃度的混合標準溶液進行測定，以質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），繪制試劑標準曲線。結(jié)果（表1）顯示：各藥物線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2＞0.999。LOQ 為2.5～10.0 μg/kg，LOD為1.0～4.0 μg/kg。

表1 22 種獸藥的保留時間、線性方程、相關(guān)系數(shù)和LOQ、LOD

2.4.2 準確度和精密度 22 種目標藥物回收率及批內(nèi)、批間相對標準偏差見表2。結(jié)果顯示，回收率為80.4%～96.6%，批內(nèi)相對標準偏差為1.1%～4.6%，批間相對標準偏差為2.5%～13.4%，可滿足國際上對獸藥殘留的檢測需求。

表2 22 種獸藥的加標回收率和相對標準偏差

2.5 相對于UPLC-MS/MS 的優(yōu)勢

在使用UPLC-MS/MS 法時，基質(zhì)效應(yīng)（matrix effects，ME）的存在會影響檢測結(jié)果的準確度和靈敏度[17]。經(jīng)前處理樣品中加入目標藥物，進行UPLC-MS/MS 檢測，繪制基質(zhì)匹配標準曲線，通過計算各藥物樣本溶液與濃度相同的標準溶液之比的平均值，計算目標藥物的基質(zhì)效應(yīng)[18]。結(jié)果顯示：目標藥物中有部分基質(zhì)效應(yīng)較強（ME ＜60%），包括磺胺對甲氧嘧啶、磺胺二甲基異嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶；部分基質(zhì)效應(yīng)很強（ME ＜40%），包括磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺苯。基質(zhì)效應(yīng)嚴重影響結(jié)果的準確度和靈敏度，且UPLC-MS/MS 成本較高，操作復雜。而本研究的UPLC-PDA 法不存在基質(zhì)效應(yīng)影響，在經(jīng)前處理后雜質(zhì)較少，且成本較低、操作簡便，結(jié)果準確性較高，重復性良好。

2.6 實際樣品檢測

利用本研究建立的方法對從山東省采集的18份豬肉樣品進行測定，結(jié)果未有SAs 檢出。

3 小結(jié)

本研究建立的豬肉中22 種SAs 的SPE-UPLCPDA 檢測方法靈敏度高、重復性好、成本低廉，且操作簡單、快速，可以用于檢測豬肉樣品中的SAs 殘留檢測。