基于SERS技術(shù)快速檢測(cè)“瘦肉精”硫酸特步他林

李志成，鄭曉冬，劉雪梅，閆新煥，曹寧，周大森，宋燁

（中華全國(guó)供銷合作總社濟(jì)南果品研究院，山東濟(jì)南 250014）

“瘦肉精”是一類具有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)物質(zhì)的統(tǒng)稱，屬于苯乙醇胺類，都具有苯乙胺結(jié)構(gòu)，根據(jù)含取代基的不同可進(jìn)一步分為三種，即苯胺型、苯酚型和苯二酚型。硫酸特步他林（TS），又名間羥舒喘靈（分子式(C12H19NO3)2·H2SO4），屬于苯二酚型β受體激動(dòng)劑類物質(zhì)，是醫(yī)療領(lǐng)域用于治療哮喘、哮喘型支氣管炎以及慢性支氣管炎的有效藥物，由于和臭名昭著的瘦肉精鹽酸克侖特羅同屬于腎上腺素受體激動(dòng)劑類物質(zhì)，具有增加瘦肉率，降低骨骼肌脂肪含量的功效，因此被非法添加在動(dòng)物飼料中，消費(fèi)者食用該類飼料喂養(yǎng)的動(dòng)物產(chǎn)品后，會(huì)出現(xiàn)肌肉振顫、心慌頭疼、惡心嘔吐等不適癥狀，特別是對(duì)具有高血壓、心臟病、糖尿病、等基礎(chǔ)類疾病的消費(fèi)者危害更大，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。農(nóng)業(yè)部等國(guó)家部委先后下發(fā)文件，命令禁止使用β激動(dòng)劑類藥物作為獸藥和飼料添加劑，并加大了對(duì)鹽酸克侖特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇等常見(jiàn)瘦肉精的監(jiān)管力度，但受到利益驅(qū)使，仍有不法養(yǎng)殖戶違禁使用硫酸特步他林代替鹽酸克侖特羅加入飼料中企圖逃避監(jiān)管[1]。

目前，我國(guó)已制定發(fā)布β受體激動(dòng)劑檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)共14個(gè)。其中包括HPLC法（1項(xiàng)）、LC-MS/MS法（6項(xiàng)）、GC-MS法（6項(xiàng)）、ELISA法（1項(xiàng)）及膠體金試紙條法（1項(xiàng)）。其中液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）及氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS）是我國(guó)官方檢測(cè)β受體激動(dòng)劑的半確證和確證方法[2]，該方法雖然具有精密度高和靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，但樣品前處理方法較復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)，設(shè)備昂貴操作難度大[3]。難以滿足現(xiàn)場(chǎng)大量樣品的篩查要求。酶聯(lián)免疫法（ELISA）雖然可以在一定程度上克服上述缺點(diǎn)，但易受多種因素影響，出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，干擾檢測(cè)準(zhǔn)確性。

圖1 硫酸特步他林結(jié)構(gòu)式圖Fig.1 Structural diagram of terbutaline sulfate

SERS技術(shù)具有樣品制備前處理簡(jiǎn)單、便于攜帶、高通量、檢測(cè)快的特點(diǎn)，目前已經(jīng)在食品以及農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)中得到應(yīng)用。本文基于表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)（SERS）快速檢測(cè)水溶液、尿液中的硫酸特步他林，為瘦肉精的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)打下了良好的基礎(chǔ)。該方法重現(xiàn)性良好，檢測(cè)時(shí)間短，設(shè)備便于攜帶，檢測(cè)時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本低，能夠滿足牲畜養(yǎng)殖現(xiàn)場(chǎng)的快速篩查使用[4-6]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

OPAL-3000型便攜式拉曼光譜儀（激發(fā)功率400 mW，激發(fā)光785 nm，分辨率4.5 cm-1），英國(guó)Metage公司；透射電鏡（H7650），日本日立公司；電磁加熱攪拌器（最大轉(zhuǎn)速：1400 r/min；轉(zhuǎn)速精度：±1%）德國(guó)Heidolph MR Hei-End。

硫酸特步他林（TS）(C12H19NO3)2·H2SO4，99.9%，中國(guó)藥品生物制品檢定所；氯酸金（HAuCl4·4H2O，99.9%）、檸檬酸三鈉（Na3C6H5O7·2H2O，99.8%）、硝酸銀（AgNO3），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司。

1.2 金溶膠的制備

參考楊德紅[7]檸檬酸鈉還原法制備金溶膠的方法：準(zhǔn)確稱取10 mg氯金酸粉末，加入少量去離子水將其溶解，然后移至100 mL容量瓶中，再用去離子水定容至100 mL，制成濃度為10-4g/mL的氯金酸溶液備用。

將圓底燒瓶中加入氯酸金溶液25 mL。加熱圓底燒瓶，待氯金酸溶液沸騰后，緩慢添加170 mmol/L檸檬酸鈉溶液0.11 mL。滴加完成后繼續(xù)磁力攪拌使兩種物質(zhì)能夠充分反應(yīng)，保持加熱狀態(tài)使得溶液微沸20 min，待溶液顏色變?yōu)樽霞t色時(shí)停止加熱。制得的膠體金溶液置于4 ℃的冰箱里避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 銀溶膠的制備

參考許麗梅[8]等人的制備方法，精確稱取精確稱取36 mg的硝酸銀試劑，用去離子水定容至200 mL制成硝酸銀溶液，將配置好的硝酸銀溶液置于三孔圓底燒瓶?jī)?nèi)，在磁力攪拌器上不斷攪拌并將其加熱至微沸狀態(tài)?？焖偬砑? mL 1%檸檬酸鈉水溶液，保持沸騰狀態(tài)，繼續(xù)加熱攪拌60 min，然后冷卻至常溫待用。

1.4 樣品的制備

硫酸特步他林水溶液的制備：用去離子水溶解硫酸特步他林（TS）標(biāo)準(zhǔn)品配置成10 mg/mL水溶液，量取4 mL轉(zhuǎn)移至石英比色皿中。

尿液中硫酸特步他待測(cè)樣品的制備：準(zhǔn)確量取銀納米顆粒溶膠1 mL，和待測(cè)尿樣1 mL，置石英比色皿中，用稀硝酸調(diào)至pH 5.2，加入氯化鈉8.775 mg作為凝聚劑，分別加入濃度為1 mg/L、3 mg/L、5 mg/L、7 mg/L的硫酸特步他林水溶液2 mL配置成不同濃度梯度的硫酸特步他林尿液溶液待測(cè)樣。

1.5 光譜檢測(cè)與數(shù)據(jù)處理

拉曼光譜設(shè)置檢測(cè)條件為激光功率為400 mW，光譜范圍是500~2000 cm-1，掃描時(shí)間60 s，連續(xù)掃描3次獲得穩(wěn)定光譜。使用儀器配套的essential FTIR數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)得到的拉曼光譜進(jìn)行處理，獲得清晰的拉曼光譜圖并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.6 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線

經(jīng)過(guò)方法優(yōu)化后，在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，獲得梯度濃度的硫酸特步他林拉曼譜圖。以標(biāo)準(zhǔn)硫酸特步他林溶液的濃度為橫坐標(biāo)，表面增強(qiáng)拉曼光譜特征峰信號(hào)強(qiáng)度為縱坐標(biāo)建立線性回歸曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 金溶膠和銀溶膠的電鏡表征

從納米顆粒形態(tài)方面進(jìn)行觀察和分析，使用電子顯微鏡透射法（TEM）對(duì)所制備的金溶膠和銀溶膠進(jìn)行表征，觀察納米顆粒粒徑大小、形狀和分布情況。結(jié)果如圖3、圖4所示。結(jié)果顯示在20萬(wàn)倍電子顯微鏡放大條件下，金溶膠中顆粒形狀不如銀溶膠規(guī)則，金溶膠中既有球形顆粒也有棒狀顆粒的出現(xiàn)。銀溶膠顆粒主要呈球形，顆粒大小和分布較為均勻，顆粒直徑大多在30~40 nm之間，因此判斷銀溶膠有更好的吸附放大效應(yīng)。

圖3 銀溶膠透射電鏡圖Fig.3 TEM image of silver colloids

圖4 金溶膠紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖Fig.4 UV-Vis spectrum of gold colloidal

圖2 金溶膠透射電鏡圖Fig.2 TEM image of gold colloids

2.2 銀溶膠的紫外-可見(jiàn)吸收光譜

金屬納米粒子在紫外-可見(jiàn)吸收光譜中會(huì)發(fā)生共振這種共振現(xiàn)象具有產(chǎn)生紫外光譜帶間躍遷的特殊性質(zhì)，表現(xiàn)為紫外可見(jiàn)區(qū)出現(xiàn)特定的吸收峰。該吸收光譜的峰型與金屬顆粒的大小、形狀以及分布情況有關(guān)。最大紫外吸收峰的位置與納米顆粒的粒徑大小具有對(duì)應(yīng)關(guān)系，金屬納米顆粒的粒徑大小與吸收峰波長(zhǎng)的長(zhǎng)度正相關(guān)，即最大吸收峰波長(zhǎng)越長(zhǎng)說(shuō)明金屬顆粒的粒徑越大。這時(shí)因?yàn)榉肿榆壍滥芗?jí)之間的寬度即能隙會(huì)隨顆粒直徑的增大而減小決定的，粒徑越大在紫外-可見(jiàn)吸收光譜上的反應(yīng)是光吸收帶向短波方向移動(dòng)[9-11]。

峰型與峰寬則能反應(yīng)出納米顆粒溶膠的均勻性以及分別情況。一般來(lái)說(shuō)，半寬峰偏窄說(shuō)明粒子的粒徑分布也較窄，意味著納米顆粒大小較均勻。同時(shí)顆粒大小不均勻還會(huì)影響吸收譜線的形狀，反應(yīng)在形狀上為長(zhǎng)波長(zhǎng)方向出現(xiàn)吸收拖尾[12,13]。

圖4 是金溶膠的紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖。金溶膠的吸收峰在540 nm處說(shuō)明其金屬顆粒大于銀溶膠，與電鏡觀察結(jié)果一致。金溶膠的的吸收曲線對(duì)稱性不如銀溶膠，說(shuō)明粒子形狀不均勻，正如電鏡觀察的球型、棒狀顆粒對(duì)應(yīng)。金溶膠紫外-可見(jiàn)吸收光譜存在拖尾現(xiàn)象表示其顆粒均勻度不佳。

圖5 銀溶膠紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖Fig.5 UV-Vis spectrum of silver colloidal

通過(guò)觀測(cè)銀溶膠的紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖可以發(fā)現(xiàn)，銀納米顆粒溶膠在435 nm處出現(xiàn)紫外吸收峰，且該峰對(duì)稱性好，半峰寬較窄，無(wú)拖尾現(xiàn)象。說(shuō)明該溶膠大小較為均一，分布均勻。該結(jié)果與電鏡結(jié)果相互印證。因此最終選擇銀溶膠作為表面增強(qiáng)劑對(duì)硫酸特步他林進(jìn)行研究。

2.3 溶膠的穩(wěn)定性

通過(guò)對(duì)制備出的金屬溶膠進(jìn)行存放觀察實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，銀溶膠不耐保存，銀膠在室溫條件下3 d開(kāi)始出現(xiàn)顏色和形態(tài)改變，7~10 d內(nèi)沉降失活。銀溶膠在4 ℃冰箱冷藏存放21 d后產(chǎn)生沉淀現(xiàn)象。金溶膠性質(zhì)較為穩(wěn)定，在4 ℃的冰箱內(nèi)冷藏存放90 d顏色和形態(tài)沒(méi)有改變。這是由于制備過(guò)程中加入的檸檬酸三鈉中的檸檬酸根離子有三個(gè)羧基基團(tuán)對(duì)銀粒子的表面吸附作用遠(yuǎn)強(qiáng)于金粒子[14]。

金屬溶膠的存放溫度和時(shí)間對(duì)其穩(wěn)定性產(chǎn)生重要影響，常溫下金屬顆粒之間運(yùn)動(dòng)頻率高，產(chǎn)生碰撞的幾率大，導(dǎo)致出現(xiàn)聚集沉淀現(xiàn)象，不利于膠體的分散。存放時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致溶膠的穩(wěn)定性下降，產(chǎn)生自凝聚現(xiàn)象。因此，金溶膠能較長(zhǎng)時(shí)間保存，銀溶膠不易長(zhǎng)時(shí)間保存，制備后低溫保存盡快使用。

2.4 硫酸特步他林水溶液的拉曼光譜

設(shè)置檢測(cè)條件為激光功率400 mW，拉曼光譜掃描范圍500~2000 cm-1，掃描時(shí)間60 s，連續(xù)進(jìn)行3次，得到穩(wěn)定光譜。采用同樣條件獲得去離子水的穩(wěn)定拉曼光譜，結(jié)果如下：

圖6 硫酸特步他林水溶液拉曼光譜Fig.6 Terbutaline sulfate Raman spectroscopy

觀察發(fā)現(xiàn)硫酸特步他林水溶液的在800 cm-1、1050 cm-1、1330 cm-1、1450 cm-1、1630 cm-1處出現(xiàn)五個(gè)明顯的拉曼信號(hào)。去離子水在1630 cm-1處出現(xiàn)拉曼信號(hào)峰，因此扣除去離子水在1630 cm-1處出現(xiàn)拉曼信號(hào)，硫酸特步他林的拉曼信號(hào)峰應(yīng)為800 cm-1、1050 cm-1、1330 cm-1、1450 cm-1四處。其中800 cm-1、1450 cm-1、1050 cm-1三處是由β受體激動(dòng)劑類藥物分子共有特征結(jié)構(gòu)苯乙胺結(jié)構(gòu)存在導(dǎo)致，1330 cm-1處拉曼特征峰是由于硫酸特步他林苯環(huán)上的C=C鍵拉伸振動(dòng)引起的，可作為識(shí)別硫酸特步他林的特征峰進(jìn)行分析

[15,16]。

由圖7觀察可知，銀納米溶膠與β受體激動(dòng)劑混合后相比金納米溶膠混合產(chǎn)生更強(qiáng)的表面增強(qiáng)效果。這是因?yàn)樵诳梢?jiàn)光區(qū)內(nèi)，金納米的表面增強(qiáng)因子比銀納米的小，根據(jù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)銀納米溶膠與目標(biāo)分子結(jié)合后往往能產(chǎn)生更為強(qiáng)烈的共振現(xiàn)象，也就是說(shuō)銀溶膠與金溶膠相比具有更強(qiáng)的表面增強(qiáng)活性。這與已經(jīng)知道的金、銀溶膠放大其他待測(cè)物分子結(jié)果一致。說(shuō)明在通常條件下銀溶膠在與目標(biāo)分子結(jié)合后往往能表現(xiàn)出更強(qiáng)的放大效果，是更為合適的表面增強(qiáng)劑。

圖7 金、銀溶膠與TS溶液混合Fig.7 Gold, silver colloids add TS

2.5 尿液中硫酸特步他林的拉曼光譜檢測(cè)

拉曼光譜對(duì)尿液中硫酸特步他林的檢測(cè)無(wú)需前處理，測(cè)樣速度快，僅需后期在圖譜處理時(shí)扣除尿液拉曼信號(hào)的影響，圖8為尿液經(jīng)過(guò)離心后直接進(jìn)行拉曼光譜檢測(cè)的圖譜。

圖8 尿液拉曼光譜Fig.8 Raman spectra of urine

圖9 梯度濃度尿液中硫酸特步他林的SERSFig.9 SERS spectra of TS in urine

圖10 尿液中硫酸特步他林標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.10 Calibration curve of TS in urine

由圖8可知尿液僅在1005 cm-1附近出現(xiàn)拉曼特征峰，其他拉曼位移處無(wú)明顯拉曼特征峰，因此對(duì)檢測(cè)樣品干擾小，此時(shí)空白尿液在1005 cm-1附近出現(xiàn)的拉曼峰是由于尿液中尿素分子中C-N鍵伸縮振動(dòng)引起的。

對(duì)位于1330 cm-1處的特征峰強(qiáng)度硫酸特步他林尿液溶液濃度的變化進(jìn)行線性擬合。

尿液中硫酸特步他林的濃度與拉曼特征峰信號(hào)強(qiáng)度之間存在良好的線性關(guān)系，硫酸特步他林在濃度1~10 mg/L范圍內(nèi)，滿足回歸方程Y=843.75X+1223.80，相關(guān)系數(shù)為R2=0.97。

為了探究尿液中硫酸特步他林的檢出限，繼續(xù)稀釋尿液中硫酸特步他林后進(jìn)行表面增強(qiáng)拉曼上機(jī)檢測(cè)。當(dāng)溶液濃度為0.5 mg/L時(shí)，硫酸特別他林的拉曼特征峰信噪比大約達(dá)到3，故最低檢出限為0.5 mg/L。

為了驗(yàn)證該方法的可靠性，取100 mL空白尿液添加鹽酸特步他林，添加水平為0.5 mg、1 mg、10 mg 3個(gè)濃度水平進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)添加濃度在前述的最佳表面增強(qiáng)拉曼光譜條件下進(jìn)行SERS掃描，每個(gè)加標(biāo)濃度重復(fù)測(cè)定3次，測(cè)定測(cè)定結(jié)果如表1。

表1 回收率和精密度測(cè)定結(jié)果Table 1 The result of recoveries and precision tests (n=5)

從表中數(shù)據(jù)可以看出，回收率可滿足樣品的分析要求。

2.6 SERS樣品測(cè)定結(jié)果與HPLC檢測(cè)方法的比較

為驗(yàn)證本試驗(yàn)建立的SERS方法對(duì)硫酸特步他林的快速檢測(cè)方法的可靠性，分別采用本法和HPLC法對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行檢測(cè)，并加以比較，檢測(cè)結(jié)果如表2。

表2 SERS與HPLC檢測(cè)結(jié)果對(duì)比Table 2 Comparison of results between SERS and HPLC methods

由表2結(jié)果可以得出結(jié)論如下，用SERS方法檢測(cè)九個(gè)盲樣中硫酸特步他林的含量結(jié)果與HPLC測(cè)得的結(jié)果基本相符，具有較高的可信度，其中3號(hào)、4號(hào)、8號(hào)樣品由于濃度低于SERS方法檢出限的原因，導(dǎo)致表面增強(qiáng)拉曼光譜方法沒(méi)有檢出，說(shuō)明傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室大型儀器HPLC在痕量檢測(cè)方面優(yōu)于SERS檢測(cè)方法，通過(guò)對(duì)比兩種檢測(cè)方法可以得出在一定濃度范圍內(nèi)SERS檢測(cè)方法與HPLC測(cè)得的結(jié)果基本相符。

如果考慮兩種檢測(cè)方法的前處理過(guò)程，HPLC方法前處理復(fù)雜。從前處理到上機(jī)檢測(cè)分析所需時(shí)間在1 h以上，且需要在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下進(jìn)行。而SERS方法所需時(shí)間小于15 min，且不受場(chǎng)地限制。特別是在大量樣品需要檢測(cè)的情況下，SERS方法的優(yōu)勢(shì)會(huì)更加明顯，相對(duì)于HPLC方法，SERS方法對(duì)操作人員要求低、檢測(cè)時(shí)間短、檢測(cè)效率高，能達(dá)到快速分析檢測(cè)的目的。前處理操作方面，高效液相色譜法需要先用有機(jī)溶劑多次萃取，然后將溶劑蒸干，最后溶解過(guò)膜后上樣，步驟繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)。因此SERS方法在樣品量大，檢測(cè)環(huán)境受限時(shí)優(yōu)勢(shì)明顯，適合用于對(duì)大量樣品的篩查。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)開(kāi)發(fā)一種利用表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)快速檢測(cè)硫酸特步他林的方法。首先制備了金溶膠和銀溶膠兩種表面增強(qiáng)劑。對(duì)兩種增強(qiáng)劑進(jìn)行表征和比較分析，然后選擇銀溶膠作為活性基底，對(duì)水溶液和尿液中的硫酸特步他林進(jìn)行檢測(cè)，獲得800 cm-1、1050 cm-1、1330 cm-1、1450 cm-1處作為硫酸特步他林拉曼信號(hào)特征峰。進(jìn)而建立表面增強(qiáng)拉曼光譜法檢測(cè)硫酸特步他林的方法，結(jié)果顯示在濃度1~10 mg/L范圍內(nèi)，滿足回歸方程Y=843.75X+1223.80，相關(guān)系數(shù)為R2=0.97。該方法具有快速、準(zhǔn)確、無(wú)損、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，為水溶液、尿液中瘦肉精成分硫酸特步他林的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)奠定了良好的基礎(chǔ)。