納米抗體篩選和表達技術研究進展

朱 光，王譯晨，宋莎莎，張麥收，王加才

（1.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學院，山東濰坊 261061；2.濰坊市獸藥制劑研發(fā)重點實驗室，山東濰坊 261061）

傳統抗體由2 條重鏈和2 條輕鏈組成，其中重鏈包括1 個可變區(qū)（variable region of heavy chain，VH）和3 個 恒 定 區(qū)（constant region of heavy chain，CH），輕鏈包括1 個可變區(qū)（variable region of light chain，VL）和1 個恒定區(qū)（constant region of light chain，CL）。重鏈之間通過二硫鍵共價連接，輕鏈CL 區(qū)與重鏈CH1 結構域通過非共價作用連接形成穩(wěn)定的抗體分子。1993 年，Hamers-Casterman 等[1]偶然在駱駝血清中發(fā)現一種不同于傳統免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）的新型抗體。這類抗體天然缺失輕鏈和重鏈CH1，由CH2、CH3、鉸鏈區(qū)和重鏈可變區(qū)（variable domain of heavy chain of heavy-chain，VHH）組成，被稱為重鏈抗體（heavy chain antibodies，HCAbs），但其仍具有完全的抗原結合能力。盡管不清楚HCAbs 的進化優(yōu)勢，但研究人員已迅速認識到分離VHH 的重要性及其廣泛的適用性[2-3]。VHH 并非天然存在于駱駝血液中，它只是HCAbs N 端的可變區(qū)，又被稱為單域抗體（single domain antibody，sdAb）。sdAb 直徑約2.5 nm，高約4 nm，因結構簡單和尺寸小，也被稱為納米抗體（nanobody，Nb）。

Nb 由4 個框架區(qū)（framework regoin，FR）和3 個互補決定區(qū)（complementarity-determining region，CDR）構 成。VHH 的FR 與 人 類VH 有80%以上的序列同源性，且它們的三維結構可以重疊[4]。將Nb FR2 區(qū)第37、44、45 和47 位的4個疏水性氨基酸替換為親水性氨基酸，會有助于增強Nb 的溶解性和穩(wěn)定性[5]。盡管VHH 與VH 的氨基酸序列相似，但與VH 相比，VHH 只有3 個CDR 參與抗原結合，而傳統抗體有6 個CDR 決定抗原識別位點[6]，且VHH 的CDR3 平均長度為17個氨基酸殘基（人源VH 的CDR3 平均為12 個殘基），而較長的CDR3 既增加了作用表面積，又可以識別抗原表面的縫隙表位，但這些表位對傳統抗體的抗原性通常較低。CDR3 半胱氨酸可與CDR1或CDR2 半胱氨酸形成二硫鍵，從而增加VHH 的穩(wěn)定性[7]。

Nb 很容易被生產和改造，并且有良好的組織穿透性，其識別凹陷抗原位點的能力歸因于它們較小的尺寸以及較長的CDR3 環(huán)快速穿透縫隙表位的能力。另外，隨著現代分子生物學技術的發(fā)展，Nb 越來越多被用于靶向酶、跨膜蛋白或分子間相互作用研究，其在分子成像、診斷試劑、藥物靶向釋放和疾病治療方面具有潛在的應用前景。本文介紹了Nb 的特性、篩選技術和表達方式，以及在動物疫病診斷或治療方面的應用，以期為相關領域研究提供技術支持。

1 特性

1.1 相對分子質量小

Nb 相對分子質量為15 kDa，比傳統IgG（約150 kDa）及其片段Fab（約50 kDa）和scFv（約25 kDa）要小的多[8]，是目前已知的最小抗原結合單位，因此與IgG 及其片段相比，Nb 具有獨特的優(yōu)勢。

1.2 特異性和親和力高

不同于傳統抗體，Nb 盡管只有3 個CDRs，但其CDR3 比單克隆抗體的VH 結構域更長，從而表現出更強的特異性與親和力。另外，晶體學研究[9]表明，Nb 的抗原結合環(huán)具有更大的結構譜系。

1.3 可進一步改造加工

基于不同目的，通過基因重組技術將標記蛋白（如GFP 熒光蛋白、Luciferease 等）與Nb 融合表達有助于實時追蹤檢測，從而擴大其應用范圍；與單價Nb 相比，串聯表達多特異性Nb 可以同時靶向多種類型靶標，從而提高Nb 的特異性和親和力[10-11]。另外，經改造加工的嵌合抗體可顯著增強治療效果和延長半衰期。

1.4 穩(wěn)定性和可溶性高

Nb 在溶解度、耐熱和抗水解等方面都有獨特的優(yōu)勢。CDR3 的折疊和FR2 區(qū)域親水性氨基酸的含量使它們在水溶液中溶解度升高，且不易發(fā)生聚集[12]。Nb 構象穩(wěn)定且耐高溫，37 ℃存放1 周后仍保持抗原結合能力，90 ℃高溫孵育變性后不會聚集，待溫度冷卻后仍然可以折疊為天然構象，具有良好的可逆性[13]。此外，Nb 在極端的pH、蛋白酶及去垢劑存在的條件下均表現出高穩(wěn)定性。目前已經開發(fā)出了在細胞內表達的針對細胞內蛋白的重組Nb，在殺滅細胞內病原體或治療神經退行性疾病等方面作用顯著[14]；另外，抗水解和在極端條件下的強穩(wěn)定性使它們適合于口服給藥。同時，Nb 所具有的高穩(wěn)定性使其在診斷檢測方面擁有廣闊的應用前景[15]。

1.5 組織滲透性強和易清除

由于細胞間的被動擴散速率取決于分子大小，且與分子大小成反比，因此Nb 與傳統IgG 相比，其組織滲透性得到顯著提高，從而具有穿過血腦屏障的能力。Nb 可以靶向特定的腫瘤細胞表面，成為腫瘤靶向治療手段之一。Nb 相對分子質量小，在體內容易被清除，但可以通過添加聚乙二醇，與白蛋白Nb 偶聯或與常規(guī)抗體的Fc 片段融合等方法延長半衰期。然而，對于一些特定用途，Nb 能被腎臟快速代謝的特點避免了對機體的影響。

1.6 具有識別縫隙表位能力

抗體晶體學研究[16]表明，在大多數情況下，抗原結合表面為平面或凹陷面，但Nb 能結合到抗原的裂縫和凹槽中。VHH 的CDR1 區(qū)域具有更好的延展性且CDR3 區(qū)域暴露面積更廣，較長的CDR3 具有充當VL 的作用。這些結構變化使得Nb 既可以結合抗原表面，也使得Nb 具有結合傳統抗體所不能識別的抗原縫隙表位的能力。

1.7 免疫原性弱

Nb 相對分子質量小，其序列與人類VH 同源性高，且在體內能被快速清除的特點，決定了Nb的低免疫原性。

1.8 生產簡便

單克隆抗體作為一種多聚體蛋白，結構復雜，需要經過翻譯修飾后才具有生物學功能，因此適合在真核系統中表達。此外，單克隆抗體制備需要融合、亞克隆等復雜操作以及漫長的篩選和純化過程。而Nb 具有的優(yōu)勢決定了其生產的簡便性：（1）結構簡單，在沒有修飾以及Fc 結構域存在的情況下仍具有活性，適合在細菌和酵母中大量表達；（2）可以從展示文庫中通過高通量快速篩選獲得具有強特異性和高親和力的候選抗體分子。

2 篩選方法

2.1 噬菌體展示

噬菌體展示技術是將外源基因導入噬菌體載體，使其與噬菌體外殼蛋白融合表達并隨噬菌體組裝在其頭部完整展示的技術，是一種強大且實用的蛋白質分子相互作用研究工具[17-18]。

20 世紀90 年代初，噬菌體展示技術在特異性Nb 的淘選過程中得到廣泛應用[19]。1997 年，Arbabi 等[4]通過噬菌體展示技術篩選到了第1 株Nb。為了獲得特異性強、親和力高的抗體，一般要將抗原免疫駝科動物4～5 次，從而刺激機體產生成熟的靶向抗原特異性抗體。獲得特異性抗體的操作流程包括：采集外周血分離淋巴細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），提取RNA，逆轉錄合成cDNA；用巢式PCR 擴增VHH 基因并構建至噬菌體展示載體，轉化至大腸桿菌；利用輔助噬菌體使抗體展示于噬菌體表面，洗脫并擴增與靶抗原特異性結合的重組噬菌體，并通過大量擴增、沉淀、溶解等操作獲得重組噬菌體；經過3～5 輪生物富集篩選后，即可獲得特異性抗體。

獲得特異性Nb 的首個關鍵步驟是制備抗原免疫動物。但這種方法不僅繁瑣而且成本較高，也不適用于高致病性、毒性或免疫原性弱的抗原分子抗體篩選。Comor 等[20]報道了一種篩選技術，可最大限度減少實驗動物的使用。從未免疫的健康羊駝血液中分離PBMC，然后在體外與抗原孵育72 h，最后收集PBMC 提取總RNA，并通過噬菌體展示淘選Nb。這不僅大大降低了免疫動物所需成本，還避免了為獲得抗原特異性抗體而構建多樣化合成文庫的相關工作。同時體外條件下，包括細胞表面抗原在內的各種免疫原可以很容易致敏PBMC，并可在短時間內獲得抗原特異性Nb，這對通過體外免疫篩選Nb 有很好的指導意義。

2.2 酵母雙雜交

1989 年，Fields 建立了酵母雙雜交體系。該體系已被應用于真核細胞中基因轉錄研究。真核生物中有兩個獨立的結構域，可以特異性結合到基因上游的轉錄起始點。這兩個轉錄激活因子是相互獨立的，分別為BD 和AD。在酵母雙雜交系統中，構建一種已知的蛋白質基因序列和BD 結構域序列的重組載體，稱為“誘餌”；構建一個未知的蛋白基因序列和AD 結構域序列組成的載體，稱為“獵物”。如果誘餌和獵物之間沒有相互作用，BD 和AD 就不會被激發(fā)，報告基因也不能被激活和表達。在宿主細胞中，如果誘餌和獵物相互作用并且表達，那么BD 和AD 將與激活序列結合，下游報告基因也因此被激活表達[21]。酵母雙雜交技術在蛋白質相互作用研究中扮演著重要角色，已被廣泛應用于多個研究領域。

酵母雙雜交是從免疫文庫中篩選出高親和力Nb 的有效手段，其文庫構建與噬菌體展示過程基本相同。文庫篩選要先構建帶有抗原基因的誘餌質粒，然后將誘餌菌與文庫菌混合雜交，待雜交產物在顯微鏡下觀察到三葉草樣雜合體時，離心收集菌體涂布于選擇性平板，如菌落生長且發(fā)藍，則初步鑒定為陽性克隆；將文庫質粒與誘餌質粒一同轉化至感受態(tài)細胞中進行驗證，對共轉驗證陽性的質粒進行測序，即可得到特異性Nb 的核苷酸序列。Gao 等[22]通過酵母雙雜交技術成功得到了7 株抗新城疫病毒 HN 蛋白的Nb，經驗證7 株Nb 均可以特異性識別病毒和HN 蛋白，并且具有抑制新城疫病毒血凝素活性的作用，其中5 株 VHH 抗體還具有一定的中和活性，可在感染早期抑制病毒在宿主細胞上增殖。

2.3 mRNA 展示

通過體內展示篩選Nb 在一定程度上受轉化效率影響。mRNA 展示作為體外展示技術，具有篩選效率高、操作簡便等特點，其原理是通過共價鍵將核酸序列與其編碼的蛋白質連接起來，形成mRNA-蛋白質融合體。如圖1 所示，將dsDNA 文庫中的序列體外轉錄形成mRNA，模擬tRNA 氨基?；泥堰拭顾剡B接子進入核糖體A 位點，通過抑制蛋白質翻譯，使mRNA 的3'端與多肽的羧基端共價結合；利用肽鍵形成多肽鏈，最終得到mRNA-蛋白質融合體，實現了基因型和表型的結合[23]。通過標簽將mRNA-蛋白質融合體純化后，反轉錄形成cDNA-mRNA-蛋白質復合體，然后將其加入到包被有抗原的固相載體上，洗滌去除未結合的復合物；將特異性復合物從固相中洗脫下來，加酶使cDNA 脫離并利用PCR 擴增基因，TA 克隆后對序列進行分析。

圖1 mRNA 展示技術示意圖[26]

mRNA 展示技術共價結合非常穩(wěn)定，可以在嚴苛的抗原結合條件下進行，以確保篩選到高度特異、穩(wěn)定的結合對象[24]。例如全長的跨膜蛋白需要去垢劑進行溶解，并包含大量的疏水性區(qū)域。Doshi 等[25]首次通過mRNA 展示篩選到針對人類全長葡萄糖轉運蛋白GLUT-1 的Nb，其篩選過程只需要10 μg 純化的靶抗原以及20 μg 的mRNA，篩選的Nb 與抗原的平衡解離常數平均Kd 值為（22.3±11.5）nmol/L。

2.4 高通量測序和質譜分析

該方法基于對免疫抗原駱駝淋巴細胞VHH cDNA 文庫的高通量測序，并結合來自駱駝血清高親和力的VHH 區(qū)域質譜（MS）鑒定，直接從駱駝血清中識別高親和力的Nb 序列，因此不需要在體外構建展示文庫，省去了體外展示抗體的步驟，因而能快速篩選到大量針對特定抗原多個表位的Nb。

Fridy 等[27]從免疫的駱駝外周血提取淋巴細胞總RNA 并反轉錄為cDNA，然后進行巢式PCR擴增VHH 序列，再進行高通量測序并建立特異性抗體序列數據庫；通過抗原偶聯樹脂親和純化HCAbs，并用木瓜蛋白酶消化切割恒定區(qū)，洗脫回收親和力最高的VHH 片段；凝膠純化后的條帶經胰蛋白酶消化后，用液相色譜-質譜（LC-MS）和串聯質譜（MS）分析，在未構建展示文庫的條件下，通過該篩選方法，快速篩選到了針對綠色熒光蛋白（GFP）的高親和力Nb。

3 表達

對篩選得到的特異性Nb 序列需要進行表達，以便更好地研究其功能。

3.1 原核表達

利用大腸桿菌進行重組蛋白表達是目前實驗室最常用的表達方式。原核表達操作相對簡便、產量大、生產成本低，對細菌已經有廣泛的研究基礎，表達系統非常成熟。但原核表達也有一些缺點：大腸桿菌表達的重組蛋白帶有內毒素，對動物機體有害；大腸桿菌結構簡單，缺乏翻譯后修飾，從而影響蛋白功能。

Nb 不同于傳統抗體，沒有Fc 及其N 端寡糖，結構相對簡單，能利用原核系統表達。Nb 通常是在大腸桿菌細胞質完成組裝后分泌到周質中。與細胞質相比，周質更適合Nb 表達。它是氧化性區(qū)域并存在許多伴侶蛋白和異構酶，可以促進二硫鍵形成和蛋白正確折疊。大多數含有二硫鍵的蛋白首先在胞質中產生，然后借助N 末端前導序列并通過普通分泌途徑分泌到周質空間[28-29]。這樣就可以通過添加信號肽使Nb 分泌到周質，并利用滲透休克法增強外膜的通透性，使Nb 從周質中釋放，從而降低裂解細胞形成的雜蛋白含量，有利于得到高純度Nb。已有文獻[29]利用大腸桿菌周質間隙表達Nb，其中一些Nb 產量可以達到每升幾十毫克。但由于周質中伴侶蛋白含量相對較少，大部分的VHH 表達量仍處在較低水平，另外胞質Nb 的聚集和轉運似乎也是影響周質表達產量的因素。

與周質表達相比，胞質表達獲得的Nb 大多是以包涵體形式存在，通過完全變性再復性的方式能夠實現Nb 重折疊和二硫鍵形成。細胞質中有2 種硫氧還蛋白和3 種谷胱甘肽，在硫氧還蛋白還原酶和谷胱甘肽還原酶的作用下維持還原狀態(tài)，但硫氧還蛋白和谷胱甘肽在氧化狀態(tài)下能夠催化蛋白二硫鍵形成[30]。為了促進二硫鍵形成和正確折疊，已經開發(fā)了在硫氧還蛋白和谷胱甘肽還原途徑中有缺陷的雙突變菌株，例如Origami（Novagen）、Rosetta-gami（Novagen）[31-32]。

培養(yǎng)基成分對VHH 在大腸桿菌中的表達有重要影響?？紤]到培養(yǎng)基中相當高的細胞密度，使用營養(yǎng)更為豐富的EnPresso 和TB 培養(yǎng)基獲得的Nb產量比普通LB 培養(yǎng)基高5～10 倍[33]。此外，結合不同的純化方法可以提高純化效率和獲得率[34-35]，其他一些因素也可以影響VHH 產量，包括培養(yǎng)溫度、搖床速度和誘導濃度[36-37]。

3.2 酵母表達

酵母作為簡單的真核生物，能夠表達可溶、正確折疊和帶有簡單糖基化的外源蛋白，并分泌到培養(yǎng)基中。畢赤酵母是最成功的酵母表達系統之一。該酵母在高密度發(fā)酵中不積累有毒乙醇，也不像釀酒酵母那樣分泌大量內源蛋白至培養(yǎng)基。甲醇誘導型AOX1 啟動子調控嚴密，是畢赤酵母與其他系統相比最顯著的優(yōu)勢，適合于外源蛋白的高效表達。Rahbarizadeh 在2006 年首次使用畢赤酵母系統表達Nb，成功表達了2 個抗黏蛋白（MUC1）的Nb，并通過添加誘導劑和優(yōu)化一系列條件，使產量達10～15 mg/L。由于缺乏Fc，大多數VHH 不包含糖基化位點，然而大約10%的VHH 含有潛在糖基化位點，相對分子質量比預測的Nb（13～15 kDa）稍大[38]。Nb 糖基化可以增強VHH 的毒性和病毒中和能力[39]，但有時也會降低與抗原結合的能力[40-41]，其影響需要進一步研究，未來的研究應該盡可能減少不必要的糖基化。

3.3 哺乳動物細胞表達

哺乳動物細胞仍是生產功能性抗體的最佳表達系統，大多數治療性抗體都是利用哺乳動物細胞表達的。目前人類批準使用的單克隆抗體藥物都是由CHO、SP2/0、NSO 等細胞生產。一方面單抗生產需要真核細胞表達以保證其功能的完整性，另一方面哺乳動物細胞生產的抗體免疫原性小、安全性高。CHO 細胞生長周期短且能適應無血清培養(yǎng)基的懸浮培養(yǎng)，在搖瓶中表達Nb 的產量高達100 mg/L[42]；與CHO 細胞產生的穩(wěn)定表達相比，HEK-293 細胞通?？梢赃M行瞬時轉染表達，提供一些實驗室表達參數，但這些參數在早期階段需要進行鑒定，因此HEK-293 更適合在實驗室花費較少情況下進行前期表達條件摸索[43]。能有效促進正確翻譯后修飾的哺乳動物細胞是抗體表達中最廣泛使用的表達系統，但其生產成本比其他表達系統要高得多。

3.4 植物表達

植物細胞具有易轉化、高產量、安全，能夠進行翻譯后修飾等特點，是理想的蛋白表達宿主。植物表達系統能夠大量表達具有高親和力的VHH，且成本較低，這意味著植物細胞表達系統某種程度上可以替代哺乳動物表達系統。另外植物表達還具有其獨特特點——抗體在一些可食用植物組織中表達后可以口服[44]。通常植物中異源蛋白的表達有3 種方法：整合至基因組穩(wěn)定表達、瞬時轉染表達和質體基因組表達。通過農桿菌滲透法表達VHH 是最常用的方法[45]。煙草是最常見表達VHH 的植物，其表達VHH 的平均產量高達總可溶性蛋白的1%[46]，而擬南芥種子是表達口服VHH更方便的載體[47]。此外，其他植物生產系統，如水稻種子和馬鈴薯也成功表達了VHH。與基因組穩(wěn)定表達相比，使用病毒載體瞬時表達在某些情況下獲得了更高的產量[48-49]。

4 動物疫病防治中的應用

近年來，Nb 被廣泛應用于生物醫(yī)藥等領域，能夠特異性識別并結合生物分子，可作為特異性生物探針或醫(yī)藥載體，在人類疾病診斷和治療方面具有廣闊的應用前景，而在動物疫病防治中也有著巨大潛力。

Sheng 等[50]通過噬菌體展示技術篩選到9 株針對新城疫病毒NP 蛋白的Nb。他們將Nb 直接跟辣根過氧化物酶（HRP）融合表達，構建了真核表達載體，并轉染至HEK-293T 細胞表達，同時基于Nb-HRP 復合物，建立了cELISA 檢測方法。該cELISA 方法省時且敏感，可以在1 h 內完成檢測，并且比HI 試驗和市面上商品化試劑盒還要靈敏。Du 等[51]將篩選到的1 株針對豬流感病毒NP蛋白的Nb 和生物素受體肽融合，原核表達并純化后體外連接生物素，建立了阻斷ELISA 檢測方法并用于豬流感血清學檢測，證實該方法敏感性強且生產成本低廉。Gao 等[22]通過酵母雙雜交技術篩選到7 株新城疫病毒 HN 蛋白的Nb，并證實這些篩選到的Nb 均可以特異性識別病毒和HN 蛋白，且具有抑制新城疫病毒血凝素活性的作用，其中的5 株VHH 抗體還具有一定的中和活性，可在感染早期抑制病毒在宿主細胞內增殖。Zhang 等[52]將前期篩選到的1 株針對豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）nsp9 的Nb 和豬IgG Fc 融合，使用畢赤酵母表達系統表達出嵌合抗體 Nb6-pFc，并驗證其可通過內吞作用進入PRRSV 靶細胞 PAM 細胞并發(fā)揮抗病毒作用，這為抗PRRSV 藥物開發(fā)提供了理論基礎。

通過免疫學和分子生物學技術篩選到的特異性針對病原的Nb，是單體形式，易于改造，具有可標記辣根過氧化物酶或生物素等物質的特性，可以用來建立病原檢測方法；將Nb 和易感動物IgG Fc 融合，延長半衰期或以多價形式表達，可以成為抗病毒治療的有效方式。

5 小結

Nb具有相對分子質量小、親和力強、穩(wěn)定性高、組織滲透性強、免疫原性低、生產周期短等特點，已在免疫、診斷、疾病治療、材料、結晶學等領域得到廣泛應用。通過噬菌體展示、酵母雙雜交等技術，能夠快速篩選到特異性的Nb，同時針對具有高度親和力的Nb，可以利用多種表達系統實現高效表達。每一種篩選方法和表達系統都各有優(yōu)缺點，沒有統一的評價標準，在選擇篩選方式和表達系統時，應以實驗室條件為基礎，充分了解篩選對象的結構、功能和用途，根據不同目的選用合適的方法。

從免疫文庫中篩選Nb 仍然是首選。特異性Nb 在免疫文庫中較為豐富，但缺點是每一種新抗原都必須制備新的免疫文庫，因此有人開發(fā)了天然文庫，從非免疫庫快速篩選特異性Nb。而要確保文庫庫容多樣性，其前提是從不同的駱駝個體采集大量血液樣本。只有將文庫與篩選方式相結合，才能有效篩選到親和力高、特異性強的Nb。

原核表達是常用的Nb 表達系統，其操作相對簡單、產量大、生產成本低，但要去除表達的重組蛋白內毒素；酵母表達可以直接收集培養(yǎng)基上清純化，雜蛋白含量少，但可能存在過度糖基化問題；植物宿主可以大量表達Nb，但基因操作過程繁瑣，且分離純化Nb 也相對困難；利用哺乳動物細胞生產抗體是最常用的方式，但生產成本相對較高。近年來，Nb 已被應用于動物疫病診斷中，隨著對Nb研究的不斷深入，相信其在動物疫病防治中將發(fā)揮重要作用。