不同非洲豬瘟病毒熒光PCR 檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)豬肉及豬肉制品中的比較

韋 瑩，陳麗蕓，劉 闖，陳立軍

（南寧海關(guān)技術(shù)中心，廣西南寧 530021）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一種急性、出血性、烈性傳染病。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為須通報(bào)動(dòng)物疫病。該病也是我國(guó)重點(diǎn)防范的一類(lèi)動(dòng)物疫病。目前國(guó)內(nèi)外ASF 疫情防控形勢(shì)復(fù)雜多變[1]。ASF 在我國(guó)暴發(fā)以來(lái)，海關(guān)系統(tǒng)迅速反應(yīng)，對(duì)邊境口岸截獲的豬肉及豬肉制品實(shí)行100% ASFV 核酸檢測(cè)，旨在有效監(jiān)控和防控病毒傳播[2]。商品化檢測(cè)試劑盒因其便捷性在實(shí)驗(yàn)室ASFV 快速檢測(cè)中被廣泛應(yīng)用[3]。本試驗(yàn)擬通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)，對(duì)國(guó)內(nèi)外不同廠家生產(chǎn)的6 種ASFV 檢測(cè)試劑盒性能進(jìn)行比較，從而進(jìn)一步了解不同生產(chǎn)廠家試劑對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，以期為同行今后開(kāi)展ASFV 核酸檢測(cè)提供參考。

1 材料

1.1 樣品

參考OIE 推薦的ASFV 熒光定量PCR 方法[4]合成引物和探針，對(duì)口岸截獲的不同類(lèi)型豬肉及豬肉制品進(jìn)行檢測(cè)。這些豬肉及豬肉制品經(jīng)多次驗(yàn)證確定為ASFV 強(qiáng)陽(yáng)性、中陽(yáng)性及弱陽(yáng)性樣本，即為本試驗(yàn)樣本。將檢測(cè)Ct 值穩(wěn)定在18～21 的樣品劃定為強(qiáng)陽(yáng)性樣本，Ct 值穩(wěn)定在27～30 的樣品劃定為中陽(yáng)性樣本，Ct 值穩(wěn)定在32～35 的樣品劃定為弱陽(yáng)性樣本。將這些不同類(lèi)型的樣本充分均質(zhì)確保均一性。用全自動(dòng)核酸提取儀，對(duì)不同樣本進(jìn)行核酸提取。最終獲得較為穩(wěn)定的強(qiáng)陽(yáng)性、中陽(yáng)性及弱陽(yáng)性3 種ASFV 陽(yáng)性核酸樣本。另1 份不同于上述強(qiáng)陽(yáng)性、中陽(yáng)性、弱陽(yáng)性樣品的ASFV 陽(yáng)性核酸，由本實(shí)驗(yàn)室之前保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑

6 種ASFV 熒光PCR 檢測(cè)試劑盒分別購(gòu)自國(guó)內(nèi)外不同生產(chǎn)廠家，均在效期內(nèi)。其中國(guó)產(chǎn)試劑盒4 種，均選自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公布的ASFV 現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)試劑名單，另外2 種為國(guó)外試劑盒。根據(jù)試劑盒產(chǎn)地分別將試劑盒編號(hào)為A（美國(guó)）、B（法國(guó)）、C—F（國(guó)產(chǎn)）。不同試劑盒適用樣品范圍、反應(yīng)體系、擴(kuò)增程序、反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)、結(jié)果判定均各有特點(diǎn)，詳情見(jiàn)表1～3。其中，4 種國(guó)產(chǎn)試劑盒已經(jīng)過(guò)中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心比對(duì)評(píng)價(jià)，結(jié)果如表4。

表1 不同試劑盒適用樣品范圍

表2 不同試劑盒反應(yīng)體系及時(shí)長(zhǎng)

表3 不同試劑盒結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

表4 4 種國(guó)產(chǎn)試劑盒經(jīng)中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心比對(duì)評(píng)價(jià)結(jié)果[6] %

1.3 儀器設(shè)備

核酸提取儀，購(gòu)自西安天隆科技有限公司；高速冷凍離心機(jī)，購(gòu)自長(zhǎng)沙湘儀檢測(cè)設(shè)備有限公司；冷凍研磨儀，購(gòu)自上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；數(shù)顯恒溫水箱，購(gòu)自常州普天儀器制造有限公司；熒光定量PCR 儀，購(gòu)自美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)（ABI）公司。

2 方法

2.1 樣品性能驗(yàn)證

以O(shè)IE 推薦的ASFV 熒光定量PCR 方法合成引物和探針，對(duì)獲得的ASFV 陽(yáng)性核酸樣本再次驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)Ct 值大小與預(yù)期相符。為驗(yàn)證模板DNA穩(wěn)定性，4 名實(shí)驗(yàn)員（G—J）分別隨機(jī)以抽提好的不同類(lèi)型ASFV 陽(yáng)性模板和陰性對(duì)照上機(jī)驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果如表5，上機(jī)曲線如圖1。Ct 值大小與預(yù)期相符。

圖1 不同類(lèi)型ASFV 陽(yáng)性模板驗(yàn)證結(jié)果

表5 3 類(lèi)不同強(qiáng)度ASFV 陽(yáng)性核酸由不同實(shí)驗(yàn)員驗(yàn)證結(jié)果（Ct 值）

2.2 熒光定量PCR 檢測(cè)

以實(shí)驗(yàn)室留存的1 份ASFV 陽(yáng)性核酸分別驗(yàn)證6 種試劑盒穩(wěn)定性，每個(gè)試劑盒做6 個(gè)平行孔。然后以強(qiáng)陽(yáng)性、中陽(yáng)性及弱陽(yáng)性3 種ASFV 核酸樣品分別驗(yàn)證試劑盒檢測(cè)情況，再將弱陽(yáng)性核酸樣品按1:2、1:4、1:8 稀釋?zhuān)O(shè)置平行孔，進(jìn)一步驗(yàn)證試劑盒敏感性。按每個(gè)檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)標(biāo)識(shí)的反應(yīng)體系配制反應(yīng)液，并分別加入已提取的模板DNA，同時(shí)設(shè)置試劑盒陰陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照。使用熒光定量PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增，各試劑盒反應(yīng)程序按說(shuō)明書(shū)要求設(shè)定。

2.3 數(shù)據(jù)分析

觀察不同試劑盒擴(kuò)增情況，分析不同試劑盒對(duì)相同核酸樣品以及強(qiáng)陽(yáng)性、中陽(yáng)性及弱陽(yáng)性3 種ASFV 核酸樣品檢測(cè)Ct 值差異。

3 結(jié)果與分析

熒光PCR 試驗(yàn)結(jié)果均經(jīng)儀器自動(dòng)分析獲得。各試劑盒陰陽(yáng)性對(duì)照均符合說(shuō)明書(shū)標(biāo)示范圍，試驗(yàn)陰陽(yáng)性質(zhì)控符合要求，有效性成立。

3.1 穩(wěn)定性試驗(yàn)

如圖2 所示，使用不同試劑盒對(duì)同1 份ASFV陽(yáng)性核酸樣本進(jìn)行6 個(gè)平行孔擴(kuò)增，得到的擴(kuò)增曲線輪廓大致相同，表明所用的6 種試劑盒（A—F）重復(fù)性均較好。此外，6 種試劑盒檢測(cè)Ct 值統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表6）顯示，雖然不同試劑盒檢測(cè)Ct 值均值存在差異，但同一試劑盒在重復(fù)（6 個(gè)平行孔）檢測(cè)同1 份樣品時(shí)Ct 值差異較小。這同樣說(shuō)明此6 種試劑盒擴(kuò)增穩(wěn)定性良好。其中D 試劑盒標(biāo)準(zhǔn)差最小，樣品間差異最小。

表6 相同陽(yáng)性核酸不同試劑盒檢測(cè)Ct 值

圖2 6 種試劑盒穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

3.2 敏感性試驗(yàn)

以強(qiáng)陽(yáng)性、中陽(yáng)性及弱陽(yáng)性3 種ASFV 樣品分別驗(yàn)證試劑盒檢測(cè)情況。結(jié)果（圖3）顯示，不同試劑盒擴(kuò)增不同強(qiáng)弱的ASFV 核酸樣品得到的擴(kuò)增曲線輪廓大致相同，擴(kuò)增曲線均呈現(xiàn)對(duì)數(shù)增長(zhǎng)后趨于平穩(wěn)。但不同試劑盒擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)不同特征，即對(duì)數(shù)期出現(xiàn)的時(shí)間和對(duì)數(shù)增長(zhǎng)曲線的斜率不同。其中F 試劑盒僅對(duì)強(qiáng)陽(yáng)性樣本有擴(kuò)增曲線。就本次試驗(yàn)擴(kuò)增情況而言，A—E 試劑盒結(jié)果較為理想。

圖3 不同試劑盒對(duì)不同強(qiáng)弱ASFV 核酸樣品擴(kuò)增結(jié)果

Ct 值統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表7）顯示：對(duì)于強(qiáng)陽(yáng)性樣品，所有試劑盒均可檢出，檢測(cè)Ct 值為17.93～28.86，平均值為22.81；對(duì)于中強(qiáng)陽(yáng)性樣品，Ct 值為23.86～28.85，均值為27.38；對(duì)于弱陽(yáng)性樣品，Ct值為28.77～32.95，均值為31.87。F 試劑盒僅成功檢出強(qiáng)陽(yáng)性樣品，對(duì)中陽(yáng)性和弱陽(yáng)性樣品均未檢出，且強(qiáng)陽(yáng)性樣品檢測(cè)Ct 值為28.86，與其他試劑盒差異極顯著（P＜0.01）。E、F 試劑盒模板加入量差異最小，分別為2、2.5 μL，但對(duì)不同強(qiáng)弱的陽(yáng)性樣本試驗(yàn)結(jié)果差異明顯。A、B、D 試劑盒模板加入量均為5 μL，對(duì)不同強(qiáng)弱的陽(yáng)性樣本試驗(yàn)結(jié)果數(shù)值接近，這3 種試劑盒檢測(cè)Ct 值與OIE推薦的ASFV 熒光定量PCR 方法檢測(cè)Ct 值（表5）在中陽(yáng)性、弱陽(yáng)性樣本的檢測(cè)中無(wú)顯著差異（P＞0.05）。C 試劑盒模板加入量也為5 μL，對(duì)不同強(qiáng)弱的陽(yáng)性樣本檢測(cè)Ct 值在本次比對(duì)試驗(yàn)中最小，其對(duì)強(qiáng)陽(yáng)性、中陽(yáng)性、弱陽(yáng)性樣品檢測(cè)Ct 值分別為17.93、23.86、28.77，均小于OIE 推薦的ASFV熒光定量PCR 方法。由此可見(jiàn)，不同試劑盒的敏感性存在不同差異。

表7 不同試劑盒對(duì)不同強(qiáng)弱ASFV 核酸樣品檢測(cè)Ct 值

將弱陽(yáng)性核酸樣品按1:2、1:4、1:8 進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)O(shè)置2 個(gè)平行孔，進(jìn)一步驗(yàn)證不同試劑盒的敏感性。結(jié)果（表8）顯示，除了F 試劑盒，其他試劑盒均能檢出稀釋后的ASFV 弱陽(yáng)性樣本。

表8 不同試劑盒在不同稀釋度下對(duì)弱陽(yáng)性ASFV 核酸檢測(cè)Ct 值

4 討論

通過(guò)試驗(yàn)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)大部分試劑盒均能較好檢測(cè)出豬肉及豬肉制品中不同強(qiáng)弱ASFV 陽(yáng)性核酸樣本，能滿足實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)基本需求。本次試驗(yàn)使用的不同強(qiáng)弱ASFV 陽(yáng)性DNA 模板來(lái)自口岸截獲的豬肉及豬肉制品混樣，且樣品滅活后經(jīng)過(guò)多輪試驗(yàn)驗(yàn)證。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn) 試劑盒雖然擴(kuò)增時(shí)間較短，理論反應(yīng)時(shí)間僅31 min，但不能檢出本次試驗(yàn)的中陽(yáng)性和弱陽(yáng)性樣本，隨后經(jīng)實(shí)驗(yàn)室再次驗(yàn)證，該批次試劑盒依舊未能檢出中陽(yáng)性和弱陽(yáng)性樣本。本試驗(yàn)中，將檢測(cè)Ct 值穩(wěn)定在27～30 的混合樣本劃定為中陽(yáng)性樣本，F(xiàn) 試劑盒檢測(cè)結(jié)果呈陰性，但在使用另1 份實(shí)驗(yàn)室留存的ASFV 陽(yáng)性核酸驗(yàn)證F試劑盒穩(wěn)定性時(shí)，該試劑盒6 個(gè)平行孔均檢出樣品Ct 值，且均值為29.93（表6）。這可能與該批次試劑盒相關(guān)試劑質(zhì)量或試劑盒本身引物/探針的兼容性和敏感性有關(guān)[5]，也可能是混合陽(yáng)性模板中某些物質(zhì)的存在導(dǎo)致該試劑盒引物對(duì)目的基因序列無(wú)法準(zhǔn)確識(shí)別，從而抑制基因擴(kuò)增。由此可見(jiàn)，技術(shù)性驗(yàn)收在使用試劑盒前非常必要，有條件的應(yīng)以弱陽(yáng)性樣本開(kāi)展技術(shù)驗(yàn)證，避免因試劑問(wèn)題導(dǎo)致的假陰性結(jié)果。

就本次擴(kuò)增情況而言，A—E 試劑盒均可用于實(shí)驗(yàn)室ASFV 日常檢測(cè)。可根據(jù)樣本類(lèi)型和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)需求進(jìn)行選擇。A、B 為進(jìn)口試劑盒，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定，且可同時(shí)擴(kuò)增病毒DNA 和豬內(nèi)參基因。檢測(cè)內(nèi)參基因既可驗(yàn)證被檢測(cè)樣本豬源細(xì)胞的存在，辨別樣本處理和提取是否存在問(wèn)題，同時(shí)可驗(yàn)證熒光PCR 擴(kuò)增過(guò)程中抑制因子存在與否。實(shí)際工作中如果對(duì)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控要求較高，可以考慮選擇這些進(jìn)口試劑盒。C 試劑盒對(duì)3 種強(qiáng)弱的ASFV 陽(yáng)性樣本檢測(cè)Ct 值都低于理論值和其他試劑盒檢測(cè)均值，究其原因可能與試劑盒反應(yīng)液中相關(guān)酶擴(kuò)增效率和離子含量和活性有關(guān)，其在相同濃度DNA模板情況下擴(kuò)增效率最高。該試劑盒理論反應(yīng)時(shí)間較短，在儀器允許條件下可以設(shè)置快速程序。如果想以最快速度得到定性檢測(cè)結(jié)果可以選擇該試劑盒，但是其多次驗(yàn)證比對(duì)樣本的Ct 值均低于理論值，所以不能單憑該試劑盒檢測(cè)結(jié)果判定檢測(cè)樣本中實(shí)際模板濃度大小，同時(shí)，也要注意預(yù)防假陽(yáng)性結(jié)果。在實(shí)際檢測(cè)工作中，ASFV 樣本的定性檢測(cè)需要在實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制條件下多試劑盒比對(duì)或多方法比對(duì)，才能較為準(zhǔn)確地給出判定結(jié)果。