不同形式殼聚糖基水凝膠的微觀結(jié)構(gòu)與控釋性能對(duì)比

梁剛強(qiáng)，項(xiàng)拓，梁妍，司徒文貝

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510640）

隨著人們生活水平的提高，功能食品備受人們的關(guān)注，其中活性蛋白由于具有調(diào)節(jié)人體生理作用、抗衰老、提高免疫力等功能，而備受關(guān)注[1,2]。但由于活性蛋白容易受人體消化道的消化酶、胃酸等降解，需要載體材料對(duì)其進(jìn)行保護(hù)，以提高其生物利用度。同時(shí)，水凝膠是一種具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的載體，可通過(guò)氫鍵、共價(jià)鍵等與活性蛋白結(jié)合，從而對(duì)其進(jìn)行保護(hù)[3]。天然來(lái)源的殼聚糖、淀粉、果膠等，具有形成水凝膠的能力，常被用于活性蛋白的包載及遞送[4]。

殼聚糖是自然界中唯一的聚陽(yáng)離子堿性多糖，擁有大量的游離氨基，化學(xué)性質(zhì)十分活潑，可引入其他基團(tuán)對(duì)其進(jìn)行修飾。通過(guò)巰基化改性的殼聚糖，由于二硫鍵的引入，增強(qiáng)了殼聚糖分子鏈間的作用力，對(duì)活性蛋白的控釋能力增強(qiáng)。巰基殼聚糖較之未改性的殼聚糖具有更好的細(xì)胞黏附性和滲透性，而且?guī)€基殼聚糖溶液在生理pH值下具有原位膠凝特性，因此非常適合用于藥物控釋的載體[5]。此外可以對(duì)殼聚糖進(jìn)行交聯(lián)改性，交聯(lián)改性殼聚糖具有一定的溶脹性能，可形成較容易被人們接受的水凝膠。三聚磷酸鈉和六偏磷酸鈉等無(wú)機(jī)試劑，無(wú)毒安全，常作為交聯(lián)劑，用于殼聚糖改性[6]。不同的改性方法可產(chǎn)生不同的殼聚糖微觀結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響水凝膠的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，同時(shí)也對(duì)活性蛋白的生物利用情況產(chǎn)生影響。

巰基化改性與離子交聯(lián)改性是常用的殼聚糖基水凝膠制備手段，在活性蛋白包埋遞送方面有大量研究，但前人較少對(duì)兩種水凝膠的結(jié)構(gòu)性質(zhì)差異進(jìn)行比較。為此，本文采用離子交聯(lián)及巰基化兩種不同方式對(duì)殼聚糖進(jìn)行改性，以牛血清白蛋白（BSA）為模型活性蛋白，制備殼聚糖基水凝膠，探討了pH值、殼聚糖與交聯(lián)劑的質(zhì)量比、BSA濃度等因素對(duì)兩種殼聚糖基水凝膠的包載性能影響，同時(shí)比較兩種殼聚糖基水凝膠的平均粒徑、Zeta電位、表面形貌、鏈結(jié)構(gòu)，探討兩種殼聚糖水凝膠在模擬消化道環(huán)境中對(duì)活性蛋白的控釋機(jī)理，為提高活性蛋白生物利用率提供依據(jù)，研究結(jié)果對(duì)蛋白類功能食品具有一定的促進(jìn)意義。

1 材料與方法

1.1 原料

殼聚糖（分子量150000 g/mol）：上?？笊锛夹g(shù)有限公司；三聚磷酸鈉（TPP）：天津市大茂化學(xué)試劑廠，分析純；鹽酸、氫氧化鈉、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）：廣州化學(xué)試劑廠，分析純；L-半胱氨酸、Ellman’s試劑：阿拉丁試劑上海有限公司，分析純；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDAC）、5,5',-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)，上海麥克林生化科技有限公司，分析純；冰醋酸，上海國(guó)藥公司，分析純；牛血清白蛋白，北京博奧拓達(dá)科技有限公司；透析袋（截留分子量范圍8000～12000 g/mol）：廣州市叢源儀器有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

冷凍干燥機(jī)（FDU-1200）：上海愛(ài)朗儀器有限公司；臺(tái)式高速離心機(jī)（H/T16MM）：湖南赫西儀器裝備有限公司；紫外分光光度儀：上海美譜達(dá)儀器有限公司；掃描電鏡（Verios 460）：Thermo Fisher公司；納米粒度及ZETA電位分析儀（Zetasizer Nano ZS 90）：馬爾文儀器有限公司；透射電鏡（型號(hào)Talos L120 G2）：Thermo Fisher公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 交聯(lián)殼聚糖及其載有活性蛋白的凝膠微粒的制備

稱量一定量的TPP和牛血清白蛋白（BSA），按一定的殼聚糖和交聯(lián)劑的質(zhì)量比稱取殼聚糖，把殼聚糖溶于不同pH的乙酸-乙酸鈉緩沖液，在磁力攪拌器攪拌的過(guò)程中把溶有交聯(lián)劑和BSA的溶液滴加到殼聚糖溶液中，磁力攪拌2 h，10000 r/min中離心30 min，得到載有活性蛋白的交聯(lián)殼聚糖凝膠微粒。同時(shí)，取上清液，通過(guò)BCA試劑盒測(cè)定、計(jì)算上清液中BSA的含量，進(jìn)而計(jì)算BSA的包封率。

未包載有活性蛋白的交聯(lián)殼聚糖按照上述步驟，不添加BSA進(jìn)行制備，其余條件不變，離心得到交聯(lián)殼聚糖后，經(jīng)冷凍干燥得到粉末。

1.3.2 巰基化殼聚糖及其載有活性蛋白的凝膠微粒的制備

精確稱量1.0000 g殼聚糖粉末，溶解在1%（V/V）醋酸溶液中，向其中加入EDAC和NHS溶液（比例3:1），使得最終溶液體積為100 mL，在室溫下避光攪拌15 min，使其充分反應(yīng)；隨后，按照向溶液中加入2.0 g半胱氨酸，然后加入1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至5～6，室溫避光反應(yīng)5 h。將反應(yīng)混合物裝入透析袋中，用5 mM的鹽酸透析兩次，以除去未反應(yīng)的L-半胱氨酸，用0.1 mol/L的NaCl溶液透析兩次，以減少陽(yáng)離子聚合物和陰離子巰基化合物之間的離子交換，再用1 mM鹽酸透析3 d，取出透析袋中的液體與-80 ℃中預(yù)凍一天，真空冷凍干燥，得到巰基化殼聚糖粉末。利用Ellman’s試劑法，對(duì)所得巰基化殼聚糖粉末進(jìn)行測(cè)定，所得的巰基化殼聚糖的巰基含量為558 μmol/g。

稱量一定量的TPP和BSA，按照質(zhì)量比稱取巰基化殼聚糖并溶于不同pH的乙酸-乙酸鈉緩沖液，磁力攪拌2 h，10000 r/min中離心30 min，取上清液，通過(guò)Bradford試劑盒的方法準(zhǔn)確測(cè)量上清液中BSA的含量。在595 nm處測(cè)定BSA的紫外吸光度值，代入相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算BSA濃度，按照下列公式，計(jì)算BSA的包封率。

式中：B為BSA的包封率，%；W0為稱取的BSA的質(zhì)量，g；At為上清液中BSA的濃度，g/L；Vt為上清液體積，L。

1.3.3 傅里葉紅外光譜分析

取適量改性殼聚糖粉末，與溴化鉀粉末混合并充分研磨，在20 MPa下壓片成型。稱取適量的待測(cè)樣品，將其在紅外光下照射干燥后，與KBr在研缽中充分研磨2～5 min，置于自動(dòng)壓片裝置中壓片后進(jìn)行測(cè)試。設(shè)置分辨率為4 cm-1，利用DTGS檢測(cè)器先掃去空氣的空白，掃描波數(shù)在4000～400 cm-1范圍內(nèi)，掃描64次后儀器取平均值顯示的即為測(cè)試樣品的紅外特征光譜圖。

1.3.4 形貌分析

取少量樣品置于相應(yīng)的緩沖液中，在40 MPa的條件下均質(zhì)，使其均勻分布在溶液中。進(jìn)行透射電鏡分析時(shí)，將溶液滴加在400目普通碳支持膜的電鏡銅網(wǎng)上，將樣品置于40～50 ℃的烘箱中進(jìn)行干燥處理后，滴加2%的磷鎢酸溶液進(jìn)行染色處理，90 s后將染色液吸干，靜置風(fēng)干。將銅網(wǎng)固定于樣品桿，置于電鏡，進(jìn)行樣品形貌觀察，拍照記錄。進(jìn)行掃描電鏡分析時(shí)，將溶液滴在導(dǎo)電膠上，靜置風(fēng)干后鍍金，置于電鏡，進(jìn)行樣品形貌觀察，拍照記錄。

1.3.5 平均粒徑分析

稱取一定量的載有活性蛋白的殼聚糖基凝膠微粒分別溶于不同pH值的緩沖液中，在40 MPa的條件下高壓均質(zhì)，使其均勻分布在溶液中，再取適量溶液潤(rùn)洗樣品池后加入待測(cè)樣品，將其置入測(cè)試槽中進(jìn)行測(cè)試，平衡2 min，溫度為25 ℃。采用粒度儀測(cè)定殼聚糖基凝膠微粒在不同pH值條件的平均粒徑大小及數(shù)量分布。

1.3.6 Zeta電位分析

稱取一定量的交聯(lián)殼聚糖凝膠微粒分別溶于不同pH值的緩沖液中，在40 MPa的條件下高壓均質(zhì)，使其均勻分布在溶液中，取適量溶液潤(rùn)洗帶電極的樣品池，再將樣品溶液用注射器注入樣品池中，確保樣品內(nèi)無(wú)氣泡，擦干電極部分，并保持干燥，將樣品池置入測(cè)試槽中，平衡2 min，采用Zeta電位分析儀測(cè)定殼聚糖基凝膠微粒在不同pH值條件下的Zeta電位。

1.3.7 載有活性蛋白的殼聚糖基凝膠微粒的體外模擬消化

參考相關(guān)文獻(xiàn)[7]，將上述制備的兩種微粒，置于200 mL溶出介質(zhì)中，在37 ℃、100 r/min條件下進(jìn)行攪拌，微粒在模擬人工胃液中運(yùn)轉(zhuǎn)2 h，然后在模擬小腸液中運(yùn)轉(zhuǎn)6 h，最后在模擬結(jié)腸液環(huán)境中運(yùn)轉(zhuǎn)42 h，并每隔一定時(shí)間對(duì)溶出介質(zhì)進(jìn)行取樣，取樣后的溶出介質(zhì)。取出的溶出液通過(guò)Bradford試劑盒測(cè)量其中BSA的含量，進(jìn)而得到殼聚糖基凝膠微粒在模擬消化過(guò)程中釋放曲線。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 21.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)差異性采用單因素方差分析處理，p＜0.05表示具有顯著差異，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

2 結(jié)果與討論

2.1 改性殼聚糖的鏈結(jié)構(gòu)分析

圖1 是未改性殼聚糖、交聯(lián)改性殼聚糖和巰基化改性殼聚糖的紅外光譜，未改性殼聚糖在3420 cm-1處的寬峰為羥基和氨基的伸縮振動(dòng)峰，是多糖特征峰。在2750～3000 cm-1附近為C-H伸縮振動(dòng)峰，1560～1650 cm-1為酰胺Ⅰ帶的-NH2振動(dòng)，1280～1450 cm-1為酰胺Ⅱ帶的-NH2振動(dòng)，1050 cm-1和1100 cm-1為C-OH的振動(dòng)峰[8]。與未改性殼聚糖相比，交聯(lián)改性殼聚糖在3400 cm-1附近的吸收譜帶變寬，說(shuō)明交聯(lián)后增加了殼聚糖的氫鍵作用力，1148 cm-1附近產(chǎn)生了典型的TPP振動(dòng)峰[9]，1070 cm-1附近產(chǎn)生了新峰，對(duì)應(yīng)于P=O的拉伸和變形，這表明殼聚糖分子鏈通過(guò)TPP發(fā)生了交聯(lián)[10]。而對(duì)于巰基化改性殼聚糖則在2570 cm-1附近有-SH的伸縮振動(dòng)峰，說(shuō)明改性后的殼聚糖中含有自由巰基[11]，在1380 cm-1和1480 cm-1處兩峰合并，說(shuō)明形成了更多的酰胺鍵。兩種不同的改性方式對(duì)殼聚糖分子鏈的影響，將影響后續(xù)殼聚糖水凝膠的各項(xiàng)性能。

圖1 不同殼聚糖材料的紅外光譜圖Fig.1 FT-IR of chitosan-based materials

2.2 不同因素對(duì)兩種殼聚糖基水凝膠的包載性能影響

2.2.1 pH值的影響

圖2 pH對(duì)殼聚糖基水凝膠蛋白包載率的影響Fig.2 Effect of pH on protein entrapment efficiency of chitosan-based hydrogel

如圖所示，交聯(lián)殼聚糖水凝膠的蛋白包載率隨著pH的增加呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，并在pH為5時(shí)達(dá)到最大值78.30%；巰基化殼聚糖水凝膠的蛋白包載率隨著pH的增加呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，并在pH為4.2時(shí)達(dá)到最大值77.54%。

在相同pH條件下，交聯(lián)殼聚糖水凝膠蛋白包載率受pH影響更加劇烈，最小包載率為16.97%，最大包載率為78.30%；巰基化殼聚糖水凝膠蛋白包載率受pH影響不大，包載率穩(wěn)定在72.04%～77.54%之間。參考有關(guān)文獻(xiàn)可知，酸性條件下，殼聚糖氨基與交聯(lián)劑離子基團(tuán)之間的靜電相互作用受到破壞，殼聚糖分子鏈中未參與交聯(lián)的氨基發(fā)生質(zhì)子化，氫鍵發(fā)生解離[12]，交聯(lián)殼聚糖凝膠穩(wěn)定性降低，蛋白包載率降低；而巰基化殼聚糖包載蛋白過(guò)程中，有部分牛血清蛋白與巰基化殼聚糖分子上的二硫鍵結(jié)合，從而形成凝膠[13]，因此凝膠穩(wěn)定性提高，在pH 3.8～5.4之間變化對(duì)其蛋白包載率影響不大。

2.2.2 殼聚糖與TPP質(zhì)量比的影響

如圖3所示，交聯(lián)殼聚糖水凝膠的蛋白包載率隨著CS:TPP質(zhì)量比的增加呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，并且在CS:TPP值為8時(shí)，包載率達(dá)到最大值為95.66%;巰基化殼聚糖水凝膠的蛋白包載率隨著CS:TPP值的增加呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，并且在CS:TPP值為8時(shí)。包載率達(dá)到最大值為71.07%。

圖3 CS:TPP質(zhì)量比對(duì)殼聚糖基水凝膠蛋白包載率的影響Fig.3 Effect of CS:TPP mass ratio on protein entrapment efficiency of chitosan-based hydrogel

在相同條件下，交聯(lián)殼聚糖水凝膠蛋白包載率受CS:TPP質(zhì)量比影響較大，最小包載率為10.88%，最大包載率為95.66%；巰基化殼聚糖水凝膠蛋白包載率受CS:TPP質(zhì)量比影響較小，蛋白包載率穩(wěn)定在62.12%～71.07%。參考有關(guān)文獻(xiàn)可知，因?yàn)榻宦?lián)劑中磷酸根離子可以與殼聚糖上的氨基結(jié)合，隨著交聯(lián)劑濃度的不同，交聯(lián)反應(yīng)程度不同，從而影響到蛋白的包載率[12]，而巰基化殼聚糖水凝膠受交聯(lián)劑影響小，因此蛋白包載率變化較小。

2.2.3 BSA濃度的影響

圖4 BSA濃度對(duì)殼聚糖基水凝膠蛋白包載率的影響Fig.4 Effect of BSA concentration on the encapsulation efficiency of chitosan-based hydrogel

如圖所示，交聯(lián)殼聚糖水凝膠的蛋白包載率隨著BSA濃度的增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，并且在BSA濃度為0.6 g/L時(shí)，包載率達(dá)到最大值為98.38%；巰基化殼聚糖水凝膠的蛋白包載率隨著BSA濃度的增大呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢(shì)，并且在BSA濃度為0.4 g/L時(shí)，包載率達(dá)到最大值為82.22%。在相同的BSA濃度下，交聯(lián)殼聚糖水凝膠蛋白包載率總是大于巰基化水凝膠。如前所述，巰基化殼聚糖包載蛋白過(guò)程中，部分蛋白以二硫鍵與巰基化殼聚糖結(jié)合形成凝膠，新生成的凝膠層對(duì)未參與反應(yīng)的殼聚糖鏈段的移動(dòng)形成阻礙，從而降低了活性蛋白的包載率。

綜合上述結(jié)果，pH值、CS:TPP質(zhì)量比以及BSA濃度對(duì)交聯(lián)殼聚糖水凝膠的蛋白包載率影響明顯。交聯(lián)殼聚糖水凝膠通過(guò)殼聚糖上的氨基與交聯(lián)劑中的磷酸基團(tuán)形成氫鍵，進(jìn)而包絡(luò)在活性蛋白外，而氫鍵容易受周圍環(huán)境中pH值、離子種類/強(qiáng)度等影響。因此，改變制備條件，交聯(lián)殼聚糖水凝膠的蛋白包載率變化明顯。而對(duì)于巰基化殼聚糖水凝膠，巰基的引入減少了殼聚糖上氨基的數(shù)目，避免了殼聚糖鏈段相互作用，可提高殼聚糖水凝膠穩(wěn)定，從而不易受到周圍環(huán)境的影響，后續(xù)水凝膠的電位分析結(jié)果將進(jìn)一步印證。

2.3 兩種殼聚糖基水凝膠的形貌分析

圖5 a為包載有BSA的交聯(lián)殼聚糖水凝膠的透射電鏡圖，圖片中淺灰色的物質(zhì)是交聯(lián)之后的殼聚糖，其中的黑色的顆粒為染色后的BSA，交聯(lián)后的殼聚糖水凝膠對(duì)BSA形成有效包埋。圖5b為包載有BSA的巰基化殼聚糖水凝膠的透射電鏡圖，載蛋白的巰基化殼聚糖水凝膠呈現(xiàn)球狀，與交聯(lián)殼聚糖水凝膠相比，BSA集中包載在水凝膠的中心，凝膠微粒結(jié)構(gòu)緊湊。這與巰基的引入、殼聚糖鏈段相互作用減少和巰基化殼聚糖水凝膠穩(wěn)定性提高有關(guān)。此外，圖5c和d分別為包載有BSA的交聯(lián)殼聚糖水凝膠和巰基化殼聚糖水凝膠的掃描電鏡圖，圖中兩種凝膠微粒呈球狀。另外，根據(jù)掃描電鏡配套軟件測(cè)定，交聯(lián)殼聚糖凝膠尺寸在830 nm左右，巰基化殼聚糖凝膠尺寸在150 nm左右。

圖5 兩種殼聚糖基水凝膠的透射電鏡圖（a，b）和掃描電鏡圖（c，d）Fig.5 Morphology of two chitosan-based hydrogelsby TEM (a,b) and SEM (c, d)

2.4 兩種殼聚糖基水凝膠的粒徑與表面電位

2.4.1 粒徑分析

圖6 為兩種殼聚糖基水凝膠在不同pH下的粒徑比較，從圖中可以看出交聯(lián)殼聚糖水凝膠的粒徑隨著pH的增大先增大后減小，pH為4時(shí)，粒徑最大為1085 nm。巰基化殼聚糖水凝膠的粒徑隨著pH的增大先減小增大，pH為8時(shí)，粒徑最大為4987 nm。結(jié)果與參考文獻(xiàn)的結(jié)果接近[14]。

圖6 兩種殼聚糖水凝膠在不同pH下的粒徑比較Fig.6 Comparison of the particle size of two chitosan-based hydrogels at different pH

2.4.2 Zeta電位

圖7 為兩種殼聚糖水凝膠在不同pH下的表面電荷比較，從圖中可以看出，交聯(lián)殼聚糖水凝膠表面電荷隨著pH的增大由正值變?yōu)樨?fù)值，當(dāng)pH為8時(shí)，表面電荷絕對(duì)值達(dá)到最大為8.29 mV。巰基化殼聚糖水凝膠表面電荷在強(qiáng)酸環(huán)境下，基本接近0，之后隨著pH的增大，表面電荷均變?yōu)樨?fù)值。

圖7 兩種殼聚糖水凝膠在不同pH下的表面電荷比較Fig.7 Comparison of the surface charges of two chitosan-based hydrogels at different pH

綜合圖6和圖7，不同pH條件下交聯(lián)殼聚糖凝膠平均粒徑和Zeta電位信息可知，當(dāng)pH=2.或3.0或4.0時(shí)，Zeta電位為正值，此時(shí)殼聚糖呈質(zhì)子化，易于與交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)。隨著pH的增加，BSA表面帶電荷越少，殼聚糖交聯(lián)所形成的凝膠層包覆在BSA表面，溶液中由于正負(fù)離子的Zeta電位減小，平均粒徑增加，這主要與BSA的等電點(diǎn)有關(guān)。當(dāng)溶液pH接近等電點(diǎn)時(shí)，BSA相互斥力減弱，包載后BSA的交聯(lián)殼聚糖凝膠微粒間相互聚集，從而增大平均粒徑。當(dāng)溶液pH遠(yuǎn)離等電點(diǎn)的時(shí)候，由于溶液離子間的斥力增加，交聯(lián)殼聚糖凝膠微粒間相互排斥，進(jìn)而降低平均粒徑[4]。

對(duì)于巰基化殼聚糖水凝膠，當(dāng)pH=3.0或4.0時(shí)，Zeta電位為正值，此時(shí)殼聚糖呈質(zhì)子化，巰基降低了質(zhì)子化氨基的排斥作用，使殼聚糖鏈變得柔順并收縮，有利于通過(guò)靜電作用形成球狀結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致了較小粒徑的形成。另外，巰基的引入減少了殼聚糖上氨基的數(shù)目，導(dǎo)致表面電勢(shì)的降低，而且?guī)€基在pH=5.3～5.6時(shí)能夠部分去質(zhì)子化形成S-，同樣引起了表面電勢(shì)的降低。當(dāng)pH為7.1或8.0時(shí)，溶液中OH-離子增加，與殼聚糖水凝膠中巰基互相排斥，造成粒子結(jié)構(gòu)松散，粒徑增大[15]。這也是在水凝膠制備過(guò)程中，pH值在酸性條件下變化對(duì)巰基化殼聚糖水凝膠蛋白包載率影響較小的原因。

2.5 兩種殼聚糖基水凝膠的消化性能比較

圖8 為兩種載有BSA的殼聚糖基水凝膠在體外模擬消化道中的釋放情況。其中，在模擬胃液中（運(yùn)轉(zhuǎn)2 h），BSA分別從交聯(lián)殼聚糖水凝膠和巰基化殼聚糖水凝膠中釋放了6.36%和5.73%；在模擬小腸液中（運(yùn)轉(zhuǎn)6 h），BSA分別從交聯(lián)殼聚糖水凝膠和巰基化殼聚糖水凝膠中釋放了44.76%和8.42%；在體外模擬消化結(jié)束時(shí)（運(yùn)轉(zhuǎn)41 h），BSA分別從交聯(lián)殼聚糖水凝膠和巰基化殼聚糖水凝膠中釋放的累積釋放率為50.34%和42.96%。

圖8 兩種殼聚糖基水凝膠在模擬人體消化道環(huán)境中的釋放情況Fig.8 Releasing proterty of two chitosan-based hydrogels in a simulated human digestive tract environment

對(duì)比兩種殼聚糖基水凝膠，交聯(lián)殼聚糖水凝膠在消化前2 h已經(jīng)出現(xiàn)突釋的現(xiàn)象，并持續(xù)到6 h后釋放速度減緩，上消化道釋放率達(dá)到44.76%，后續(xù)結(jié)腸部位僅有5.58%釋放；巰基化殼聚糖水凝膠在消化的前8 h內(nèi)釋放緩慢，釋放率僅為8.42%，轉(zhuǎn)運(yùn)至模擬結(jié)腸液（10 h后），釋放速度逐漸增加，呈現(xiàn)持續(xù)釋放的效果，約有34.53% BSA釋放在結(jié)腸中，與參考文獻(xiàn)研究結(jié)果接近[16]。其原因在于交聯(lián)殼聚糖水凝膠在胃液酸性環(huán)境下殼聚糖分子中氫鍵被破壞，BSA被快速釋放出來(lái)；而巰基化殼聚糖包載蛋白過(guò)程中，會(huì)有部分BSA與巰基化殼聚糖上的二硫鍵結(jié)合，而被包載到水凝膠骨架上（圖9），酸性環(huán)境下不被破壞，因此可以實(shí)現(xiàn)緩慢持續(xù)釋放。當(dāng)釋放環(huán)境轉(zhuǎn)變成偏中性的模擬小腸液（pH 6.8）和中性的模擬結(jié)腸液（pH 7.0），水凝膠中的巰基先經(jīng)質(zhì)子化形成S-，隨后由于溶液中OH-離子增加，而使得分子鏈段相互排斥，從而使所包載的蛋白質(zhì)釋放。水凝膠粒徑與zeta電位的結(jié)果也顯示，當(dāng)pH增大至7.0～8.0之間，巰基化水凝膠表面電位增加，粒徑增大，粒子結(jié)構(gòu)松散，這也將進(jìn)一步增大蛋白質(zhì)的釋放。

圖9 兩種殼聚糖基水凝膠對(duì)BSA包埋及控釋機(jī)理圖Fig.9 BSA embedding and controlled-releasing mechanism of two chitosan-based hydrogel

3 結(jié)論

本文采用離子交聯(lián)及巰基化兩種不同方式對(duì)殼聚糖進(jìn)行改性，制備不同形式的載有活性蛋白的殼聚糖基水凝膠，由于通過(guò)離子交聯(lián)形成氫鍵，pH值、CS:TPP質(zhì)量比以及BSA濃度等對(duì)交聯(lián)殼聚糖水凝膠的蛋白包載率影響明顯。而巰基的引入減少了殼聚糖上氨基的數(shù)目、在低pH環(huán)境，可降低殼聚糖上質(zhì)子化氨基的相互排斥作用，增加殼聚糖鏈段的柔順性，使得在酸性環(huán)境下，巰基化殼聚糖水凝膠具有較小的粒徑和較低的表面電勢(shì)。殼聚糖基水凝膠結(jié)構(gòu)的改變也影響其消化性能，其中交聯(lián)殼聚糖水凝膠在模擬胃液中已出現(xiàn)突釋現(xiàn)象，在運(yùn)送至結(jié)腸前，已有44.76%的活性蛋白釋放，而巰基化殼聚糖水凝膠在模擬上消化道展現(xiàn)良好的控釋性能，僅有8.42%的活性蛋白釋放，當(dāng)運(yùn)送至模擬結(jié)腸環(huán)境，釋放速度逐漸增加，呈現(xiàn)持續(xù)釋放的效果，約有30%的BSA逐漸釋放在結(jié)腸中，這對(duì)活性蛋白的生物利用改善具有重要作用。