納米抗體篩選和表達(dá)技術(shù)研究進(jìn)展

朱 光，王譯晨，宋莎莎，張麥?zhǔn)眨跫硬?/p>

（1.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東濰坊 261061；2.濰坊市獸藥制劑研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濰坊 261061）

傳統(tǒng)抗體由2 條重鏈和2 條輕鏈組成，其中重鏈包括1 個(gè)可變區(qū)（variable region of heavy chain，VH）和3 個(gè) 恒 定 區(qū)（constant region of heavy chain，CH），輕鏈包括1 個(gè)可變區(qū)（variable region of light chain，VL）和1 個(gè)恒定區(qū)（constant region of light chain，CL）。重鏈之間通過二硫鍵共價(jià)連接，輕鏈CL 區(qū)與重鏈CH1 結(jié)構(gòu)域通過非共價(jià)作用連接形成穩(wěn)定的抗體分子。1993 年，Hamers-Casterman 等[1]偶然在駱駝血清中發(fā)現(xiàn)一種不同于傳統(tǒng)免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）的新型抗體。這類抗體天然缺失輕鏈和重鏈CH1，由CH2、CH3、鉸鏈區(qū)和重鏈可變區(qū)（variable domain of heavy chain of heavy-chain，VHH）組成，被稱為重鏈抗體（heavy chain antibodies，HCAbs），但其仍具有完全的抗原結(jié)合能力。盡管不清楚HCAbs 的進(jìn)化優(yōu)勢(shì)，但研究人員已迅速認(rèn)識(shí)到分離VHH 的重要性及其廣泛的適用性[2-3]。VHH 并非天然存在于駱駝血液中，它只是HCAbs N 端的可變區(qū)，又被稱為單域抗體（single domain antibody，sdAb）。sdAb 直徑約2.5 nm，高約4 nm，因結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單和尺寸小，也被稱為納米抗體（nanobody，Nb）。

Nb 由4 個(gè)框架區(qū)（framework regoin，F(xiàn)R）和3 個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（complementarity-determining region，CDR）構(gòu) 成。VHH 的FR 與 人 類VH 有80%以上的序列同源性，且它們的三維結(jié)構(gòu)可以重疊[4]。將Nb FR2 區(qū)第37、44、45 和47 位的4個(gè)疏水性氨基酸替換為親水性氨基酸，會(huì)有助于增強(qiáng)Nb 的溶解性和穩(wěn)定性[5]。盡管VHH 與VH 的氨基酸序列相似，但與VH 相比，VHH 只有3 個(gè)CDR 參與抗原結(jié)合，而傳統(tǒng)抗體有6 個(gè)CDR 決定抗原識(shí)別位點(diǎn)[6]，且VHH 的CDR3 平均長(zhǎng)度為17個(gè)氨基酸殘基（人源VH 的CDR3 平均為12 個(gè)殘基），而較長(zhǎng)的CDR3 既增加了作用表面積，又可以識(shí)別抗原表面的縫隙表位，但這些表位對(duì)傳統(tǒng)抗體的抗原性通常較低。CDR3 半胱氨酸可與CDR1或CDR2 半胱氨酸形成二硫鍵，從而增加VHH 的穩(wěn)定性[7]。

Nb 很容易被生產(chǎn)和改造，并且有良好的組織穿透性，其識(shí)別凹陷抗原位點(diǎn)的能力歸因于它們較小的尺寸以及較長(zhǎng)的CDR3 環(huán)快速穿透縫隙表位的能力。另外，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，Nb 越來越多被用于靶向酶、跨膜蛋白或分子間相互作用研究，其在分子成像、診斷試劑、藥物靶向釋放和疾病治療方面具有潛在的應(yīng)用前景。本文介紹了Nb 的特性、篩選技術(shù)和表達(dá)方式，以及在動(dòng)物疫病診斷或治療方面的應(yīng)用，以期為相關(guān)領(lǐng)域研究提供技術(shù)支持。

1 特性

1.1 相對(duì)分子質(zhì)量小

Nb 相對(duì)分子質(zhì)量為15 kDa，比傳統(tǒng)IgG（約150 kDa）及其片段Fab（約50 kDa）和scFv（約25 kDa）要小的多[8]，是目前已知的最小抗原結(jié)合單位，因此與IgG 及其片段相比，Nb 具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

1.2 特異性和親和力高

不同于傳統(tǒng)抗體，Nb 盡管只有3 個(gè)CDRs，但其CDR3 比單克隆抗體的VH 結(jié)構(gòu)域更長(zhǎng)，從而表現(xiàn)出更強(qiáng)的特異性與親和力。另外，晶體學(xué)研究[9]表明，Nb 的抗原結(jié)合環(huán)具有更大的結(jié)構(gòu)譜系。

1.3 可進(jìn)一步改造加工

基于不同目的，通過基因重組技術(shù)將標(biāo)記蛋白（如GFP 熒光蛋白、Luciferease 等）與Nb 融合表達(dá)有助于實(shí)時(shí)追蹤檢測(cè)，從而擴(kuò)大其應(yīng)用范圍；與單價(jià)Nb 相比，串聯(lián)表達(dá)多特異性Nb 可以同時(shí)靶向多種類型靶標(biāo)，從而提高Nb 的特異性和親和力[10-11]。另外，經(jīng)改造加工的嵌合抗體可顯著增強(qiáng)治療效果和延長(zhǎng)半衰期。

1.4 穩(wěn)定性和可溶性高

Nb 在溶解度、耐熱和抗水解等方面都有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。CDR3 的折疊和FR2 區(qū)域親水性氨基酸的含量使它們?cè)谒芤褐腥芙舛壬撸也灰装l(fā)生聚集[12]。Nb 構(gòu)象穩(wěn)定且耐高溫，37 ℃存放1 周后仍保持抗原結(jié)合能力，90 ℃高溫孵育變性后不會(huì)聚集，待溫度冷卻后仍然可以折疊為天然構(gòu)象，具有良好的可逆性[13]。此外，Nb 在極端的pH、蛋白酶及去垢劑存在的條件下均表現(xiàn)出高穩(wěn)定性。目前已經(jīng)開發(fā)出了在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的針對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白的重組Nb，在殺滅細(xì)胞內(nèi)病原體或治療神經(jīng)退行性疾病等方面作用顯著[14]；另外，抗水解和在極端條件下的強(qiáng)穩(wěn)定性使它們適合于口服給藥。同時(shí)，Nb 所具有的高穩(wěn)定性使其在診斷檢測(cè)方面擁有廣闊的應(yīng)用前景[15]。

1.5 組織滲透性強(qiáng)和易清除

由于細(xì)胞間的被動(dòng)擴(kuò)散速率取決于分子大小，且與分子大小成反比，因此Nb 與傳統(tǒng)IgG 相比，其組織滲透性得到顯著提高，從而具有穿過血腦屏障的能力。Nb 可以靶向特定的腫瘤細(xì)胞表面，成為腫瘤靶向治療手段之一。Nb 相對(duì)分子質(zhì)量小，在體內(nèi)容易被清除，但可以通過添加聚乙二醇，與白蛋白Nb 偶聯(lián)或與常規(guī)抗體的Fc 片段融合等方法延長(zhǎng)半衰期。然而，對(duì)于一些特定用途，Nb 能被腎臟快速代謝的特點(diǎn)避免了對(duì)機(jī)體的影響。

1.6 具有識(shí)別縫隙表位能力

抗體晶體學(xué)研究[16]表明，在大多數(shù)情況下，抗原結(jié)合表面為平面或凹陷面，但Nb 能結(jié)合到抗原的裂縫和凹槽中。VHH 的CDR1 區(qū)域具有更好的延展性且CDR3 區(qū)域暴露面積更廣，較長(zhǎng)的CDR3 具有充當(dāng)VL 的作用。這些結(jié)構(gòu)變化使得Nb 既可以結(jié)合抗原表面，也使得Nb 具有結(jié)合傳統(tǒng)抗體所不能識(shí)別的抗原縫隙表位的能力。

1.7 免疫原性弱

Nb 相對(duì)分子質(zhì)量小，其序列與人類VH 同源性高，且在體內(nèi)能被快速清除的特點(diǎn)，決定了Nb的低免疫原性。

1.8 生產(chǎn)簡(jiǎn)便

單克隆抗體作為一種多聚體蛋白，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，需要經(jīng)過翻譯修飾后才具有生物學(xué)功能，因此適合在真核系統(tǒng)中表達(dá)。此外，單克隆抗體制備需要融合、亞克隆等復(fù)雜操作以及漫長(zhǎng)的篩選和純化過程。而Nb 具有的優(yōu)勢(shì)決定了其生產(chǎn)的簡(jiǎn)便性：（1）結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，在沒有修飾以及Fc 結(jié)構(gòu)域存在的情況下仍具有活性，適合在細(xì)菌和酵母中大量表達(dá)；（2）可以從展示文庫(kù)中通過高通量快速篩選獲得具有強(qiáng)特異性和高親和力的候選抗體分子。

2 篩選方法

2.1 噬菌體展示

噬菌體展示技術(shù)是將外源基因?qū)胧删w載體，使其與噬菌體外殼蛋白融合表達(dá)并隨噬菌體組裝在其頭部完整展示的技術(shù)，是一種強(qiáng)大且實(shí)用的蛋白質(zhì)分子相互作用研究工具[17-18]。

20 世紀(jì)90 年代初，噬菌體展示技術(shù)在特異性Nb 的淘選過程中得到廣泛應(yīng)用[19]。1997 年，Arbabi 等[4]通過噬菌體展示技術(shù)篩選到了第1 株Nb。為了獲得特異性強(qiáng)、親和力高的抗體，一般要將抗原免疫駝科動(dòng)物4～5 次，從而刺激機(jī)體產(chǎn)生成熟的靶向抗原特異性抗體。獲得特異性抗體的操作流程包括：采集外周血分離淋巴細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；用巢式PCR 擴(kuò)增VHH 基因并構(gòu)建至噬菌體展示載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌；利用輔助噬菌體使抗體展示于噬菌體表面，洗脫并擴(kuò)增與靶抗原特異性結(jié)合的重組噬菌體，并通過大量擴(kuò)增、沉淀、溶解等操作獲得重組噬菌體；經(jīng)過3～5 輪生物富集篩選后，即可獲得特異性抗體。

獲得特異性Nb 的首個(gè)關(guān)鍵步驟是制備抗原免疫動(dòng)物。但這種方法不僅繁瑣而且成本較高，也不適用于高致病性、毒性或免疫原性弱的抗原分子抗體篩選。Comor 等[20]報(bào)道了一種篩選技術(shù)，可最大限度減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用。從未免疫的健康羊駝血液中分離PBMC，然后在體外與抗原孵育72 h，最后收集PBMC 提取總RNA，并通過噬菌體展示淘選Nb。這不僅大大降低了免疫動(dòng)物所需成本，還避免了為獲得抗原特異性抗體而構(gòu)建多樣化合成文庫(kù)的相關(guān)工作。同時(shí)體外條件下，包括細(xì)胞表面抗原在內(nèi)的各種免疫原可以很容易致敏PBMC，并可在短時(shí)間內(nèi)獲得抗原特異性Nb，這對(duì)通過體外免疫篩選Nb 有很好的指導(dǎo)意義。

2.2 酵母雙雜交

1989 年，F(xiàn)ields 建立了酵母雙雜交體系。該體系已被應(yīng)用于真核細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄研究。真核生物中有兩個(gè)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域，可以特異性結(jié)合到基因上游的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄激活因子是相互獨(dú)立的，分別為BD 和AD。在酵母雙雜交系統(tǒng)中，構(gòu)建一種已知的蛋白質(zhì)基因序列和BD 結(jié)構(gòu)域序列的重組載體，稱為“誘餌”；構(gòu)建一個(gè)未知的蛋白基因序列和AD 結(jié)構(gòu)域序列組成的載體，稱為“獵物”。如果誘餌和獵物之間沒有相互作用，BD 和AD 就不會(huì)被激發(fā)，報(bào)告基因也不能被激活和表達(dá)。在宿主細(xì)胞中，如果誘餌和獵物相互作用并且表達(dá)，那么BD 和AD 將與激活序列結(jié)合，下游報(bào)告基因也因此被激活表達(dá)[21]。酵母雙雜交技術(shù)在蛋白質(zhì)相互作用研究中扮演著重要角色，已被廣泛應(yīng)用于多個(gè)研究領(lǐng)域。

酵母雙雜交是從免疫文庫(kù)中篩選出高親和力Nb 的有效手段，其文庫(kù)構(gòu)建與噬菌體展示過程基本相同。文庫(kù)篩選要先構(gòu)建帶有抗原基因的誘餌質(zhì)粒，然后將誘餌菌與文庫(kù)菌混合雜交，待雜交產(chǎn)物在顯微鏡下觀察到三葉草樣雜合體時(shí)，離心收集菌體涂布于選擇性平板，如菌落生長(zhǎng)且發(fā)藍(lán)，則初步鑒定為陽(yáng)性克??；將文庫(kù)質(zhì)粒與誘餌質(zhì)粒一同轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行驗(yàn)證，對(duì)共轉(zhuǎn)驗(yàn)證陽(yáng)性的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，即可得到特異性Nb 的核苷酸序列。Gao 等[22]通過酵母雙雜交技術(shù)成功得到了7 株抗新城疫病毒 HN 蛋白的Nb，經(jīng)驗(yàn)證7 株Nb 均可以特異性識(shí)別病毒和HN 蛋白，并且具有抑制新城疫病毒血凝素活性的作用，其中5 株 VHH 抗體還具有一定的中和活性，可在感染早期抑制病毒在宿主細(xì)胞上增殖。

2.3 mRNA 展示

通過體內(nèi)展示篩選Nb 在一定程度上受轉(zhuǎn)化效率影響。mRNA 展示作為體外展示技術(shù)，具有篩選效率高、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，其原理是通過共價(jià)鍵將核酸序列與其編碼的蛋白質(zhì)連接起來，形成mRNA-蛋白質(zhì)融合體。如圖1 所示，將dsDNA 文庫(kù)中的序列體外轉(zhuǎn)錄形成mRNA，模擬tRNA 氨基?；泥堰拭顾剡B接子進(jìn)入核糖體A 位點(diǎn)，通過抑制蛋白質(zhì)翻譯，使mRNA 的3'端與多肽的羧基端共價(jià)結(jié)合；利用肽鍵形成多肽鏈，最終得到mRNA-蛋白質(zhì)融合體，實(shí)現(xiàn)了基因型和表型的結(jié)合[23]。通過標(biāo)簽將mRNA-蛋白質(zhì)融合體純化后，反轉(zhuǎn)錄形成cDNA-mRNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，然后將其加入到包被有抗原的固相載體上，洗滌去除未結(jié)合的復(fù)合物；將特異性復(fù)合物從固相中洗脫下來，加酶使cDNA 脫離并利用PCR 擴(kuò)增基因，TA 克隆后對(duì)序列進(jìn)行分析。

圖1 mRNA 展示技術(shù)示意圖[26]

mRNA 展示技術(shù)共價(jià)結(jié)合非常穩(wěn)定，可以在嚴(yán)苛的抗原結(jié)合條件下進(jìn)行，以確保篩選到高度特異、穩(wěn)定的結(jié)合對(duì)象[24]。例如全長(zhǎng)的跨膜蛋白需要去垢劑進(jìn)行溶解，并包含大量的疏水性區(qū)域。Doshi 等[25]首次通過mRNA 展示篩選到針對(duì)人類全長(zhǎng)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT-1 的Nb，其篩選過程只需要10 μg 純化的靶抗原以及20 μg 的mRNA，篩選的Nb 與抗原的平衡解離常數(shù)平均Kd 值為（22.3±11.5）nmol/L。

2.4 高通量測(cè)序和質(zhì)譜分析

該方法基于對(duì)免疫抗原駱駝淋巴細(xì)胞VHH cDNA 文庫(kù)的高通量測(cè)序，并結(jié)合來自駱駝血清高親和力的VHH 區(qū)域質(zhì)譜（MS）鑒定，直接從駱駝血清中識(shí)別高親和力的Nb 序列，因此不需要在體外構(gòu)建展示文庫(kù)，省去了體外展示抗體的步驟，因而能快速篩選到大量針對(duì)特定抗原多個(gè)表位的Nb。

Fridy 等[27]從免疫的駱駝外周血提取淋巴細(xì)胞總RNA 并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增VHH 序列，再進(jìn)行高通量測(cè)序并建立特異性抗體序列數(shù)據(jù)庫(kù)；通過抗原偶聯(lián)樹脂親和純化HCAbs，并用木瓜蛋白酶消化切割恒定區(qū)，洗脫回收親和力最高的VHH 片段；凝膠純化后的條帶經(jīng)胰蛋白酶消化后，用液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）和串聯(lián)質(zhì)譜（MS）分析，在未構(gòu)建展示文庫(kù)的條件下，通過該篩選方法，快速篩選到了針對(duì)綠色熒光蛋白（GFP）的高親和力Nb。

3 表達(dá)

對(duì)篩選得到的特異性Nb 序列需要進(jìn)行表達(dá)，以便更好地研究其功能。

3.1 原核表達(dá)

利用大腸桿菌進(jìn)行重組蛋白表達(dá)是目前實(shí)驗(yàn)室最常用的表達(dá)方式。原核表達(dá)操作相對(duì)簡(jiǎn)便、產(chǎn)量大、生產(chǎn)成本低，對(duì)細(xì)菌已經(jīng)有廣泛的研究基礎(chǔ)，表達(dá)系統(tǒng)非常成熟。但原核表達(dá)也有一些缺點(diǎn)：大腸桿菌表達(dá)的重組蛋白帶有內(nèi)毒素，對(duì)動(dòng)物機(jī)體有害；大腸桿菌結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，缺乏翻譯后修飾，從而影響蛋白功能。

Nb 不同于傳統(tǒng)抗體，沒有Fc 及其N 端寡糖，結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，能利用原核系統(tǒng)表達(dá)。Nb 通常是在大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)完成組裝后分泌到周質(zhì)中。與細(xì)胞質(zhì)相比，周質(zhì)更適合Nb 表達(dá)。它是氧化性區(qū)域并存在許多伴侶蛋白和異構(gòu)酶，可以促進(jìn)二硫鍵形成和蛋白正確折疊。大多數(shù)含有二硫鍵的蛋白首先在胞質(zhì)中產(chǎn)生，然后借助N 末端前導(dǎo)序列并通過普通分泌途徑分泌到周質(zhì)空間[28-29]。這樣就可以通過添加信號(hào)肽使Nb 分泌到周質(zhì)，并利用滲透休克法增強(qiáng)外膜的通透性，使Nb 從周質(zhì)中釋放，從而降低裂解細(xì)胞形成的雜蛋白含量，有利于得到高純度Nb。已有文獻(xiàn)[29]利用大腸桿菌周質(zhì)間隙表達(dá)Nb，其中一些Nb 產(chǎn)量可以達(dá)到每升幾十毫克。但由于周質(zhì)中伴侶蛋白含量相對(duì)較少，大部分的VHH 表達(dá)量仍處在較低水平，另外胞質(zhì)Nb 的聚集和轉(zhuǎn)運(yùn)似乎也是影響周質(zhì)表達(dá)產(chǎn)量的因素。

與周質(zhì)表達(dá)相比，胞質(zhì)表達(dá)獲得的Nb 大多是以包涵體形式存在，通過完全變性再?gòu)?fù)性的方式能夠?qū)崿F(xiàn)Nb 重折疊和二硫鍵形成。細(xì)胞質(zhì)中有2 種硫氧還蛋白和3 種谷胱甘肽，在硫氧還蛋白還原酶和谷胱甘肽還原酶的作用下維持還原狀態(tài)，但硫氧還蛋白和谷胱甘肽在氧化狀態(tài)下能夠催化蛋白二硫鍵形成[30]。為了促進(jìn)二硫鍵形成和正確折疊，已經(jīng)開發(fā)了在硫氧還蛋白和谷胱甘肽還原途徑中有缺陷的雙突變菌株，例如Origami（Novagen）、Rosetta-gami（Novagen）[31-32]。

培養(yǎng)基成分對(duì)VHH 在大腸桿菌中的表達(dá)有重要影響?？紤]到培養(yǎng)基中相當(dāng)高的細(xì)胞密度，使用營(yíng)養(yǎng)更為豐富的EnPresso 和TB 培養(yǎng)基獲得的Nb產(chǎn)量比普通LB 培養(yǎng)基高5～10 倍[33]。此外，結(jié)合不同的純化方法可以提高純化效率和獲得率[34-35]，其他一些因素也可以影響VHH 產(chǎn)量，包括培養(yǎng)溫度、搖床速度和誘導(dǎo)濃度[36-37]。

3.2 酵母表達(dá)

酵母作為簡(jiǎn)單的真核生物，能夠表達(dá)可溶、正確折疊和帶有簡(jiǎn)單糖基化的外源蛋白，并分泌到培養(yǎng)基中。畢赤酵母是最成功的酵母表達(dá)系統(tǒng)之一。該酵母在高密度發(fā)酵中不積累有毒乙醇，也不像釀酒酵母那樣分泌大量?jī)?nèi)源蛋白至培養(yǎng)基。甲醇誘導(dǎo)型AOX1 啟動(dòng)子調(diào)控嚴(yán)密，是畢赤酵母與其他系統(tǒng)相比最顯著的優(yōu)勢(shì)，適合于外源蛋白的高效表達(dá)。Rahbarizadeh 在2006 年首次使用畢赤酵母系統(tǒng)表達(dá)Nb，成功表達(dá)了2 個(gè)抗黏蛋白（MUC1）的Nb，并通過添加誘導(dǎo)劑和優(yōu)化一系列條件，使產(chǎn)量達(dá)10～15 mg/L。由于缺乏Fc，大多數(shù)VHH 不包含糖基化位點(diǎn)，然而大約10%的VHH 含有潛在糖基化位點(diǎn)，相對(duì)分子質(zhì)量比預(yù)測(cè)的Nb（13～15 kDa）稍大[38]。Nb 糖基化可以增強(qiáng)VHH 的毒性和病毒中和能力[39]，但有時(shí)也會(huì)降低與抗原結(jié)合的能力[40-41]，其影響需要進(jìn)一步研究，未來的研究應(yīng)該盡可能減少不必要的糖基化。

3.3 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)

哺乳動(dòng)物細(xì)胞仍是生產(chǎn)功能性抗體的最佳表達(dá)系統(tǒng)，大多數(shù)治療性抗體都是利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的。目前人類批準(zhǔn)使用的單克隆抗體藥物都是由CHO、SP2/0、NSO 等細(xì)胞生產(chǎn)。一方面單抗生產(chǎn)需要真核細(xì)胞表達(dá)以保證其功能的完整性，另一方面哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的抗體免疫原性小、安全性高。CHO 細(xì)胞生長(zhǎng)周期短且能適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)基的懸浮培養(yǎng)，在搖瓶中表達(dá)Nb 的產(chǎn)量高達(dá)100 mg/L[42]；與CHO 細(xì)胞產(chǎn)生的穩(wěn)定表達(dá)相比，HEK-293 細(xì)胞通?？梢赃M(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)，提供一些實(shí)驗(yàn)室表達(dá)參數(shù)，但這些參數(shù)在早期階段需要進(jìn)行鑒定，因此HEK-293 更適合在實(shí)驗(yàn)室花費(fèi)較少情況下進(jìn)行前期表達(dá)條件摸索[43]。能有效促進(jìn)正確翻譯后修飾的哺乳動(dòng)物細(xì)胞是抗體表達(dá)中最廣泛使用的表達(dá)系統(tǒng)，但其生產(chǎn)成本比其他表達(dá)系統(tǒng)要高得多。

3.4 植物表達(dá)

植物細(xì)胞具有易轉(zhuǎn)化、高產(chǎn)量、安全，能夠進(jìn)行翻譯后修飾等特點(diǎn)，是理想的蛋白表達(dá)宿主。植物表達(dá)系統(tǒng)能夠大量表達(dá)具有高親和力的VHH，且成本較低，這意味著植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)某種程度上可以替代哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)。另外植物表達(dá)還具有其獨(dú)特特點(diǎn)——抗體在一些可食用植物組織中表達(dá)后可以口服[44]。通常植物中異源蛋白的表達(dá)有3 種方法：整合至基因組穩(wěn)定表達(dá)、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)和質(zhì)體基因組表達(dá)。通過農(nóng)桿菌滲透法表達(dá)VHH 是最常用的方法[45]。煙草是最常見表達(dá)VHH 的植物，其表達(dá)VHH 的平均產(chǎn)量高達(dá)總可溶性蛋白的1%[46]，而擬南芥種子是表達(dá)口服VHH更方便的載體[47]。此外，其他植物生產(chǎn)系統(tǒng)，如水稻種子和馬鈴薯也成功表達(dá)了VHH。與基因組穩(wěn)定表達(dá)相比，使用病毒載體瞬時(shí)表達(dá)在某些情況下獲得了更高的產(chǎn)量[48-49]。

4 動(dòng)物疫病防治中的應(yīng)用

近年來，Nb 被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥等領(lǐng)域，能夠特異性識(shí)別并結(jié)合生物分子，可作為特異性生物探針或醫(yī)藥載體，在人類疾病診斷和治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景，而在動(dòng)物疫病防治中也有著巨大潛力。

Sheng 等[50]通過噬菌體展示技術(shù)篩選到9 株針對(duì)新城疫病毒NP 蛋白的Nb。他們將Nb 直接跟辣根過氧化物酶（HRP）融合表達(dá)，構(gòu)建了真核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染至HEK-293T 細(xì)胞表達(dá)，同時(shí)基于Nb-HRP 復(fù)合物，建立了cELISA 檢測(cè)方法。該cELISA 方法省時(shí)且敏感，可以在1 h 內(nèi)完成檢測(cè)，并且比HI 試驗(yàn)和市面上商品化試劑盒還要靈敏。Du 等[51]將篩選到的1 株針對(duì)豬流感病毒NP蛋白的Nb 和生物素受體肽融合，原核表達(dá)并純化后體外連接生物素，建立了阻斷ELISA 檢測(cè)方法并用于豬流感血清學(xué)檢測(cè)，證實(shí)該方法敏感性強(qiáng)且生產(chǎn)成本低廉。Gao 等[22]通過酵母雙雜交技術(shù)篩選到7 株新城疫病毒 HN 蛋白的Nb，并證實(shí)這些篩選到的Nb 均可以特異性識(shí)別病毒和HN 蛋白，且具有抑制新城疫病毒血凝素活性的作用，其中的5 株VHH 抗體還具有一定的中和活性，可在感染早期抑制病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)增殖。Zhang 等[52]將前期篩選到的1 株針對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）nsp9 的Nb 和豬IgG Fc 融合，使用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出嵌合抗體 Nb6-pFc，并驗(yàn)證其可通過內(nèi)吞作用進(jìn)入PRRSV 靶細(xì)胞 PAM 細(xì)胞并發(fā)揮抗病毒作用，這為抗PRRSV 藥物開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。

通過免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)篩選到的特異性針對(duì)病原的Nb，是單體形式，易于改造，具有可標(biāo)記辣根過氧化物酶或生物素等物質(zhì)的特性，可以用來建立病原檢測(cè)方法；將Nb 和易感動(dòng)物IgG Fc 融合，延長(zhǎng)半衰期或以多價(jià)形式表達(dá)，可以成為抗病毒治療的有效方式。

5 小結(jié)

Nb具有相對(duì)分子質(zhì)量小、親和力強(qiáng)、穩(wěn)定性高、組織滲透性強(qiáng)、免疫原性低、生產(chǎn)周期短等特點(diǎn)，已在免疫、診斷、疾病治療、材料、結(jié)晶學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。通過噬菌體展示、酵母雙雜交等技術(shù)，能夠快速篩選到特異性的Nb，同時(shí)針對(duì)具有高度親和力的Nb，可以利用多種表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。每一種篩選方法和表達(dá)系統(tǒng)都各有優(yōu)缺點(diǎn)，沒有統(tǒng)一的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，在選擇篩選方式和表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，應(yīng)以實(shí)驗(yàn)室條件為基礎(chǔ)，充分了解篩選對(duì)象的結(jié)構(gòu)、功能和用途，根據(jù)不同目的選用合適的方法。

從免疫文庫(kù)中篩選Nb 仍然是首選。特異性Nb 在免疫文庫(kù)中較為豐富，但缺點(diǎn)是每一種新抗原都必須制備新的免疫文庫(kù)，因此有人開發(fā)了天然文庫(kù)，從非免疫庫(kù)快速篩選特異性Nb。而要確保文庫(kù)庫(kù)容多樣性，其前提是從不同的駱駝個(gè)體采集大量血液樣本。只有將文庫(kù)與篩選方式相結(jié)合，才能有效篩選到親和力高、特異性強(qiáng)的Nb。

原核表達(dá)是常用的Nb 表達(dá)系統(tǒng)，其操作相對(duì)簡(jiǎn)單、產(chǎn)量大、生產(chǎn)成本低，但要去除表達(dá)的重組蛋白內(nèi)毒素；酵母表達(dá)可以直接收集培養(yǎng)基上清純化，雜蛋白含量少，但可能存在過度糖基化問題；植物宿主可以大量表達(dá)Nb，但基因操作過程繁瑣，且分離純化Nb 也相對(duì)困難；利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)抗體是最常用的方式，但生產(chǎn)成本相對(duì)較高。近年來，Nb 已被應(yīng)用于動(dòng)物疫病診斷中，隨著對(duì)Nb研究的不斷深入，相信其在動(dòng)物疫病防治中將發(fā)揮重要作用。