新型免疫佐劑碳納米管的研究進(jìn)展

彭何濤，李木子，宋翠平，趙肖璟，趙思俊

（1.寧夏大學(xué)，寧夏銀川 750021；2.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

免疫佐劑（簡(jiǎn)稱(chēng)佐劑）能非特異性增強(qiáng)或改變機(jī)體對(duì)抗原的特異性免疫應(yīng)答，目前常見(jiàn)的有礦物質(zhì)佐劑、油佐劑、微生物佐劑、中草藥佐劑、細(xì)胞因子佐劑等[1]。人醫(yī)臨床常見(jiàn)MF59和AS系列油佐劑，獸醫(yī)臨床常見(jiàn)鋁膠佐劑、細(xì)胞因子佐劑和中草藥佐劑等[2]。上述傳統(tǒng)佐劑已被廣泛應(yīng)用于臨床，并取得了較好的效果，但仍存在不良反應(yīng)強(qiáng)等問(wèn)題。因此，開(kāi)展新型免疫佐劑研究對(duì)于提高機(jī)體免疫反應(yīng)，獲得較高的抗體水平，同時(shí)降低毒副作用具有重要意義。近年來(lái)，新型的納米氫氧化鋁、納米磷酸鈣、納米金、殼聚糖、脂質(zhì)體等佐劑被廣泛關(guān)注[3-5]。納米佐劑具有常規(guī)佐劑不可比擬的優(yōu)勢(shì)[6-7]：納米粒子表面經(jīng)修飾后，可成功引入具有靶向性的配體或靶向到特定細(xì)胞的其他成份，使攜帶的免疫原有效運(yùn)輸?shù)较鄳?yīng)的免疫細(xì)胞；納米佐劑可提高免疫原穩(wěn)定性，減少免疫原用量，延長(zhǎng)作用時(shí)間，且自身不具備免疫原性。因此納米佐劑是目前較為理想的免疫佐劑之一。

納米材料與傳統(tǒng)宏觀材料相比，具有較為特殊的物理化學(xué)表征，因而在生物醫(yī)藥、航空航天、資源環(huán)境等領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用價(jià)值[8-9]。碳納米管作為一類(lèi)重要的新型納米材料，具有最簡(jiǎn)單的化學(xué)組成和原子結(jié)合形態(tài)，其尺度、結(jié)構(gòu)、拓?fù)鋵W(xué)因素以及和碳原子相結(jié)合的特性賦予了碳納米管極為獨(dú)特的性能，因而在力學(xué)、電學(xué)、磁學(xué)、光學(xué)、儲(chǔ)氫、熱學(xué)等方面具有優(yōu)異的性能，成為近些年備受關(guān)注的納米材料之一[6]。碳納米管可以通過(guò)物理吸附或化學(xué)耦聯(lián)等途徑與多種物質(zhì)連接，因而成為多種藥物、基因、生物探針?lè)肿拥男滦洼d體[10]，可發(fā)揮良好的生物學(xué)效應(yīng)。其中，碳納米管可與具有免疫原性的物質(zhì)相連接，直接進(jìn)入吞噬細(xì)胞或網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞[7]，誘發(fā)機(jī)體細(xì)胞免疫或體液免疫應(yīng)答，產(chǎn)生特異性抗體，且碳納米管本身不具有免疫原性[11]，因此可起到免疫佐劑作用。該效應(yīng)的發(fā)現(xiàn)，引起科研工作者的興趣并開(kāi)展了深入研究。本文從碳納米管的基本性質(zhì)、結(jié)構(gòu)修飾、免疫機(jī)理及實(shí)際應(yīng)用等幾方面綜述了其發(fā)揮免疫佐劑特性的研究進(jìn)展。

1 碳納米管基本性質(zhì)

碳納米管是日本電鏡專(zhuān)家Sumio Iijima于1991年通過(guò)高分辨率分析電鏡，從電弧法生產(chǎn)的碳纖維中發(fā)現(xiàn)的一種新型碳晶體[12]。它由含有六邊形網(wǎng)格狀的石墨片層卷曲而成，形成無(wú)縫納米管狀晶體（圖1）。根據(jù)其管壁層數(shù)可將其分為單壁碳納米管（single-walled carbon nanotube，SWCNT）和多壁碳納米管（multi-walled carbon nanotube，MWCNT）。SWCNT由單層圓柱形石墨層構(gòu)成，直徑一般為0.4～2.5 nm，具有柔性和高度均一性特點(diǎn)；MWCNT根據(jù)制備條件不同而異，管壁層數(shù)從2～50層不等，直徑最大可達(dá)100 nm。碳納米管長(zhǎng)度可在納米至數(shù)百微米之間變化[13]。碳納米管具有比表面積高[14]、化學(xué)穩(wěn)定性好、非特異性吸附能力強(qiáng)[15]、可穿過(guò)生物膜但不破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)等多種特性[16-17]。科研工作者利用這些優(yōu)異的性能，在生物傳感器、藥物載體、腫瘤治療等生物學(xué)領(lǐng)域開(kāi)展了積極的探索和研究。研究發(fā)現(xiàn)，碳納米管攜帶免疫原進(jìn)入機(jī)體可激活補(bǔ)體系統(tǒng)[15]，促進(jìn)吞噬細(xì)胞吞噬，增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答及提高特異性抗體水平[18-19]，這為免疫佐劑研發(fā)提供了新思路，從而引起了關(guān)注。

圖1 碳納米管結(jié)構(gòu)示意圖[13]

2 作為免疫佐劑的優(yōu)勢(shì)

碳納米管結(jié)構(gòu)中空多孔，又具有極高的比表面積，可以非特異性吸附多種藥物、基因、蛋白質(zhì)等物質(zhì)[15，20]，特別是多壁碳納米管在形成時(shí)，因管壁上通常布滿(mǎn)小洞樣的缺陷，層與層之間很容易形成陷阱中心而容納更多的生物活性分子[14]。體外研究[21]發(fā)現(xiàn)，碳納米管可與血漿中的多種蛋白發(fā)生非特異性吸附，且吸附過(guò)程不可逆。通過(guò)非共價(jià)鍵吸附蛋白等生物大分子于碳納米管表面或管腔內(nèi)[22-23]，也可提高碳納米管的溶解性和生物相容性。這些方法可產(chǎn)生較為穩(wěn)定的碳納米管-免疫原復(fù)合物，為進(jìn)入機(jī)體后發(fā)揮免疫佐劑作用提供了可靠保證。

然而，碳納米管自身具有很強(qiáng)的疏水作用，難以溶于水和有機(jī)溶劑，在溶液中常以團(tuán)聚形式存在，因而降低了其比表面積利用率，影響其吸附各類(lèi)生物分子的能力[24]。研究者在其表面進(jìn)行化學(xué)修飾，連接了數(shù)量不等的各類(lèi)化學(xué)基團(tuán)[25-27]，這樣可以很好地改善碳納米管表面特性，增強(qiáng)其水溶性和組織相容性，更重要的是通過(guò)化學(xué)修飾可定向引入免疫原分子，形成穩(wěn)定的免疫原-碳納米管復(fù)合物，并突出免疫原的特征位點(diǎn)，更有利于獲得特異性抗體。Parra等[28]利用羧基化、酸堿中和及氧化還原反應(yīng)，將牛血清白蛋白-嘧菌酯半抗原（BSA-azoxystrobin）連接至多壁和單壁碳納米管上，成功制備了針對(duì)嘧菌酯半抗原的免疫復(fù)合物，獲得了良好的免疫效果。除化學(xué)修飾外，依靠物理修飾，如在溶液中添加聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP），十二烷基硫酸鈉（SDS）、TritonX-100等化學(xué)試劑[29]，也可增強(qiáng)碳納米管的分散性、溶解性和滲透性。

研究[10]發(fā)現(xiàn)，碳納米管可以進(jìn)入細(xì)胞，且不破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，從而為抗原運(yùn)輸和遞送提供了有利條件。而碳納米管進(jìn)入免疫相關(guān)細(xì)胞是其作為免疫佐劑研究關(guān)注的重點(diǎn)。吞噬細(xì)胞表面表達(dá)模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors，PRRs）與病原生物表面的病原相關(guān)分子模式（pathogenassociated molecular patterns，PAMPs）相 互 識(shí)別、作用，這一過(guò)程是啟動(dòng)先天性免疫應(yīng)答的關(guān)鍵。Pondman等[11]報(bào)道了多種模式識(shí)別受體都具備識(shí)別納米顆粒的潛力，納米物質(zhì)一旦結(jié)合至受體上，將會(huì)被吞噬細(xì)胞吞噬和清除。Meng等[30]采取經(jīng)小鼠背部皮下注射多壁納米管方式，也觀察到了巨噬細(xì)胞吞噬碳納米管的現(xiàn)象。除吞噬作用（phagocytosis）外，碳納米管還可通過(guò)內(nèi)吞作用（endocytosis）和跨細(xì)胞膜途徑直接進(jìn)入吞噬細(xì)胞內(nèi)，且細(xì)胞膜均能保持完好。Kam等[31]通過(guò)體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，短的單壁碳納米管（長(zhǎng)度為50～200 nm）可通過(guò)網(wǎng)格蛋白依賴(lài)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。Pantarotto等[32]研究表明，稍長(zhǎng)的單壁碳納米管（長(zhǎng)度為300～1 000 nm）在進(jìn)入人和小鼠的成纖維細(xì)胞時(shí)表現(xiàn)出直接作用細(xì)胞膜的跨細(xì)胞行為。對(duì)碳納米管進(jìn)行功能化修飾，可影響碳納米管與吞噬細(xì)胞的作用，如親水性或酸性聚合物包覆的多壁碳納米管比疏水性聚合物包覆的可更有效被巨噬細(xì)胞內(nèi)吞[11]；經(jīng)過(guò)聚乙二醇修飾的單壁碳納米管可穿透細(xì)胞膜進(jìn)入宿主細(xì)胞，且不影響細(xì)胞生長(zhǎng)。碳納米管進(jìn)入細(xì)胞后，可以在細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)體中觀察到。也有在細(xì)胞核內(nèi)觀察到的報(bào)道[11]。

3 應(yīng)用及作用機(jī)制

Pantarotto等[18]于2003年首次證實(shí)氨基化單壁碳納米管可顯著提高抗口蹄疫病毒VP1肽段中和抗體的表達(dá)水平，且未檢測(cè)到機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)碳納米管的特異性抗體，表明碳納米管具備免疫佐劑的特性。隨后多位科研工作者先后開(kāi)展了有關(guān)碳納米管作用機(jī)體免疫應(yīng)答的研究，并取得了一定進(jìn)展。Pimentel等[33]發(fā)現(xiàn)，抗牛厭氧芽孢桿菌合成肽（Am1）與多壁碳納米管形成的納米復(fù)合物免疫后可顯著提高宿主抗Am1的IgG水平。Jia等[34]報(bào)道了單壁碳納米管可顯著提升大嘴鱸魚(yú)潰瘍綜合征病毒主要衣殼蛋白（MCP）制成的亞單位疫苗的免疫保護(hù)效率。邢杰等[35-36]通過(guò)體內(nèi)及體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，香菇多糖修飾的碳納米管可調(diào)節(jié)并提高機(jī)體免疫功能，增強(qiáng)免疫效果。有研究者證實(shí)，多壁碳納米管提高機(jī)體免疫應(yīng)答的能力與弗氏佐劑相當(dāng)[37]。與常規(guī)的腫瘤免疫治療相比，多壁碳納米管偶聯(lián)腫瘤相關(guān)蛋白進(jìn)入機(jī)體可更有效促進(jìn)抗腫瘤免疫的發(fā)生[7]，這為腫瘤免疫治療提供了思路。除大分子物質(zhì)外，Parra等[28]還報(bào)道了羧基碳納米管能夠大大提升半抗原的抗體效價(jià)，同時(shí)還顯著降低免疫原劑量，有效節(jié)約成本。此外，單壁碳納米管還能延長(zhǎng)DNA疫苗在體內(nèi)的保留時(shí)間，并提高其表達(dá)水平，誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫應(yīng)答[38]。有研究者將碳納米管當(dāng)作人工抗原遞呈細(xì)胞（artificial antigen-presenting cells），功能化的單壁碳納米管可綁定并遞呈高濃度T細(xì)胞共刺激分子，如抗CD3分子和MHCⅠ類(lèi)分子，隨后T細(xì)胞免疫應(yīng)答被激活[7]。

目前，碳納米管增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答的確切作用機(jī)制尚未揭示。有研究者發(fā)現(xiàn)，皮下注射碳納米管可激活補(bǔ)體系統(tǒng)，改變碳納米管表面特性可增加或降低補(bǔ)體系統(tǒng)活化程度[39-41]，而不同的表面修飾可以將補(bǔ)體激活從一種途徑切換到另一種途徑[11]。碳納米管可影響抗原引起的免疫應(yīng)答，調(diào)控Th細(xì)胞分化，主要誘導(dǎo)以體液免疫為主的Th2型免疫反應(yīng)。但也有少量關(guān)于引起Th1型免疫反應(yīng)的報(bào)道[42]。另外，Kagan等[43]通過(guò)體外和體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，碳納米管通過(guò)與免疫細(xì)胞相互作用，激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和AP-1，從而增強(qiáng)氧化應(yīng)激和細(xì)胞因子釋放，激活T細(xì)胞。經(jīng)皮下注射的碳納米管蓄積于皮下組織，引起大量巨噬細(xì)胞對(duì)其吞噬，而吞噬了碳納米管的巨噬細(xì)胞隨循環(huán)系統(tǒng)遷移到淋巴結(jié)內(nèi)，但未在心、肝、脾、腎等臟器中觀察到碳納米管蓄積，也未發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期炎癥反應(yīng)及明顯組織病變[30]，因而認(rèn)為皮下注射是現(xiàn)階段碳納米管用于疫苗佐劑的最佳免疫途徑。

4 存在問(wèn)題

碳納米管具有多種優(yōu)良特性，其在基因、藥物和疫苗等生物分子的運(yùn)載方面具有極大的應(yīng)用潛力，被科研工作者稱(chēng)為“納米注射器”[7]。隨著對(duì)碳納米管生物學(xué)效應(yīng)研究的深入，其毒理學(xué)特征也成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)[7]。多位研究者發(fā)現(xiàn)，通過(guò)不同途徑（呼吸道灌注、靜脈注射、腹腔注射、皮下注射）進(jìn)入機(jī)體的碳納米管可出現(xiàn)在不同組織臟器中，并引起炎癥反應(yīng)，其中經(jīng)呼吸道途徑進(jìn)入體內(nèi)，可引起肺部組織腫瘤的發(fā)生[44-45]。Manna等[46]發(fā)現(xiàn)，碳納米管進(jìn)入氣管后會(huì)造成肺部強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。多壁碳納米管經(jīng)氣管進(jìn)入大鼠體內(nèi)，會(huì)逐漸跨過(guò)氣血屏障，在肝臟、腎臟和脾臟中蓄積[47]。靜脈注射碳納米管，導(dǎo)致碳納米管持續(xù)在脾臟、肺臟、肝臟中蓄積，而蓄積的碳納米管可引起細(xì)胞的氧化應(yīng)激和凋亡[48]。也有大量數(shù)據(jù)顯示，碳納米管對(duì)機(jī)體的毒性與其結(jié)構(gòu)、使用劑量、功能化修飾和給藥途徑有關(guān)。如：?jiǎn)伪谔技{米管毒性顯著低于多壁碳納米管[49]；羥基化修飾的多壁碳納米管，對(duì)人肝癌細(xì)胞和人結(jié)腸癌細(xì)胞的毒性顯著低于不經(jīng)修飾的多壁碳納米管[50]；功能化修飾后具有水溶性的碳納米管，可隨血液循環(huán)經(jīng)過(guò)尿液排出，不產(chǎn)生蓄積和毒性作用[50]。由此可見(jiàn)，對(duì)碳納米管進(jìn)行功能化修飾是解決碳納米管相關(guān)毒性效應(yīng)的關(guān)鍵。

5 展望

碳納米管作為免疫佐劑方面的研究表明，其能發(fā)揮良好的佐劑效果，減少免疫原劑量，通過(guò)皮下免疫途徑可降低炎癥等不良反應(yīng)，是優(yōu)良的候選佐劑之一。下一步，需對(duì)碳納米管最佳的功能化修飾方式、最適的免疫劑量及免疫毒性三方面進(jìn)行深入研究，相信其結(jié)果的揭示，將為納米材料免疫佐劑的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用帶來(lái)巨大的科研價(jià)值和廣闊的發(fā)展空間。