固相萃取凈化HPLC法同時檢測荔枝皮中的幾種原花青素

覃國新，李慧玲，何潔，周其峰，勞水兵，閆飛燕，王靜，金茂俊，程亮，韋宇寧，王海軍，陳泳锨

（1.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與檢測技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)部甘蔗品質(zhì)監(jiān)督檢驗測試中心（南寧），廣西南寧 530007）（2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，北京 100081）

荔枝屬于無患子科常綠植物所結(jié)的果實，是我國亞熱帶特色水果之一，其工業(yè)化生產(chǎn)中主要以鮮果、罐頭、干果和干制品為主，荔枝皮作為其副產(chǎn)品并沒有得到合理有效的開發(fā)及利用，而通常將其當(dāng)做廢棄物丟棄，因此，以荔枝皮為原料提取原花青素，屬于廢物資源再利用。荔枝皮富含有原花青素[13-15]，其含量測定方法主要有鐵鹽催化比色法、香草醛法、紫外分光光度法等[16,17]。然而，以上方法測定的是原花青素單體及其多聚體的總量，且受干擾性較強，重復(fù)性較差，樣品前處理操作較繁瑣。采用固相萃取凈化以簡化繁瑣的樣品前處理應(yīng)用于色譜分析已相關(guān)文獻報道[18]；高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法具有選擇性好、分離效率高、測定相對準(zhǔn)確等特點，已有文獻報道用HPLC測定原花青素的主要單體和低聚物含量[19-21]，目前未見采用固相萃取凈化HPLC法同時測定荔枝皮原花青素中兒茶素、表兒茶素、沒食子酸、原花青素B2、原花青素B4和原花青素A2的相關(guān)報道，因此，本實驗采用采用固相萃取凈化HPLC法，對荔枝皮中原花青素主要單體和重要低聚物的含量進行了研究，該方法簡便，快速，準(zhǔn)確，可為深入挖掘我國豐富的荔枝資源副產(chǎn)品的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

荔枝皮市售荔枝（品種妃子笑）。

兒茶素對照品（純度98.5%）、表兒茶素對照品（純度98.8%）、沒食子酸對照品（純度95.9%）、原花青素B2對照品（純度98.9%）、原花青素B4對照品（純度95.0%）、原花青素A2對照品（純度96.5%），上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；甲醇、乙醇、冰乙酸（均為色譜純試劑），賽默飛世爾（中國）科技有限公司；水為自制蒸餾水；其余試劑為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters 2695高效液相色譜儀配置二級管陣列檢測器，美國waters公司；色譜柱Thermo Syncronis C18（250×4.6 mm，5 μm）；0.22 μm有機相微孔濾膜，美國waters公司；DS-1型高速組織搗碎機，上海標(biāo)模儀器廠；Oasis PRiME HLB固相萃取柱（3 cc，150 mg，2 mL，部件號186008717，使用前無需活化），沃特世科技（上海）有限公司。

1.3 實驗條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱為Thermo Syncronis C18（250×4.6 mm，5 μm）；柱溫35 ℃，流速1.0 mL/min，進樣量5.0 μL。流動相A：甲醇；流動相B：1.0%冰乙酸溶液。梯度洗脫程序為：0～2.0 min，10%～15% A；2.0～8.5 min，

15%～30% A；8.5～12.0 min，30%～85% A；12.0～14.0 min，85%～10% A；14.0～16.0 min，10% A。

1.3.2 對照品溶液的制備

public MyEventArgs(string oldState,string newState)

分別精密稱取兒茶素、表兒茶素、沒食子酸、原花青素B2、原花青素B4、原花青素A2對照品，置于10 mL棕色容量瓶中，用色譜純甲醇溶解定容，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為1000 mg/L的對照品儲備液，于冰箱中冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 樣品溶液的制備

采集新鮮荔枝，取其果皮，經(jīng)組織掏碎機掏碎，混勻，真空包裝得到荔枝皮原料，置于0～4 ℃冰箱中備用。準(zhǔn)確稱取上述制備好的荔枝皮原料5.0 g于100 mL塑料離心管中，加入50 mL 85%乙醇水溶液，放入30 ℃超聲波清洗儀中超聲提取30 min，然后，4000 r/min離心5 min，上層提取液轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，將殘渣重復(fù)上述操作提取，合并2次提取液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸至近干，用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，供Oasis PRiME HLB固相萃取柱凈化。

將Oasis PRiME HLB固相萃取柱（無需活化）安裝到預(yù)先清潔過的錐形瓶上，取2 mL上述溶液通過Oasis PRiME HLB柱并收集全部濾液，得到樣品溶液，過0.22 μm有機微孔濾膜，供HPLC測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

實驗考察了甲醇、乙醇、丙酮等有機溶劑提取待測物中的原花青素，并通過HPLC法對不同提取溶劑所得提取液中原花青素A2含量的測定來比較提取效果。按照料液比為1:20加入濃度為85%（V/V）的甲醇、乙醇和丙酮水溶液，按照1.3.3的方法進行提取，按1.3.1條件進行HPLC分析。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種溶劑的提取效果相差較小，但由于甲醇和丙酮的毒性均比乙醇高，鑒于質(zhì)量安全考慮，本實驗選擇乙醇作為最佳提取溶劑。且按照1.3.1色譜條件分析，所得色譜圖如圖1和圖2所示，圖1和圖2分別為標(biāo)準(zhǔn)品與荔枝皮基質(zhì)加標(biāo)的液相色譜圖，從圖中可以看出兒茶素、表兒茶素、沒食子酸、原花青素B2、原花青素B4、原花青素A2能達(dá)到很好的分離效果。

圖1 兒茶素、表兒茶素、沒食子酸、原花青素B2、原花青素B4、原花青素A2對照品（10.0 mg/L）的色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of catechin, epicatechin, gallic acid, procyanidin B2, procyanidinB4, procyanidin A2 standard(10.0 mg/L)

圖2 荔枝皮基質(zhì)加標(biāo)（加標(biāo)水平10.0 mg/kg）色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of litchi pericarp spiked at 10.0 mg/kg level

2.2 方法線性關(guān)系、檢測限和定量限

分別準(zhǔn)確移取6種對照品儲備液，用甲醇配制成濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間混合溶液；并用甲醇逐級稀釋標(biāo)準(zhǔn)中間混合溶液，配制得到0.5、1、5、10、50和100 mg/L系列的標(biāo)準(zhǔn)工作液。按1.3.1項色譜條件進行HPLC測定。以峰面積（Y）與對照品質(zhì)量濃度（X，mg/L）進行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果兒茶素、表兒茶素、沒食子酸、原花青素B2、原花青素B4、原花青素A2的線性方程見表1，相關(guān)系數(shù)均大于0.9998，6種化合物在0.5～100.0 mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。如圖1和圖2所示，以3倍信噪比所對應(yīng)待測物濃度來確定化合物的檢出限（LOD），以10

表1 兒茶素、表兒茶素、沒食子酸、原花青素B2、原花青素B4和原花青素A2的線性方程、相關(guān)系數(shù)Table 1 Linear equations and correlation coefficients for the determination of catechin, epicatechin, gallic acid, procyanidin B2, procyanidin B4 and procyanidin A2

倍信噪比所對應(yīng)的待測物濃度確定化合物的定量限（LOQ），本方法兒茶素、表兒茶素、沒食子酸、原花青素B2、原花青素B4、原花青素A2的樣品檢出限分別為0.52、0.55、0.35、0.45、0.95和0.65 mg/kg，定量限分別為1.26、1.64、0.95、1.35、2.80和1.45 mg/kg。

2.3 精密度實驗

取同一濃度（10 mg/L）對照品工作液，按5.0 μL進樣量，在HPLC上連續(xù)進樣6次，按1.3.1節(jié)色譜條件進行測定，兒茶素、表兒茶素、沒食子酸、原花青素B2、原花青素B4、原花青素A2峰面積的RSD分別為0.45%、0.35%、0.62%、0.55%、0.95%和0.75%，結(jié)果表明，本研究測定方法的精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性實驗

取同一加標(biāo)的供試品溶液，分別于0、2、4、8、12 h進樣，按1.3.1節(jié)色譜條件進行測定，測定兒茶素、表兒茶素、沒食子酸、原花青素B2、原花青素B4、原花青素A2峰面積的RSD分別為0.86%、0.75%、0.64%、0.78%、0.98%和0.69%，這表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 重復(fù)性實驗

取1.3.3制備好的荔枝皮原料6份，每份10.0 g，按1.3.3節(jié)方法提取樣品溶液，按1.3.1節(jié)色譜條件重復(fù)測定，求得兒茶素、表兒茶素、沒食子酸、原花青素B2、原花青素B4、原花青素A2的RSD值分別為1.02%、0.97%、1.24%、1.18%、1.28%和1.31%。結(jié)果表明，本研究的方法重復(fù)性良好。

2.6 回收率實驗

精密稱取6份荔枝皮原料，每份5.0 g，分別加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3.3節(jié)方法制備樣品溶液，按1.3.1節(jié)色譜條件進行測定，結(jié)果見表2。計算得到兒茶素、表兒茶素、沒食子酸、原花青素B2、原花青素B4、原花青素A2的平均回收率在83.00%～102.00%之間，RSD在0.48%～0.83%之間。說明本研究建立的兒茶素、表兒茶素、沒食子酸、原花青素B2、原花青素B4和原花青素A2測定方法準(zhǔn)確度高。

表2 6種化合物在荔枝皮基質(zhì)中的平均回收率及RSDTable 2 Average recoveries and precision of the 6 compounds spiked into litchi pericarp matrices (n=6)

2.7 實際樣品測定

從本地農(nóng)貿(mào)市場隨機購買10份荔枝（品種妃子笑），按1.3.3節(jié)方法提取樣品溶液，按1.3.1節(jié)色譜條件進行含量測定，分別測出兒茶素、表兒茶素、沒食子酸、和原花青素A2，且4種物質(zhì)的含量范圍分別為5.01～5.60、7.52～8.90、2.05～3.51、10.73～12.53 mg/kg，這一結(jié)果反映了荔枝皮原花青素主要單體和低聚物中以表兒茶素和原花青素A2的含量相對較高，這與文獻[13]報道相一致。結(jié)果顯示，荔枝皮中的原花青素主要以兒茶素、表兒茶素和原花青素A2的含量最高，這為我國豐富的荔枝資源副產(chǎn)品的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

3 結(jié)論

本文首次建立了固相萃取凈化/高效液相色譜法同時測定荔枝皮中兒茶素、表兒茶素、沒食子酸、原花青素B2、原花青素B4和原花青素A2的分析方法，本方法采用新型固相萃取技術(shù)，操作簡單快捷，樣品凈化液經(jīng)HPLC分離，外標(biāo)法定量，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于同時測定荔枝皮中兒茶素、表兒茶素、沒食子酸、原花青素B2、原花青素B4和原花青素A2檢測分析。