牛羊布魯氏菌cELISA與RBT、SAT 檢測方法比較

韓 勇，韓永平，劉玉潔

（1.日照市畜牧獸醫(yī)管理服務(wù)中心，山東日照 276800；

2.五蓮縣畜牧獸醫(yī)管理服務(wù)中心中至鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，山東五蓮 262300）

布魯氏菌?。╞rucellosis），又稱馬爾他熱或波狀熱，是由布魯氏菌（Brucella）引起的一種人畜共患的自然疫源性傳染病，常引起動(dòng)物流產(chǎn)、不孕，故又稱之為傳染性流產(chǎn)病[1-4]。該病被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為須通報(bào)動(dòng)物疫病，我國將其列為二類動(dòng)物疫病。近年來，國內(nèi)外多個(gè)地區(qū)有人畜感染發(fā)病的報(bào)告[5-6]。2014 年以來，為推動(dòng)我國牛羊布魯氏菌凈化工作，提高動(dòng)物疫病防控條件和管理水平，中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心印發(fā)了《規(guī)?；膛龊头N羊場主要?jiǎng)游镆卟艋夹g(shù)指南》，要求在全國范圍內(nèi)開展“規(guī)?；B(yǎng)殖場主要?jiǎng)游镆卟艋痉秷觥薄耙?guī)?；B(yǎng)殖場動(dòng)物疫病凈化創(chuàng)建場”（以下簡稱“兩場”）評(píng)估認(rèn)證工作，并于2015 年和2021 年先后對(duì)“兩場”評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了修訂。

2014 年以來，為做好布魯氏菌凈化工作，山東省日照市開展了檢測方法優(yōu)化篩選等凈化關(guān)鍵技術(shù)研究。根據(jù)國標(biāo)GB/T 18646—2018 中規(guī)定，虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBT）、試管凝集試驗(yàn)（SAT）、競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（cELISA）等方法為我國動(dòng)物布魯氏菌病血清學(xué)診斷技術(shù)。在現(xiàn)階段大規(guī)模檢疫檢測中，血清學(xué)方法仍是最常用的診斷技術(shù)[7]。RBT 因操作簡單，敏感性高，在實(shí)際應(yīng)用中常作為初篩手段；SAT 則適用于牛種、羊種和豬種布魯氏菌病血清學(xué)確診。目前，市場上cELISA商品試劑盒種類繁多，為篩選敏感性高、可靠性好的試劑盒，本試驗(yàn)擬將2 種布魯氏菌cELISA 試劑盒與RBT、SAT 方法進(jìn)行檢測比較分析，以期為快速、準(zhǔn)確診斷牛羊布魯氏菌病提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑

布魯氏菌虎紅平板凝集抗原、試管凝集抗原，購自青島易邦生物工程有限公司；2 種布魯氏菌cELISA 試劑盒（A、B），分別購自國內(nèi)兩家試劑公司。

1.2 血清樣品

血清樣品，為近年來本實(shí)驗(yàn)室檢測樣品和日照周圍區(qū)縣送檢復(fù)核樣本，均采自日照市，共計(jì)122 份。其中牛樣本72 份，羊樣本50 份。

1.3 主要儀器

酶標(biāo)儀（MultIIskan GO），美國賽默飛公司生產(chǎn)；超純水純化系統(tǒng)（Cascada），美國PALL公司生產(chǎn)；恒溫培養(yǎng)箱（DGX-9143BC），上海南榮實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司生產(chǎn)；單、多道移液器（BIOHIT），芬蘭百得公司生產(chǎn)；高速冷凍離心機(jī)（5424R），德國Eppendorf 公司生產(chǎn)。

1.4 試驗(yàn)方法

RBT、SAT，參照動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)（GB/T 18646—2018）步驟開展試驗(yàn)；cELISA 試劑盒檢測，嚴(yán)格按照相應(yīng)說明書進(jìn)行操作。

1.5 cELISA、RBT 以及SAT 方法比較分析

為更好地評(píng)價(jià)3 種檢測方法的可靠性，將cELISA 檢測結(jié)果分別與RBT、SAT 進(jìn)行比較，4 種分析指標(biāo)為假陰性率、假陽性率、符合率和Kappa 值。假陰性率是指cELISA 檢測為陰性用RBT/SAT 檢測為陽性與RBT/SAT 檢測所有陽性之和的百分比；假陽性是指cELISA 檢測為陽性用RBT/SAT 檢測為陰性與RBT/SAT 檢測所有陰性之和的百分比；符合率是指cELISA 檢測的陽性與陰性樣本與兩種檢測方法（RBT、SAT）結(jié)果相一致的總和與所有檢測樣本的百分比。

Kappa 值是醫(yī)學(xué)上常用的一種用于測評(píng)計(jì)數(shù)資料一致性的方法，是評(píng)價(jià)一致性的測量值，是一致性的統(tǒng)計(jì)指標(biāo)，能夠反映測量方法的相關(guān)程度。一般認(rèn)為，Kappa 值＜0，一致性強(qiáng)度極差（實(shí)際情況下發(fā)生可能性較低）；0～0.20，一致性強(qiáng)度為微弱；0.21～0.40，一致性強(qiáng)度為弱；0.41～0.60，一致性強(qiáng)度為中度；0.61～0.80，一致性強(qiáng)度為高度；0.81～1.00，一致性強(qiáng)度為極強(qiáng)[8]。

2 結(jié)果

2.1 RBT、SAT、cELISA 檢測

RBT、SAT、cELISA 試劑盒分別對(duì)122 份血清樣品檢測結(jié)果顯示：經(jīng)RBT 檢測，陽性、陰性樣品數(shù)量分別為43、79 份；經(jīng)SAT 檢測，陽性、陰性樣品數(shù)量分別為40、82 份；經(jīng)cELISA 試劑盒A 檢測，陽性、陰性樣品數(shù)量分別為39、83 份；經(jīng)cELISA 試劑盒B 檢測，陽性、陰性樣品數(shù)量分別為38、84 份。

2.2 cELISA 與RBT 檢測結(jié)果比較

用cELISA 和RBT 同時(shí)檢測122 份血清樣品，結(jié)果見表1。cELISA 試劑盒A 的假陰性率、假陽性率、符合率分別為25.58%、8.86%、85.25%，Kappa值為0.669。cELISA試劑盒B的假陰性率、假陽性率、符合率分別為30.23%、10.13%、82.79%，Kappa 值為0.613。

表1 cELISA 試劑盒A、B 和RBT 比較

cELISA 試劑盒A、B 和RBT 符合率均達(dá)到82%以上，Kappa 值均大于0.61，表明2 種試劑盒與RBT 符合率較好，已達(dá)到較為滿意程度。

2.3 cELISA 與SAT 檢測結(jié)果比較

用cELISA 和SAT 同時(shí)檢測122 份血清樣品，結(jié)果見表2。cELISA 試劑盒A 的假陰性率、假陽性率、符合率分別為10.00%、3.66%、94.26%，Kappa 值 為0.870。cELISA試劑盒B的假陰性率、假陽性率、符合率分別為15.00%、4.88%、91.80%，Kappa 值為0.812。

表2 cELISA 試劑盒A、B 和SAT 比較

3 討論

試驗(yàn)表明，2 種cELISA 試劑盒與RBT、SAT的符合率達(dá)到82%以上，Kappa 值均大于0.61，顯示了良好的一致性，適合作為布魯氏菌凈化檢測方法。同時(shí)，將本試驗(yàn)所選的2 種cELISA 商品試劑盒在多家牛羊場應(yīng)用，效果較好。

研究[9]表明，RBT 具有較高的敏感性，但有時(shí)會(huì)因S19 疫苗免疫或交叉反應(yīng)而出現(xiàn)假陽性結(jié)果，偶爾會(huì)因前帶現(xiàn)象引起假陰性反應(yīng)；雖然其敏感性高、操作簡單，但特異性低，只適合作為初篩[10]。本試驗(yàn)里，SAT 和cELISA 符合率更高，達(dá)到91%以上，在我國現(xiàn)行國標(biāo)GB/T 18646-2018 中，SAT作為血清學(xué)確診性試驗(yàn)，提示本試驗(yàn)所用的2 種cELISA 試劑盒檢測效果良好。cELISA 是OIE 標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的國際貿(mào)易布魯氏菌病檢測指定試驗(yàn)方法，操作簡單、特異性強(qiáng)。牛、羊布魯氏菌病血清學(xué)診斷方法種類較多，但目前還沒有任何一種方法在敏感性、特異性以及操作簡便程度、檢測效率等方面都完美無缺。因此在布魯氏菌凈化檢測時(shí)，需根據(jù)實(shí)際需要及經(jīng)費(fèi)預(yù)算選用合適的檢測方法，建議兩種或以上檢測方法聯(lián)合進(jìn)行，效果較為理想。

雖然SAT 適用于牛種、羊種和豬種布魯氏菌血清學(xué)確診，但病原鑒定和PCR 試驗(yàn)才是布魯氏菌確診的“金標(biāo)準(zhǔn)”。因此本試驗(yàn)對(duì)2 種cELISA試劑盒與RBT、SAT 的檢測一致性開展比較，對(duì)測試cELISA 試劑盒檢測效果有一定局限性，還需使用PCR 對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，樣本選擇對(duì)試驗(yàn)結(jié)果具有較大影響。本試驗(yàn)雖然對(duì)122 份樣本進(jìn)行了研究，但樣品數(shù)量仍然偏少。cELISA試劑盒樣品存貯時(shí)間與來源是否具有代表性、陰陽性樣品數(shù)量選擇對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，需要在以后研究中進(jìn)一步驗(yàn)證。

布魯氏菌病是由布魯氏菌所引起的一種人獸共患傳染病。牛、羊、豬最為常發(fā)，且可傳染給人和其他家畜[11]，嚴(yán)重危害畜牧業(yè)生產(chǎn)與人體健康，開展凈化迫在眉睫。日照市自2014 年開展布魯氏菌凈化工作以來，對(duì)布魯氏菌檢測方法等關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)行了集成研究，并在部分規(guī)模牛羊場進(jìn)行了示范。目前全市已創(chuàng)建5 家“省級(jí)牛羊布魯氏菌凈化創(chuàng)建場”，日照市鮮純奶業(yè)有限公司已申請“國家級(jí)奶牛布魯氏菌凈化創(chuàng)建場”認(rèn)證。相關(guān)性分析顯示，人間布魯氏菌病與羊布魯氏菌病的發(fā)生表現(xiàn)正相關(guān)性[12]，日照市通過多年布魯氏菌病監(jiān)測凈化和大力宣傳，畜間布魯氏菌病得到有效控制，人間布魯氏菌病病例總體也成下降趨勢，說明畜間布魯氏菌病的凈化和防控對(duì)于預(yù)防人間病例發(fā)生具有積極意義。