右美托咪定對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖及分泌IL-6、TNF-α的影響

張歡歡

（廣州市婦女兒童醫(yī)療中心麻醉與圍手術(shù)科，廣東 廣州 510120）

據(jù)統(tǒng)計(jì)，約有70%的卵巢癌患者病情會(huì)在治療后2 年內(nèi)復(fù)發(fā)，其5 年生存率僅為30%。罹患該病可嚴(yán)重威脅患者的生命和健康。在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞可分泌白細(xì)胞介素6（Interleukin-6，IL-6）及腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α），使其發(fā)生免疫逃避，進(jìn)而順利增殖和轉(zhuǎn)移[1-2]。右美托咪定（Dexmedetomidine，DEX）是一種新型的鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛藥物。相關(guān)的研究結(jié)果顯示，DEX 可抑制核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）通路的活性，從而減少細(xì)胞對(duì)IL-6 及TNF-α 的分泌量[3-5]。本文主要是探討DEX 對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖及分泌IL-6、TNF-α 的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取人卵巢癌SKOV3 細(xì)胞（購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)）作為研究對(duì)象。

1.2 方法

去掉SKOV3 細(xì)胞原有培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加入胰蛋白酶- 乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）消化液，使瓶底的細(xì)胞浸入液體中。蓋好瓶蓋。使用顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)的變化。在貼壁細(xì)胞逐漸變成圓形時(shí)，加入培養(yǎng)液終止消化，并使用吸管將其吹打成懸液，放入新的培養(yǎng)瓶中，在37℃的溫度下培養(yǎng)。第二天觀(guān)察細(xì)胞貼壁的情況。在DMEM 標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基（購(gòu)于Gibco，Gaithersburg，MD，USA）中加入濃度為10% 的胎牛血清（購(gòu)于Gibco，Gaithersburg，MD，USA）。將細(xì)胞放入培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將培養(yǎng)基放入保溫箱，使保溫箱中含有濃度為5% 的二氧化碳，將保溫箱內(nèi)的溫度設(shè)置為37℃，培養(yǎng)至第三代細(xì)胞。將第三代細(xì)胞接種于12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（每孔作為1 個(gè)培養(yǎng)基），每孔接種1×104 個(gè)細(xì)胞，共接種100 個(gè)培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h 后，在顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞的形態(tài)和增殖的情況。將細(xì)胞生長(zhǎng)良好的80 個(gè)培養(yǎng)基隨機(jī)分為對(duì)照A 組、D1 組、D2 組和D3 組，每組各有20 個(gè)培養(yǎng)基。不在對(duì)照A 組培養(yǎng)基中加入DEX，在D1 組培養(yǎng)基中加入0.5 ng/mL 的DEX，在D2 組培養(yǎng)基中加入0.75 ng/mL 的DEX，在D3 組培養(yǎng)基中加入1 ng/mL 的DEX。繼續(xù)培養(yǎng)5 d。

1.3 觀(guān)察指標(biāo)

每24 h 使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑（Cell Counting Kit-8，CCK-8）檢測(cè)一次SKOV3 細(xì)胞的增殖活性，并計(jì)算SKOV3細(xì)胞增殖的抑制率。培養(yǎng)結(jié)束后，收集各組培養(yǎng)基的上層清液。使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)各組培養(yǎng)基上層清液中IL-6 及TNF-α的含量。使用TRIzol 試劑處理細(xì)胞，然后使用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)各組培養(yǎng)基NF-κB mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

對(duì)本次研究中的數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用百分比（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以P＜0.01 為差異具有高度的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組培養(yǎng)基中SKOV3 細(xì)胞的增殖抑制率

與對(duì)照A 組培養(yǎng)基相比，D1 組、D2 組及D3 組培養(yǎng)基中SKOV3 細(xì)胞的增殖抑制率均較高，P＜0.05 ；且D3 組培養(yǎng)基中SKOV3 細(xì)胞的增殖抑制率高于D1 組及D2 組培養(yǎng)基，P＜0.01。詳見(jiàn)表1。

表1 各組培養(yǎng)基中SKOV3 細(xì)胞的增殖抑制率（%，± s ）

表1 各組培養(yǎng)基中SKOV3 細(xì)胞的增殖抑制率（%，± s ）

注：* 與對(duì)照A 組相比，P ＜0.05 ；與D1 組、D2 組相比，P ＜0.01。

分組 第1 天 第2 天 第3 天 第4 天 第5 天對(duì)照A 組（n=20） 0 0 0 0 0 D1 組（n=20） 4.10±1.48* 4.95±1.57* 6.36±1.69* 7.55±1.85* 7.95±2.26*D2 組（n=20） 4.90±1.74* 5.70±1.98* 7.06±1.86* 8.15±2.03* 8.05±2.09*D3 組（n=20） 20.0±6.26*# 21.35±5.95*# 35.05±2.58*# 39.6±3.20*# 44.90±5.22*#

2.2 各組培養(yǎng)基上層清液中TNF-α 及IL-6 的含量

與對(duì)照A 組培養(yǎng)基相比，D1 組、D2 組及D3 組培養(yǎng)基上層清液中IL-6 及TNF-α 的含量均較低，P＜0.01。詳見(jiàn)表2。

表2 各組培養(yǎng)基上層清液中TNF-α 及IL-6 的含量（pg/mL，± s）

表2 各組培養(yǎng)基上層清液中TNF-α 及IL-6 的含量（pg/mL，± s）

注：* 與對(duì)照A 組相比，P ＜0.01。

分組 TNF-α IL-6對(duì)照A 組（n=20） 22.05±1.50 15.5±1.0 D1 組（n=20） 15.50±1.05* 8.4±1.05*D2 組（n=20） 9.21±0.89* 7.25±0.79*D3 組（n=20） 5.95±1.36* 3.15±1.04*

2.3 各組培養(yǎng)基NF-κBp65mRNA 的相對(duì)表達(dá)量

D1 組 及D2 組 培 養(yǎng) 基NF-κBp65mRNA 的 相 對(duì) 表 達(dá)量比對(duì)照A 組培養(yǎng)基低，P＜0.05。D3 組培養(yǎng)基NF-κB p65mRNA 的相對(duì)表達(dá)量比對(duì)照A 組培養(yǎng)基低，P＜0.01。詳見(jiàn)圖1。

圖1 各組培養(yǎng)基NF-κB p65mRNA 的相對(duì)表達(dá)量

3 討論

腫瘤微環(huán)境是指腫瘤細(xì)胞生成和存活的環(huán)境，其中不僅包含腫瘤細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞和炎性細(xì)胞等各種細(xì)胞，還包含細(xì)胞間質(zhì)及促炎因子[2]。在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞可通過(guò)分泌IL-6 及TNF-α 來(lái)逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視和攻擊，從而順利地增殖和轉(zhuǎn)移。目前臨床上常使用手術(shù)治療卵巢癌。國(guó)內(nèi)外的多項(xiàng)研究證實(shí)，卵巢癌患者血清IL-6 及TNF-α 的水平與其術(shù)后病情復(fù)發(fā)及癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)。與未使用IL-6 及TNF-α 拮抗劑進(jìn)行治療的患者相比，術(shù)后使用IL-6 及TNF-α 拮抗劑進(jìn)行治療的患者病情復(fù)發(fā)率和癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移率均較低[1]。抑制癌細(xì)胞分泌IL-6 及TNF-α 是近年來(lái)預(yù)防癌癥復(fù)發(fā)和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的新靶點(diǎn)。本次研究中，我們?cè)诟鹘MSKOV3 細(xì)胞培養(yǎng)基的上層清液中均檢測(cè)到了IL-6 及TNF-α。這說(shuō)明，卵巢癌細(xì)胞可釋放IL-6 及TNF-α。

既往的研究證實(shí)，DEX 可抑制肺泡、神經(jīng)及心肌細(xì)胞中NF-κB 通路的活性，從而抑制IL-6 及TNF-α 的釋放，且這種機(jī)制具有劑量依賴(lài)性[3-5]。還有一些研究結(jié)果證實(shí)，DEX 可抑制活化的NF-κB 進(jìn)入細(xì)胞核，阻止已進(jìn)入細(xì)胞核的NF-κB 與受體相結(jié)合，進(jìn)而減少細(xì)胞釋放TNF-α及IL-6[3-5]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，DEX 可通過(guò)抑制卵巢癌小鼠p38MAPK/NF-κB 通路的活性來(lái)減少促炎因子的釋放，從而防止癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[1]。我們結(jié)合本次研究的結(jié)果推測(cè)：DEX 可能通過(guò)抑制卵巢癌細(xì)胞NF-κB 的活性來(lái)減少卵巢癌細(xì)胞對(duì)TNF-α 及IL-6 的分泌量。但不能排除NF-κB活性降低、TNF-α 及IL-6 釋放量的減少是因癌細(xì)胞數(shù)量減少所致。DEX 降低卵巢癌細(xì)胞增殖的機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。本次研究為離體實(shí)驗(yàn)，DEX 降低卵巢癌細(xì)胞增殖的臨床效果有待進(jìn)一步證實(shí)。

本次研究的結(jié)果證實(shí)，DEX 可能通過(guò)某種機(jī)制抑制離體卵巢癌細(xì)胞的增殖和NF-κB 的活性，減少卵巢癌細(xì)胞對(duì)TNF-α 及IL-6 的分泌量。