牛羊布魯氏菌cELISA與RBT、SAT 檢測方法比較

韓 勇，韓永平，劉玉潔

（1.日照市畜牧獸醫(yī)管理服務中心，山東日照 276800；

2.五蓮縣畜牧獸醫(yī)管理服務中心中至鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，山東五蓮 262300）

布魯氏菌?。╞rucellosis），又稱馬爾他熱或波狀熱，是由布魯氏菌（Brucella）引起的一種人畜共患的自然疫源性傳染病，常引起動物流產(chǎn)、不孕，故又稱之為傳染性流產(chǎn)病[1-4]。該病被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為須通報動物疫病，我國將其列為二類動物疫病。近年來，國內(nèi)外多個地區(qū)有人畜感染發(fā)病的報告[5-6]。2014 年以來，為推動我國牛羊布魯氏菌凈化工作，提高動物疫病防控條件和管理水平，中國動物疫病預防控制中心印發(fā)了《規(guī)模化奶牛場和種羊場主要動物疫病凈化技術指南》，要求在全國范圍內(nèi)開展“規(guī)?；B(yǎng)殖場主要動物疫病凈化示范場”“規(guī)?；B(yǎng)殖場動物疫病凈化創(chuàng)建場”（以下簡稱“兩場”）評估認證工作，并于2015 年和2021 年先后對“兩場”評估標準進行了修訂。

2014 年以來，為做好布魯氏菌凈化工作，山東省日照市開展了檢測方法優(yōu)化篩選等凈化關鍵技術研究。根據(jù)國標GB/T 18646—2018 中規(guī)定，虎紅平板凝集試驗（RBT）、試管凝集試驗（SAT）、競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗（cELISA）等方法為我國動物布魯氏菌病血清學診斷技術。在現(xiàn)階段大規(guī)模檢疫檢測中，血清學方法仍是最常用的診斷技術[7]。RBT 因操作簡單，敏感性高，在實際應用中常作為初篩手段；SAT 則適用于牛種、羊種和豬種布魯氏菌病血清學確診。目前，市場上cELISA商品試劑盒種類繁多，為篩選敏感性高、可靠性好的試劑盒，本試驗擬將2 種布魯氏菌cELISA 試劑盒與RBT、SAT 方法進行檢測比較分析，以期為快速、準確診斷牛羊布魯氏菌病提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑

布魯氏菌虎紅平板凝集抗原、試管凝集抗原，購自青島易邦生物工程有限公司；2 種布魯氏菌cELISA 試劑盒（A、B），分別購自國內(nèi)兩家試劑公司。

1.2 血清樣品

血清樣品，為近年來本實驗室檢測樣品和日照周圍區(qū)縣送檢復核樣本，均采自日照市，共計122 份。其中牛樣本72 份，羊樣本50 份。

1.3 主要儀器

酶標儀（MultIIskan GO），美國賽默飛公司生產(chǎn)；超純水純化系統(tǒng)（Cascada），美國PALL公司生產(chǎn)；恒溫培養(yǎng)箱（DGX-9143BC），上海南榮實驗室設備有限公司生產(chǎn)；單、多道移液器（BIOHIT），芬蘭百得公司生產(chǎn)；高速冷凍離心機（5424R），德國Eppendorf 公司生產(chǎn)。

1.4 試驗方法

RBT、SAT，參照動物布魯氏菌病診斷技術（GB/T 18646—2018）步驟開展試驗；cELISA 試劑盒檢測，嚴格按照相應說明書進行操作。

1.5 cELISA、RBT 以及SAT 方法比較分析

為更好地評價3 種檢測方法的可靠性，將cELISA 檢測結果分別與RBT、SAT 進行比較，4 種分析指標為假陰性率、假陽性率、符合率和Kappa 值。假陰性率是指cELISA 檢測為陰性用RBT/SAT 檢測為陽性與RBT/SAT 檢測所有陽性之和的百分比；假陽性是指cELISA 檢測為陽性用RBT/SAT 檢測為陰性與RBT/SAT 檢測所有陰性之和的百分比；符合率是指cELISA 檢測的陽性與陰性樣本與兩種檢測方法（RBT、SAT）結果相一致的總和與所有檢測樣本的百分比。

Kappa 值是醫(yī)學上常用的一種用于測評計數(shù)資料一致性的方法，是評價一致性的測量值，是一致性的統(tǒng)計指標，能夠反映測量方法的相關程度。一般認為，Kappa 值＜0，一致性強度極差（實際情況下發(fā)生可能性較低）；0～0.20，一致性強度為微弱；0.21～0.40，一致性強度為弱；0.41～0.60，一致性強度為中度；0.61～0.80，一致性強度為高度；0.81～1.00，一致性強度為極強[8]。

2 結果

2.1 RBT、SAT、cELISA 檢測

RBT、SAT、cELISA 試劑盒分別對122 份血清樣品檢測結果顯示：經(jīng)RBT 檢測，陽性、陰性樣品數(shù)量分別為43、79 份；經(jīng)SAT 檢測，陽性、陰性樣品數(shù)量分別為40、82 份；經(jīng)cELISA 試劑盒A 檢測，陽性、陰性樣品數(shù)量分別為39、83 份；經(jīng)cELISA 試劑盒B 檢測，陽性、陰性樣品數(shù)量分別為38、84 份。

2.2 cELISA 與RBT 檢測結果比較

用cELISA 和RBT 同時檢測122 份血清樣品，結果見表1。cELISA 試劑盒A 的假陰性率、假陽性率、符合率分別為25.58%、8.86%、85.25%，Kappa值為0.669。cELISA試劑盒B的假陰性率、假陽性率、符合率分別為30.23%、10.13%、82.79%，Kappa 值為0.613。

表1 cELISA 試劑盒A、B 和RBT 比較

cELISA 試劑盒A、B 和RBT 符合率均達到82%以上，Kappa 值均大于0.61，表明2 種試劑盒與RBT 符合率較好，已達到較為滿意程度。

2.3 cELISA 與SAT 檢測結果比較

用cELISA 和SAT 同時檢測122 份血清樣品，結果見表2。cELISA 試劑盒A 的假陰性率、假陽性率、符合率分別為10.00%、3.66%、94.26%，Kappa 值 為0.870。cELISA試劑盒B的假陰性率、假陽性率、符合率分別為15.00%、4.88%、91.80%，Kappa 值為0.812。

表2 cELISA 試劑盒A、B 和SAT 比較

3 討論

試驗表明，2 種cELISA 試劑盒與RBT、SAT的符合率達到82%以上，Kappa 值均大于0.61，顯示了良好的一致性，適合作為布魯氏菌凈化檢測方法。同時，將本試驗所選的2 種cELISA 商品試劑盒在多家牛羊場應用，效果較好。

研究[9]表明，RBT 具有較高的敏感性，但有時會因S19 疫苗免疫或交叉反應而出現(xiàn)假陽性結果，偶爾會因前帶現(xiàn)象引起假陰性反應；雖然其敏感性高、操作簡單，但特異性低，只適合作為初篩[10]。本試驗里，SAT 和cELISA 符合率更高，達到91%以上，在我國現(xiàn)行國標GB/T 18646-2018 中，SAT作為血清學確診性試驗，提示本試驗所用的2 種cELISA 試劑盒檢測效果良好。cELISA 是OIE 標準中規(guī)定的國際貿(mào)易布魯氏菌病檢測指定試驗方法，操作簡單、特異性強。牛、羊布魯氏菌病血清學診斷方法種類較多，但目前還沒有任何一種方法在敏感性、特異性以及操作簡便程度、檢測效率等方面都完美無缺。因此在布魯氏菌凈化檢測時，需根據(jù)實際需要及經(jīng)費預算選用合適的檢測方法，建議兩種或以上檢測方法聯(lián)合進行，效果較為理想。

雖然SAT 適用于牛種、羊種和豬種布魯氏菌血清學確診，但病原鑒定和PCR 試驗才是布魯氏菌確診的“金標準”。因此本試驗對2 種cELISA試劑盒與RBT、SAT 的檢測一致性開展比較，對測試cELISA 試劑盒檢測效果有一定局限性，還需使用PCR 對檢測結果進一步驗證。此外，樣本選擇對試驗結果具有較大影響。本試驗雖然對122 份樣本進行了研究，但樣品數(shù)量仍然偏少。cELISA試劑盒樣品存貯時間與來源是否具有代表性、陰陽性樣品數(shù)量選擇對試驗結果的影響，需要在以后研究中進一步驗證。

布魯氏菌病是由布魯氏菌所引起的一種人獸共患傳染病。牛、羊、豬最為常發(fā)，且可傳染給人和其他家畜[11]，嚴重危害畜牧業(yè)生產(chǎn)與人體健康，開展凈化迫在眉睫。日照市自2014 年開展布魯氏菌凈化工作以來，對布魯氏菌檢測方法等關鍵技術進行了集成研究，并在部分規(guī)模牛羊場進行了示范。目前全市已創(chuàng)建5 家“省級牛羊布魯氏菌凈化創(chuàng)建場”，日照市鮮純奶業(yè)有限公司已申請“國家級奶牛布魯氏菌凈化創(chuàng)建場”認證。相關性分析顯示，人間布魯氏菌病與羊布魯氏菌病的發(fā)生表現(xiàn)正相關性[12]，日照市通過多年布魯氏菌病監(jiān)測凈化和大力宣傳，畜間布魯氏菌病得到有效控制，人間布魯氏菌病病例總體也成下降趨勢，說明畜間布魯氏菌病的凈化和防控對于預防人間病例發(fā)生具有積極意義。