正交試驗(yàn)法優(yōu)選復(fù)方淫羊藿咀嚼片的提取工藝

牟 嬋，周若鵬，賴瀅瀅（.廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，廣州 50006；.廣州奇績(jī)醫(yī)藥科技有限公司，廣州 50663）

淫羊藿具有多種藥理作用[1]。研究表明，淫羊藿提取物能增加免疫球蛋白sIgA 和白介素（IL）-17 的分泌以及免疫細(xì)胞的數(shù)量從而增強(qiáng)免疫力[2]；淫羊藿多糖能提高機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫功能，刺激細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答[3]；淫羊藿總黃酮對(duì)免疫功能低下的小鼠有良好的免疫促進(jìn)作用[4]；淫羊藿苷通過誘導(dǎo)Th1型抗體以及調(diào)節(jié)固有免疫應(yīng)答中巨噬細(xì)胞中toll樣受體9的分泌可加強(qiáng)機(jī)體的免疫力[5-6]。而復(fù)方淫羊藿咀嚼片是根據(jù)中醫(yī)對(duì)亞健康辨證的觀點(diǎn)，從“君、臣、佐、使”理論出發(fā)，以淫羊藿為主的具有增強(qiáng)免疫力功能的中藥處方，方中淫羊藿作為君藥在增強(qiáng)免疫功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用。為優(yōu)選復(fù)方淫羊藿咀嚼片提取工藝，為其實(shí)際生產(chǎn)提供理論依據(jù)，從而為臨床提供質(zhì)量合格的制劑，筆者以淫羊藿苷、粗多糖、干膏得率為指標(biāo)，采用正交設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，現(xiàn)介紹如下。

1 材料

1.1 儀器

JM20002 型電子天平（余姚市紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司）；AUY-220型、AUW-220D型分析天平（廣州儀通興儀器儀表有限公司）；LC-20AT 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；800B 型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；DZTW 型調(diào)溫電熱套（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；UV756CRT 型紫外-可見分光光度計(jì)（上海佑科儀器儀表有限公司）。

1.2 藥材、藥品及試劑

淫羊藿、茯苓、女貞子等飲片（亳州市鴻泰藥業(yè)有限公司，批號(hào)均為1408001、1410001、1410002、1410003），經(jīng)廣州分析測(cè)試中心鑒定均符合2010 年版《中國(guó)藥典》（一部）要求；淫羊藿苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110737-200415，純度：供含量測(cè)定用）；葡聚糖對(duì)照品（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：00269，純度：供含量測(cè)定用）；乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；水為屈臣氏蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取工藝

精密稱取處中淫羊藿、茯苓、女貞子等藥材共18 份（正交試驗(yàn)共9 組，每組2 份），每份320 g，其中淫羊藿40 g，加水提取。分別取各組提取液10 ml，加水稀釋并定容至100 ml，得1～18號(hào)樣品溶液，供檢測(cè)。

2.2 樣品溶液中淫羊藿苷的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：InertSustain C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（28∶72）；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20 μl。

2.2.2 淫羊藿空白溶液的制備 稱取處方中除淫羊藿以外的其余各藥材，加入10倍量水，回流提取3次，每次2 h，提取液濾過，合并濾液。取濾液10 ml，加水稀釋并定容至100 ml，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過即得。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密稱取干燥的淫羊藿苷對(duì)照品適量，置于50 ml 量瓶中，加甲醇超聲溶解，定容至刻度，制備成含淫羊藿苷0.332 5 mg/ml的對(duì)照品貯備液。分別取上述貯備液0、2、4、6、8、10 ml，置于10 ml 量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過。分別取20 μl，注入液相色譜儀中測(cè)定峰面積。以峰面積（y）對(duì)淫羊藿苷質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y＝38 832 934.01x－17 303.4（r＝0.999 0）。結(jié)果表明，淫羊藿苷檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為20.8～332.5 μg/ml；定量限為20.8 μg/ml。

2.2.4 精密度、穩(wěn)定性、回收率試驗(yàn) 按相關(guān)方法進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果，精密度試驗(yàn)中RSD為0.96%（n＝6）；穩(wěn)定性試驗(yàn)中峰面積的RSD為1.04%（n＝6），供試品溶液在48 h內(nèi)基本穩(wěn)定；平均回收率為99.04%，RSD為1.14%（n＝6）。

2.2.5 專屬性考察 分別吸取淫羊藿苷對(duì)照品溶液、供試品溶液（正交試驗(yàn)6號(hào)）、淫羊藿空白溶液各20 μl，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，淫羊藿苷對(duì)照品溶液、供試品溶液在16 min 左右出現(xiàn)淫羊藿苷特征吸收峰，而淫羊藿空白溶液在此處無干擾；淫羊藿苷與相鄰雜質(zhì)峰的分離度大于1.5；理論板數(shù)按淫羊藿苷峰計(jì)大于1 500。以上表明方法專屬性良好，詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.供試品溶液；B.對(duì)照品溶液；C.空白溶液；1.淫羊藿苷Fig 1 HPLC chromatogramsA.sample solution；B.control solution；C.blank solution；1.icariin

2.2.6 樣品中淫羊藿苷含量測(cè)定及提取率計(jì)算 吸取“2.1”項(xiàng)下1～18 號(hào)樣品溶液2 ml，過0.45 μm 濾膜，精密吸取20 μl 注入色譜儀，測(cè)定。記錄淫羊藿苷峰面積，由回歸方程得到樣品液中淫羊藿苷的質(zhì)量濃度，計(jì)算淫羊藿苷的提取率（提取液中淫羊藿苷的量/藥材干品中淫羊藿苷的量×100%）。

2.3 樣品溶液中粗多糖含量測(cè)定[7]

2.3.1 葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)液的制備 精密稱取葡聚糖對(duì)照品10 mg，置于100 ml 量瓶中，加水溶解并定容至刻度，混勻，即得0.1 mg/ml葡聚糖對(duì)照液。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 采用硫酸-苯酚法。精密吸取葡聚糖對(duì)照液0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 ml，分別置于25 ml 比色管中，準(zhǔn)確補(bǔ)充水至2.0 ml，加入50 g/L 苯酚溶液1.0 ml，在振蕩器上混勻，加入濃硫酸10.0 ml，于振蕩器上小心混勻，置于沸水浴中煮沸2 min，冷卻。以試劑為參比，用分光光度法在450～550 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果在485 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。選定該波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，以葡聚糖質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)、吸光度（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y＝0.148x－0.001（r＝0.999 0）。結(jié)果表明，葡聚糖檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為12.8～128.0 μg/ml。

2.3.3 精密度、回收率試驗(yàn) 按相關(guān)方法進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果，精密度試驗(yàn)的RSD≤2.09%（n＝6）；平均回收率為96.04%（RSD＝2.27%，n＝6）。

2.3.4 樣品溶液中粗多糖含量測(cè)定 精密吸取“2.1”項(xiàng)下1～18 號(hào)樣品溶液各2 ml，置于10 ml 離心管中，加入無水乙醇8 ml，混勻5 min，以3 000 r/min（離心半徑6.6 cm）離心5 min，棄去上清液。殘?jiān)?0%乙醇溶液適量洗滌，離心后棄上清液，反復(fù)3～4次操作。殘?jiān)?.0 ml水溶解，混勻，加入100 g/L氫氧化鈉溶液2.0 ml、銅試劑溶液2.0 ml，沸水浴中煮沸2 min，冷卻后以3 000 r/min離心5 min，棄去上清液。殘?jiān)孟礈煲哼m量洗滌，離心，棄去上清液，反復(fù)3次操作。殘?jiān)?00 ml/L硫酸溶液2.0 ml溶解并轉(zhuǎn)移至50 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻。此溶液為試樣測(cè)定液。精密吸取試樣測(cè)定液2.0 ml置于25 ml比色管中，加入50 g/L苯酚溶液1.0 ml，在振蕩器上混勻后，加入濃硫酸10.0 ml 后于振蕩器上小心混勻，置于沸水浴中煮沸2 min，冷卻至室溫。用分光光度法在485 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，計(jì)算試樣中水溶性粗多糖含量，同時(shí)做試樣空白試驗(yàn)。對(duì)照品溶液、正交試驗(yàn)6號(hào)樣品溶液的紫外吸收光譜圖見圖2。

圖2 紫外吸收光譜圖A.對(duì)照品；B.供試品Fig 2 UV absorption spectrumA.substance control；B.test sample

2.4 浸膏得率測(cè)定[8]

精密吸取1～18號(hào)樣品濾液30 ml，至已恒質(zhì)量的坩堝中，水浴蒸干后，105 Ⅹ烘3 h，冷卻，精密稱定，計(jì)算浸膏得率（浸膏質(zhì)量/藥材質(zhì)量×100%）。

2.5 正交試驗(yàn)及其結(jié)果

2.5.1 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素初篩試驗(yàn)結(jié)果，分別確定加水倍量（加水體積∶藥材質(zhì)量）（A）、提取時(shí)間（B）、提取次數(shù)（C）為因素，每個(gè)因素各取3 個(gè)水平，按L9（34）正交試驗(yàn)安排用水進(jìn)行回流提取，提取液過濾后合并。因素與水平見表1。

表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels

按照表L9（34）正交設(shè)計(jì)安排試驗(yàn)，評(píng)價(jià)指標(biāo)為粗多糖含量、淫羊藿苷提取率、浸膏得率，綜合評(píng)分＝（粗多糖含量/粗多糖最大含量×0.4+淫羊藿苷提取率/淫羊藿苷提取率最大值×0.35+得膏率/得膏率最大值×0.25）×100。正交試驗(yàn)安排與結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 正交試驗(yàn)安排與結(jié)果Tab 2 Design and results of orthogonal test

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Analysis result of variance

由表2、表3可知，各因素影響程度順序?yàn)镃＞B＞A，提取次數(shù)影響最大，其次是提取時(shí)間，最后為加水倍量；正交試驗(yàn)顯示最優(yōu)工藝為A1B3C3。由方差分析可知，C因素各水平對(duì)粗多糖含量、淫羊藿苷轉(zhuǎn)移率和得膏率有顯著性影響（P＜0.01），選擇C3為最優(yōu)；B 因素各水平對(duì)指標(biāo)成分含量影響有區(qū)別（P＜0.1），選擇B3為最優(yōu)；A因素則對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的影響較小，從工業(yè)化生產(chǎn)角度考慮，減少提取溶劑可有效降低成本，故選擇A1水平。由此確定最優(yōu)工藝為A1B3C3，即：稱取處方量藥材，加入6倍量的水，微沸回流提取3次，每次2 h。

2.5.2 驗(yàn)證試驗(yàn) 精密稱取3 批干燥的處方各藥材共320 g，按最優(yōu)工藝條件平行操作，測(cè)定粗多糖含量、淫羊藿苷轉(zhuǎn)移率、干膏得率，結(jié)果見表4。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab 4 Results of validation test

結(jié)果表明，用最優(yōu)工藝條件提取，提取物中粗多糖含量、淫羊藿苷轉(zhuǎn)移率均較高，且高于其他各正交試驗(yàn)值；綜合評(píng)分均值99.69，也高于正交試驗(yàn)中最高值；且各指標(biāo)3 次試驗(yàn)的RSD均≤0.55%，故所選最優(yōu)工藝條件合理、穩(wěn)定性較好。

3 討論

采用多指標(biāo)并經(jīng)正交試驗(yàn)綜合平衡后所得的工藝條件，能根據(jù)實(shí)際需要并兼顧到各指標(biāo)的理化性質(zhì)[9]。本試驗(yàn)以粗多糖含量、淫羊藿苷提取率、干膏得率為指標(biāo)，經(jīng)綜合平衡后選擇最優(yōu)工藝，兼顧到粗多糖為本方中君臣佐藥中所含的增強(qiáng)免疫力的主要成分，在綜合評(píng)分中權(quán)重系數(shù)為0.4；淫羊藿苷為君藥淫羊藿主要成分，評(píng)分時(shí)權(quán)重系數(shù)為0.35，以保證所選工藝對(duì)臣藥主要成分的提取率；干膏得率權(quán)重系數(shù)為0.25，以控制所選工藝所得干膏量適當(dāng)，便于控制日服用量。

在選擇提取溶劑時(shí)，根據(jù)各指標(biāo)成分的理化性質(zhì)，分別以水和50%乙醇為提取溶劑，在同等條件下考察粗多糖含量、淫羊藿苷提取率及得膏率。在前期試驗(yàn)中，選用不同溶劑提取時(shí)，粗多糖含量以水提取時(shí)為16.65 mg/g，以50%乙醇提取時(shí)為4.37 mg/g；淫羊藿苷提取率以水提取時(shí)為87.21%，以50%乙醇提取時(shí)為94.33%；浸膏得率以水提取時(shí)為27.48%，以50%乙醇提取時(shí)為30.17%。根據(jù)以上對(duì)比試驗(yàn)，并考慮到粗多糖以水為溶劑提取較以醇為溶劑提取率更高，以及能耗、成本等方面的因素，最后確定水為提取溶劑。

在對(duì)提取液中的淫羊藿苷進(jìn)行含量測(cè)定時(shí)，考察了不同流動(dòng)相對(duì)峰形的影響。流動(dòng)相采用乙腈-水（30∶70）時(shí)[8]，色譜峰峰形對(duì)稱，但保留時(shí)間過短，分離度不好；流動(dòng)相采用乙腈-水（26∶74）時(shí)[10]，色譜峰峰形對(duì)稱，但保留時(shí)間過長(zhǎng)；流動(dòng)相采用乙腈-水（28∶72）時(shí)色譜峰峰形對(duì)稱，分離效果佳，保留時(shí)間適中，故最終選用其為流動(dòng)相組成。

本試驗(yàn)方法操作簡(jiǎn)便，優(yōu)選出的提取工藝穩(wěn)定性好、可靠性強(qiáng)，可為進(jìn)一步開發(fā)利用該有效成分提供重要的試驗(yàn)基礎(chǔ)。

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