降低和田紅棗白蘭地中甲醇含量的發(fā)酵前處理工藝優(yōu)化

李桂林，彭昕，李澤涵，邵永明，楊凡，李函倫，楊興元

（新疆農業(yè)大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊 830000）

紅棗，鼠李科棗屬木棗樹的果實，又稱中華大棗、干棗、美棗等[1]。紅棗原產于我國，具有悠久的栽培歷史，在古代文獻中，紅棗被列為“五果之一”。紅棗營養(yǎng)豐富，富含人體所需的蛋白質、脂肪、碳水化合物、氨基酸、礦物質、膳食纖維以及多種維生素[2]?！侗窘洝分性敿氷U述了紅棗具有性溫、味甘、無毒的特性[3]，入脾經、心經、胃經，可入藥膳，具有改善脾胃功能，補氣血，護膚美容等養(yǎng)生功效[3,4]。紅棗具有重要的藥用價值，長期食用可以起到抗腫瘤、抗癌、防止心血管疾病等作用[5]。我國是紅棗種植大國，其種植面積占全世界90%以上，主要分布于新疆、河北、河南、陜西等省份。近年來，新疆和田地區(qū)的紅棗因果實大、味道甜等原因廣受消費者喜愛，紅棗加工生產鏈也在日益完善，但單一的種植產出讓農民受益有限，開發(fā)以紅棗為原料的酒精飲品是棗農增收，資源綜合利用的有利途徑。

紅棗白蘭地是以干制紅棗為原料經液態(tài)發(fā)酵、蒸餾、調配、陳釀而得。紅棗自身具有較高的含糖量和豐富的多酚、黃酮等多種生理活性物質[6]，具有很大的發(fā)酵潛力。但因紅棗果實中果膠物質含量高，在釀制過程中對紅棗原料處理不恰當容易產生過量的甲醇[7,8]，人體攝入過量甲醇會對神經系統(tǒng)和血液系統(tǒng)造成不可逆的危害，嚴重者可能會死亡[9]。張麗芝[10]通過監(jiān)測紅棗酒發(fā)酵過程中甲醇和雜醇油含量變化，得出了不同發(fā)酵期甲醇和雜醇油含量的變化規(guī)律；武曉娜[11]等采用基因誘變的方式選育得到低甲醇的釀酒酵母，完善了低甲醇甘蔗酒的釀造工藝；盧鷺濱[12]等探究了低甲醇金桔蒸餾酒的釀造工藝；夏亞男[13]等研究了煮沸處理對大棗白蘭地中的甲醇的控制；董文娟[14]等從原料預處理、酵母菌種和發(fā)酵溫度三個方面對降低山楂酒中甲醇含量進行了探討。但對優(yōu)化紅棗白蘭地液態(tài)發(fā)酵前處理工藝降低甲醇含量鮮有報道。本研究主要對紅棗白蘭地液態(tài)發(fā)酵前處理工藝進行優(yōu)化，這是由于紅棗白蘭地中甲醇產生主要集中于原料前處理階段[8]，當果膠酶作用于棗漿時，果膠酯酶延底物分子隨機切除甲酯化果膠中的甲基，產生甲醇和游離羧基。本研究采用的低甲醇果膠酶是一種特殊的果膠裂解酶，通過特有的甲酯化苯環(huán)同步切分方式有效規(guī)避甲酯化基團單獨游離棗漿中帶來的高甲醇的風險。通過研究不同前處理水平對甲醇含量的影響，以期得到甲醇濃度符合國標GB 2757-2012[15]規(guī)定（甲醇濃度≤2.00 g/L）的紅棗白蘭地并為工業(yè)生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅棗，新疆和田市；葡萄酒活性酵母ADT，安琪酵母股份有限公司；低甲醇果膠酶RF，45～55 /℃30～60 min、助濾破壁果膠酶BXL，40～45 ℃/1～2 h均產自德國AB酶制劑公司；甲醇（色譜純），北京迪科馬科技有限公司；乙醇（色譜純）；4-甲基-2-戊醇（色譜純）。其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

島津GC-2010Pro氣相色譜儀，上海善可精密儀器有限公司；JSB30-1電子計重秤，上海浦春計量儀器公司；LE203E/02分析天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；DZKW電熱恒溫水浴鍋，北京永光明醫(yī)療儀器有限公司；LAL2T酒精計，廣州速為電子科技有限公司；HPX-9052MBE恒溫培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司；TGL-16G高速離心機，上海安亭科學儀器廠；DH-Z100夏朗德壺式蒸餾器，合肥大漢機械制造有限公司；小型自制蒸餾鍋。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

紅棗→分選→清洗→沸浸→復水→破碎→果膠酶酶解→接種酵母→酒精發(fā)酵→紅棗原酒→一次蒸餾→原紅棗白蘭→二次蒸餾→調配→陳釀→成品

1.3.2 操作要點

分選清洗：挑選表面無腐爛破損的干棗，清洗干凈表面灰塵污物。

沸浸：向蒸鍋中倒入常溫純凈水，同時加入紅棗，慢慢煮沸后保持15 min左右，沸浸提汁，以便加快干紅棗吸水脹裂且滅火紅棗自身果膠酶。

復水：向沸浸過的紅棗中加入3倍質量的純凈水，復水24 h充分提汁同時起到降溫作用。

破碎：經過沸浸和復水后，紅棗已變得非常柔軟，后經破碎機充分破碎成漿糊狀。

果膠酶酶解：分別添加助濾破壁果膠酶和低甲醇果膠酶，在40 ℃恒溫水浴鍋內酶解。

發(fā)酵：接入干制紅棗質量分數0.02%左右的葡萄酒活性酵母ADT，發(fā)酵溫度為25 ℃，于恒溫培養(yǎng)箱內發(fā)酵6 d左右。每24 h檢測其基礎理化指標并記錄發(fā)酵情況。

蒸餾：紅棗原酒初蒸時不掐頭，當瞬時酒度降到20%vol時停止蒸餾得到原白蘭地，以便對甲醇、雜醇油和出酒率進行定量分析。復蒸采用夏朗德壺式蒸餾，掐去60%vol前的酒頭，去除25%vol后的酒尾得到紅棗白蘭地。

1.3.3 優(yōu)化紅棗白蘭地前處理工藝的單因素試驗

在酵母接種量為0.02%、發(fā)酵溫度為24 ℃、助濾破壁果膠酶添加量為2.00 mL/kg（每1 kg干制紅棗添加2.00 mL果膠酶，下同）的條件下，按1.3.2中發(fā)酵和蒸餾的方法獲得紅棗白蘭地?？疾斓图状脊z酶添加量（0、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00 mL/kg）對紅棗白蘭地中高級醇、酒精度、甲醇含量的影響，酶解溫度（30、35、40、45、50 ℃）、酶解時間（0、3、6、9、12 h）對紅棗白蘭地中甲醇含量及酒精度的影響，沸浸時間（0、5、10、15、20 min）對發(fā)酵醪液中還原糖以及紅棗白蘭地中酒精度、甲醇含量、高級醇含量、感官評價的影響。

1.3.4 響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，選擇低甲醇果膠酶添加量、沸浸時間和酶解溫度作為考察因素，甲醇含量和酒精度為響應值，按照Box-Behnken設計原理，運用Design Expert 8.0.6.1軟件進行響應面試驗設計，響應面試驗設計因素及水平見表1。

表1 響應面試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.4 測定方法

酒精度的測定：采用酒精計法[16]；還原糖：采用直接滴定法[17]。

甲醇和高級醇的測定：采用氣相色譜法[18]。色譜條件：載氣N2；檢測器，氫火焰離子化檢測器（FID）；以保留時間定性，外標法定量；進樣量1 μL：分流比：20:1；進樣口溫度：220 ℃；檢測溫度230 ℃；柱溫在40 ℃保持2 min，以5 ℃/min升溫至80 ℃，以20 ℃/min升到200 ℃，保持5 min。

式中：X代表試樣中的甲醇含量（g/L）；ρ代表試樣中的甲醇濃度（mg/L）；C代表試樣的酒精度(% vol)。

感官評定：感官評定采用百分制法，參考GB 11856-2008[19]中白蘭地評價標準和參考前人結果[20,21]修正后，制定出紅棗白蘭地感官評分標準（見表2），由20名經過培訓的具有一定感官評定經驗的評定員，對經過復蒸后的各個酒樣從色澤（滿分20分）、香氣（滿分30分）、口感（滿分40分）、風格（滿分10分）4個方面進行感官評定，取其感官評定分數的平均值作為評定結果。

表2 紅棗白蘭地感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standards of cider

2 結果與討論

2.1 單因素試驗結果分析

2.1.1 低甲醇果膠酶添加量對紅棗白蘭地中甲醇含量、高級醇、酒精度的影響

從表3可知，當酶添加量增加到1.60 mL/kg時，高級醇含量達到最大值，異丁醇含量為136.47 mg/L，異戊醇含量為550.16 mg/L。通過對比表3中異丁醇、異戊醇和感官評分的變化趨勢，可以看出在增加低甲醇果膠酶添加量的同時，感官評分逐漸升高，當酶添加量為1.20 mL/kg時，紅棗白蘭地的評分最高，為91.82。這是因為酶添加量使得還原糖含量升高，白蘭地的口感更加甘冽，酒體更加充盈，而酶添加量繼續(xù)加大，果膠質分解越多，發(fā)酵過程中高級醇生成的越多，當異丁醇為136.47 mg/L、異戊醇550.16 mL/L時，感官評分逐漸降低。對于未經陳釀的蒸餾酒，沒有充足的時間條件令高級醇類物質分解[22]，而高級醇的存在會使飲用者出現(xiàn)舌燥，頭昏等不良反應，這是感官評分隨高級醇含量升高而降低的重要原因。

表3 低甲醇果膠酶添加量對紅棗白蘭地中高級醇含量和感官評分的影響Table 3 Effect of low methanol gel enzyme addition on the advanced alcohol content and sensory score of red jujube brandy

由圖1可知，酶添加量從0.40到2.00 mL/kg，甲醇含量依次為2.52、2.50、2.51、2.60、2.61 g/L，與對照組的2.36 mL/kg相比，分別增加了0.16、0.14、0.15、0.24、0.25 g/L，方差分析顯示0.4、0.8、1.2 mL/kg處理組均顯著高于對照組（p＜0.05），1.6、2.0 mL/kg處理組均極顯著高于對照組（p＜0.01）。當酶添加量達到1.60 mL/kg后，棗漿中的溶出的果膠質基本被酶解完，所得樣品的酒精度為30.22% vol，達到最高值，同時甲醇含量基本達到峰值。此時，隨著果膠質被大量分解，甲醇的生成速率變低，繼續(xù)加酶，其變化趨向穩(wěn)定。不同種類果膠酶處理對白蘭地中甲醇含量的影響不同[23]。張少云[24]的研究結果顯示添加0.15%的通用果膠酶，蒸餾酒中的甲醇含量增加了一倍，但本試驗添加2 mL/kg（質量分數為0.2%）果膠酶，樣品中甲醇含量最多只增長了10.59%。這是由于本試驗選用的低甲醇果膠酶以甲酯化苯環(huán)鍵位切分方式裂解果膠從而避免了甲酯化基團的單獨切割游離帶來的高甲醇風險，在提高出酒率的同時有效抑制甲醇含量的增加。為了避免發(fā)酵過程中殘余的果膠酶繼續(xù)發(fā)揮作用[23]并結合實際生產成本需要，本文最佳酶添加量為0.80 mL/kg，此時，酒精度增加了17%而甲醇含量只增加了0.59%，符合降低甲醇的目標，適合工業(yè)化生產。

圖1 低甲醇果膠酶添加量對紅棗白蘭地中甲醇含量和酒精度的影響Fig.1 Effect of low methanol gel enzyme addition on the content and alcohol content of red jujube brandy methanol

2.1.2 酶解溫度對紅棗白蘭地中甲醇含量及酒精度的影響

由圖2可知，甲醇含量和酒精度隨著酶解溫度的增大而增加。方差分析顯示，35 ℃處理組的甲醇含量極顯著高于其他處理組（p＜0.01），50 ℃處理組的甲醇含量極顯著低于其他處理組（p＜0.01），40 ℃處理組的酒精度極顯著高于其他處理組（p＜0.01）。當酶解溫度為35 ℃時，甲醇含量達到最大值，繼續(xù)增大酶解溫度到40 ℃，甲醇含量逐漸降低，而酒精度達到最大值。當酶解溫度大于40 ℃后，甲醇含量和酒精度均迅速降低。在35 ℃時，甲醇含量達到2.69 g/L，與對照組（30 ℃處理組）的2.53 g/L相比增加了0.16 g/L，甲醇含量的迅速增加是因為隨著酶解溫度的增大，果膠酶活性增強，分解果膠質的速率增大，在40 ℃時，甲醇含量降低到2.62 g/L，但此時酒精度增加到32.05% vol。原因是隨著果膠質大量分解，促進可溶性固形物溶出，但溫度不斷增大抑制了酶活性，果膠分解速率降低，可溶性固形物溶出速率變低但溶出量仍在增加?？紤]到降低甲醇并保證較高出酒率，本文最佳酶解溫度為45 ℃，此時酒精度高達29.10% vol，甲醇含量為2.49 g/L。

圖2 酶解溫度對紅棗白蘭地中甲醇含量和酒精度的影響Fig.2 Effect of enzymatic temperature on methanol content and alcohol content of red jujube brandy

2.1.3 酶解時間對紅棗白蘭地中甲醇含量及酒精度的影響

由圖3可知，與對照組（沒有在40 ℃恒溫水浴鍋內酶解）的甲醇含量2.75 g/L相比，處理組酶解時間從3到12 h，甲醇含量分別增加了0.31、0.23、0.14、0.28 g/L。而酒精度先增加后降低，當酶解時間為6 h時，酒精度達到最大值30.18% vol。經方差分析，除了9 h處理組外，其余三組處理間甲醇含量沒有顯著差異（p＞0.05）。酶解時間大于6 h后酒精度迅速降低，酶解9 h，酒精度降低到最小值25.58% vol，此時甲醇含量為2.88 g/L。原因可能是，酶解時間的延長，給了果膠酶充足的時間酶解棗漿中的果膠質，酶解時間為3～6 h時，果膠質基本被果膠酶酶解完畢，再延長酶解時間相反增加了被雜菌侵染的可能，在接種酵母后，無法快速建立起菌群優(yōu)勢[25]，從而影響發(fā)酵，使得出酒率降低。朱香澔[26]等人對甘蔗汁酶解時，最適酶解時間為3.5 h，果膠分解物質D-半乳糖醛酸增加了約99%?？紤]到本試驗酶解底物為棗漿，能量消耗必然增大，但酶解時間不宜過長，所以本文最佳酶解時間為6 h。

圖3 酶解時間對紅棗白蘭地中甲醇含量和酒精度的影響Fig.3 Effect of enzymatic time on methanol content and alcohol content of red jujube brandy

2.1.4 沸浸時間對紅棗白蘭地中還原糖、甲醇含量、高級醇、酒精度的影響

由表4可知，還原糖和高級醇含量隨著沸浸時間的延長而逐漸降低。當沸浸時間為25 min時，還原糖含量達到最低值149.23 g/L，相較與5 min的處理組，降低了64.43 g/L。沸浸處理抑制了紅棗自身酶活性，分解果膠能力降低，導致還原糖含量降低。尹寶穎[27]研究了蒸煮處理對蒸餾酒中高級醇的影響，認為不同蒸煮時間可以不同程度地降低高級醇含量。對比表2與表4中的高級醇含量可知，經過沸浸處理過的紅棗白蘭地異丁醇與異戊醇的含量均極顯著低于未經沸浸處理的（p＜0.01）。這是由于高級醇屬于酵母代謝產物，初始還原糖不足導致酵母不能良好的生長，高級醇含量隨之降低[28]，一定程度上降低了白蘭地的醇厚性[29]。對比表2，經過沸浸處理的紅棗白蘭地感官評分均低于未沸浸的，經過沸浸處理后的白蘭地，棗香味濃郁，但口感較寡淡，辛辣感強烈。

表4 沸浸時間對紅棗白蘭地中高級醇含量和感官評分的影響Table 4 Effect of boiling time on the advanced alcohol content and sensory score of red jujube brandy

由圖4可知，經沸浸處理過的樣品甲醇含量分別為0.76、0.61、0.62、0.56、0.57 g/L，酒精度分別為22.77%、21.90%、22.33%、23.40%、21.73%，甲醇含量和酒精度均極顯著低于圖1、2、3中未經沸浸處理的（p＜0.01）。這與夏亞男[13]研究蒸煮處理影響紅棗白蘭地中甲醇含量的結果一致。隨著沸浸時間的延長，甲醇含量逐漸降低，酒精度變化無規(guī)律。沸浸時間為10 min時甲醇含量下降較快，當沸浸時間為20 min時，甲醇含量達到最低值0.56 g/L，繼續(xù)延長沸浸時間至25 min，酒精度有明顯的下降趨勢。沸浸處理大幅降低紅棗白蘭地中的甲醇含量和酒精度，是因為甲醇主要由果膠在甲基酯酶的作用下水解和甘氨酸轉化而成[30]，高溫加熱抑制了紅棗本身的果膠甲基酯酶活性，從而阻止了甲醇的產生同時因為酶的失活，出酒率降低。在沸浸到10 min時，果膠甲基酯酶基本失活，再繼續(xù)加熱對甲醇含量的影響不大，所以沸浸處理最適時間為10 min。

圖4 沸浸時間對紅棗白蘭地中甲醇含量和酒精度Fig.4 Effect of boiling time on methanol content and alcohol content of red herring brandy

2.2 響應面結果分析

2.2.1 響應面方差試驗分析

根據單因素試驗結果，選取紅棗白蘭地甲醇含量為響應值，沸浸時間（A）、低甲醇果膠酶添加量（B）、酶解溫度（C）為考察因素進行3因素3水平的BBC試驗。響應面試驗設計與結果見表5，方差分析結果見表6。

表5 響應面試驗設計與結果Table 5 Response surface test design and results

表6 響應面擬合回歸方程的方差分析結果Table 6 Analysis results of response surface fitting regression equation

利用Design-Expert 8.0.6.1軟件對表試驗數據進行多元回歸擬合，獲得以紅棗白蘭地的甲醇含量為響應值的回歸方程：

甲醇含量=1.44-0.071×A-0.12×B-0.034×C-0.040×A×B-0.042×A×C-0.085×B×C+0.20×A2+0.13×B2+0.11×C2

由表6可知，回歸模型極顯著（p＜0.01），失擬項不顯著（p＞0.05），回歸模型的決定系數R2=0.9863，調整系數AdjR2=0.9686，說明該回歸模型與試驗擬合較好，可以用于對紅棗白蘭地甲醇含量的理論預測。從回歸方程系數顯著性檢驗可知，各因素對紅棗白蘭地甲醇含量影響程度依次為低甲醇果膠酶添加量（B）＞沸浸時間（A）＞酶解溫度（C）。一次項A、B交互項BC及二次項A2、B2、C2對結果影響極顯著（p＜0.01），一次項C與交互項AB、AC對結果影響顯著（p＜0.05），其他相對結果影響不顯著（p＞0.05）。

2.2.2 響應面曲面圖分析

對紅棗白蘭地甲醇含量影響顯著的交互作用的響應面及等高線見圖5。由圖5可知，隨著各因素水平的增大，響應值呈先減小后逐漸穩(wěn)定的趨勢。交互項AB、BC和AC對甲醇含量影響的響應面均呈現(xiàn)拋物面，即說明3個交互項所在選取的試驗范圍內，響應值均存在極小值。等高線均呈橢圓形，即說明3個交互項對結果影響顯著，與方差分析結果一致。

圖5 各因素之間三維響應面圖和等高線圖Fig.5 Three-dimensional response between the various factors and contour lines

運用Design Expert 8.0.6.1響應面分析軟件對試驗結果進行優(yōu)化，得到降低紅棗白蘭地甲醇含量的最佳前處理條件：沸浸時間10.71 min、低甲醇果膠酶添加量0.97 mL/kg、酶解溫度45.57 ℃。在此最優(yōu)條件下，紅棗白蘭地甲醇含量最小預測值為1.39 g/L。綜合實際操作要求，將上述最優(yōu)前處理條件調整為沸浸時間11.00 min、低甲醇果膠酶添加量1.00 mL/kg、酶解溫度46.00 ℃，按上述前處理工藝制作紅棗白蘭地，進行3次重復試驗，得到的甲醇含量為1.37 g/L，接近預測值，且初次蒸餾酒精度平均值為31.50% vol，異丁醇含量為87.92 mg/L，異戊醇含量為306.46 mg/L，感官評分94.63分。說明此響應面法優(yōu)化得到的紅棗白蘭地前處理工藝在實踐中可行。

3 結論

本研究在單因素的基礎上，通過響應面試驗優(yōu)化紅棗白蘭地的前處理工藝，達到了降低紅棗白蘭地中甲醇含量的目的，確定最優(yōu)前處理工藝為：沸浸時間11.00 min、低甲醇果膠酶添加量1.00 mL/kg、酶解溫度46.00 ℃。在此優(yōu)化條件下，經過一次蒸餾和復蒸得到的紅棗白蘭地酒體澄清透明，口感綿延醇厚，殺口感適中，回味甘甜，具有獨特的紅棗香氣，甲醇含量1.37 g/L，酒精度31.50% vol，異丁醇含量為87.92 mg/L，異戊醇含量為306.46 mg/L，綜合感官評分高達94.63分。本試驗為紅棗百蘭地的釀制提供了發(fā)酵前處理試驗基礎，對于指導生產實踐，開發(fā)紅棗酒精飲品填補市場空缺有一定的意義。