生防細(xì)菌PP19和SI17菌懸液對(duì)荔枝霜疫病的防病作用初探

鄭 麗，張海鵬，喻國(guó)輝，黃石連

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院植物健康創(chuàng)新研究院/仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院/廣東省普通高校果蔬病蟲害綠色防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510225；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南亞熱帶果樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省熱帶亞熱帶果樹研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640；3.黃埔海關(guān)技術(shù)中心，廣東 廣州 510627）

【研究意義】荔枝作為中國(guó)南方特有的水果，其年總產(chǎn)值達(dá)62.88 億元［1］，荔枝霜疫霉（Peronophythora litchiiChen ex Ko et al.）是荔枝產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生且為害嚴(yán)重的重要病害，侵染果實(shí)后，造成裂果和爛果，長(zhǎng)出白色霉?fàn)钗?，?yán)重影響外觀和品質(zhì)，進(jìn)一步加速果實(shí)褐變，影響鮮果貯藏和銷售［2-3］。目前，化學(xué)藥劑是重要防控措施，存在安全隱患和抗藥性風(fēng)險(xiǎn)。尋求高效、安全、無(wú)殘留、環(huán)境友好的生物制劑，切實(shí)保證水果產(chǎn)量和品質(zhì)的需求迫切。生防制劑一般低毒，環(huán)境兼容性較好，符合當(dāng)前綠色生產(chǎn)要求，該方法將成為水果采后病害防控和延緩褐變的重要措施之一。本研究前期優(yōu)選到生防解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）PP19 和生防乙酰微小桿菌（Exiguobacterium acetylicum）SI17，擬探究?jī)芍昃揽乩笾λ卟〉目赡軝C(jī)理，為開發(fā)新型綠色農(nóng)藥提供理論基礎(chǔ)。

【前人研究進(jìn)展】研究表明，荔枝霜疫霉菌對(duì)羧酸酰胺類殺菌劑的抗性風(fēng)險(xiǎn)水平較低［4］。隨殺菌劑的使用推廣及用藥次數(shù)增多，病菌產(chǎn)生抗藥性的潛在性風(fēng)險(xiǎn)提高［5］。生物防治由于具備綠色、安全及有效等特點(diǎn)已成為蔬果采后病害防治的研究熱點(diǎn)［6-7］。生防菌劑對(duì)環(huán)境生態(tài)友好、安全性高且防治譜寬，在許多蔬果采后病害生物防治中有廣泛引用，如柑橘［8］、葡萄［9］、蘋果［10］、草莓［11］及梨［12］等。生防菌在荔枝生產(chǎn)和抗病性上的應(yīng)用也有相關(guān)報(bào)道，其中以芽孢桿菌屬（Bacillussp.）為主［13-16］。果蔬采后病害的生防機(jī)理主要有水解酶［17］、營(yíng)養(yǎng)和空間競(jìng)爭(zhēng)［18］、重寄生［19］、分泌次生代謝物［20］以及誘導(dǎo)寄主抗性［21］。誘導(dǎo)抗性指的受到外界的刺激因子通過(guò)信號(hào)傳遞激活植物體內(nèi)的應(yīng)答信號(hào)從而產(chǎn)生廣譜持久抗性［22］。據(jù)報(bào)道，蠟質(zhì)芽孢桿菌（Bacillus cereus）和枯草芽孢桿菌（B.subtilis）對(duì)桃軟腐病具有priming 效應(yīng)［23-24］，能誘導(dǎo)抗病有關(guān)的酶如苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過(guò)氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）的合成及合成降解病菌細(xì)胞壁的降解酶如幾丁質(zhì)酶（CHI）和β-1,3-葡聚糖酶（GLU）［25］；惡臭假單胞菌Pseudomonas putida處理過(guò)的木瓜明顯提升抗性酶PAL、過(guò)氧化氫酶（CAT）、POD 及總酚含量從而抵抗木瓜炭疽病的發(fā)生［26］；接種紅灰鏈霉菌Streptomyces rubrogriseus可提高番茄根部POD 和超氧化物歧化酶（SOD）的活性從而提高抗病性［27］；哈茨木霉Trichoderma harzianum誘導(dǎo)過(guò)的茄子葉片內(nèi)的抗病性相關(guān)酶SOD、POD、PPO 的活性升高抵御黃萎?。?8］；生防菌梅奇酵母Metschnikowia zizyphicola處理梨果實(shí)，提升貯藏期間PAL 等抗性基因表達(dá)而提高抗病性。

【本研究切入點(diǎn)】從前期研究基礎(chǔ)出發(fā)，分析兩株分離自荔枝果皮的生防菌PP19 和SI17 的菌體懸浮液對(duì)采后荔枝霜疫病的防效，以及其對(duì)果皮抗病相關(guān)酶的影響，初步解析生防菌可能的作用方式。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】明晰生防菌菌體懸浮液的作用效果，以及植物抗病性酶和相關(guān)活性物質(zhì)的變化；揭示生防菌作用下植物抗病相關(guān)生理機(jī)制，旨在尋找新型高效的生防菌來(lái)防治荔枝果實(shí)采后霜疫病，減少荔枝采后運(yùn)輸過(guò)程中的經(jīng)濟(jì)損失。

1 材料與方法

1.1 菌株培養(yǎng)和植物材料

病原菌活化：由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)系真菌實(shí)驗(yàn)室提供，荔枝霜疫霉菌株為該實(shí)驗(yàn)室2013 年從四川瀘州某荔枝果園果實(shí)上分離獲得，命名為SC18。將保存于16 ℃的病原菌在CJA（Carrot juice agar，200 g 去皮胡蘿卜，榨汁，瓊脂15 g，定容至1 L）上活化，25 ℃培養(yǎng)5～7 d，用適量無(wú)菌水洗下并經(jīng)茶漏過(guò)濾，濾液收集于燒杯中。反復(fù)清洗多次，盡量將孢子囊從菌絲頂端洗脫下來(lái)，濾液即為游動(dòng)孢子囊懸浮液。顯微鏡觀察其個(gè)數(shù)，調(diào)整到5×104個(gè)孢子囊/mL，備用。

生防菌活化：從-80 ℃冰箱中取出本實(shí)驗(yàn)用生防菌PP19 和SI17，在LB（胰蛋白胨10 g、氯化鈉10 g、酵母提取物5 g、瓊脂糖15 g）平板上劃線，28 ℃下培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)接到LB 培養(yǎng)液試管中，28 ℃、200 r/min 培養(yǎng)20 h 作為種子培養(yǎng)液，以1∶500的比例將種子菌液接到LB 培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，4 ℃、6 000 r/min 離心15 min，去除上清液，0.85% NaCl 進(jìn)行等體積重懸??；隨后用滴液法檢測(cè)濃度，調(diào)整至濃度為5×108CFU/mL，備用。

果實(shí)采摘：來(lái)自海南儋州南陽(yáng)農(nóng)場(chǎng)某果農(nóng)的妃子笑荔枝，約80%成熟度采摘到實(shí)驗(yàn)室。在室溫條件下，擺放到保鮮盒（盒底鋪上滅菌濾紙，直徑18 cm，滅菌水潤(rùn)濕，保鮮盒規(guī)格為 323 mm×220 mm×100 mm），隨后相關(guān)實(shí)驗(yàn)以12 h：12 h=光照：黑暗培養(yǎng)，開展實(shí)驗(yàn)。

1.2 生防菌菌懸液防效測(cè)定

試驗(yàn)設(shè)5.0×107CFU/mL 生防菌PP19 和SI17菌懸液，以及0.85% NaCl 10 倍液3 個(gè)處理。采用噴霧處理的方法，24 h 后噴霧接種P.litchii。室溫25 ℃培養(yǎng)。每個(gè)處理3 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30 個(gè)果實(shí)。接種病原菌后24 h 開始調(diào)查病害嚴(yán)重度。根據(jù)蔡學(xué)清［13］病害嚴(yán)重度調(diào)查方法稍加改善：0 級(jí)：無(wú)病癥；1 級(jí)：接種點(diǎn)有輕微病斑,壞死面積5%以下；3 級(jí)：壞死面積5%～10%；5 級(jí)：壞死面積10%～25%；7 級(jí)：壞死面積25%～50%；9 級(jí)：壞死面積超過(guò)50%或全部白霉（果實(shí)）。計(jì)算病情指數(shù)和防治效果：

病情指數(shù)（%）=〔∑（病級(jí)數(shù)×該病級(jí)果數(shù)）/（最高病級(jí)×總果數(shù)）〕×100

防治效果（%）=〔（對(duì)照病情指數(shù) -處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)〕×100

1.3 抗病酶活性和相關(guān)物質(zhì)含量測(cè)定

樣品處理方法同1.2。取樣時(shí)間點(diǎn)為接種后0、12、24、36、48、60、72 h。去掉果肉，果皮迅速分裝在錫箔紙中，液氮速凍25～30 min，放置在-80 ℃冰箱保存，備用。每個(gè)處理每次取樣總計(jì)9 個(gè)果實(shí)（3 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3 個(gè)果實(shí)）。抗病酶活性和相關(guān)物質(zhì)含量指標(biāo)分為3 類：（1）保護(hù)酶和物質(zhì)含量：超氧化物歧化酶（SOD，superoxide dismutase）、過(guò)氧化氫酶（CAT，catalase）、H2O2；（2）抗病酶：β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucansae，GLU）、幾丁質(zhì)酶（chitinase，CHI）、苯丙氨酸解氨酶（PAL，phenylalanin ammonia-lyase）、過(guò)氧化物酶（POD，peroxidase）；（3）保鮮相關(guān)酶或物質(zhì)含量：多酚氧化酶（PPO，polyphenol oxidase）、總酚（total phenolic）、花色素苷（anthocyanin）、花色素苷酶（anthocyanase）。測(cè)定采用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Multiskan Go-1510）或分光光度計(jì)。

1.3.1 保護(hù)酶和物質(zhì)含量測(cè)定 H2O2：采用試劑盒法檢測(cè)（南京建成生物工程有限公司），檢測(cè)OD405。SOD：參考余中蓮的方法測(cè)定［29］，測(cè)定OD560。CAT：參照余中蓮［29］的方法測(cè)定，提取荔枝果皮樣品的粗酶液，測(cè)定OD405。

1.3.2 抗病酶測(cè)定 GLU：采用試劑盒法檢測(cè)（北京索萊寶科技有限公司），測(cè)定OD540值。CHI：參考余中蓮的方法測(cè)定［29］，測(cè)定OD585。PAL：采用試劑盒法檢測(cè)（南京建成生物工程有限公司），1 cm 光徑石英比色皿，雙蒸水調(diào)零，測(cè)定OD290。POD：采用試劑盒法檢測(cè)（南京建成生物工程有限公司），雙蒸水調(diào)零，1 cm 光徑比色皿，測(cè)定OD420。PPO：參照余中蓮［29］的方法測(cè)定，測(cè)定OD398。

1.3.3 其他酶或物質(zhì)測(cè)定 總酚（total phenolic）：參照蔡學(xué)清［13］的方法，用Folin-Ciocalteu 法測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定OD700?；ㄉ剀眨╝nthocyanin）：參照蔡學(xué)清［13］的方法，測(cè)定OD510?；ㄉ剀彰福╝nthocyanase）：參照蔡學(xué)清［13］的方法，測(cè)定OD530。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

在Microsoft Excel 中對(duì)病情指數(shù)、生防效果、酶活性及物質(zhì)含量等數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、分析。采用DPS 軟件7.05 進(jìn)行LSDTest（P＜0.05），ANOVA Analysis 進(jìn)行各個(gè)因子的單因素（Oneway）分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌懸液對(duì)荔枝霜疫病的生防效果分析

PP19 和SI17 菌懸液分別預(yù)處理荔枝果實(shí)，接種后36、48、60 h，果實(shí)病情指數(shù)分別為1.23%、4.98%、32.59% 和0.99%、6.79%、44.20%（圖1A）；生防效果分別為88.76%、80.41%、39.59%和91.01%、73.30%、18.08%（圖1B）。與對(duì)照相比，兩株生防菌菌懸液接種后36、48 h 顯著降低妃子笑荔枝果實(shí)霜疫病的發(fā)生；但接種后60 h 與對(duì)照差異不顯著（圖1）。

圖1 PP19 和SI17 菌懸液處理后荔枝果實(shí) 的病情指數(shù)和生防效果Fig.1 Disease index and biocontrol efficacy of litchi fruit treated with bacterial suspensions of PP19 and SI17

2.2 菌懸液對(duì)荔枝果皮相關(guān)酶活性和物質(zhì)含量的影響

PP19 和SI17 菌懸液預(yù)處理果實(shí)24 h 接種P.litchii，檢測(cè)11 種相關(guān)指標(biāo)。數(shù)據(jù)分析顯示，它們和對(duì)照存在差異；后期隨著果實(shí)褐變和病情加重，各指標(biāo)活性或含量均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

2.2.1 菌懸液對(duì)果皮H2O2含量、CAT 和SOD活性分析 結(jié)果（圖2）顯示，H2O2含量呈現(xiàn)“下降-上升-下降”趨勢(shì)，均在24 h 含量最高，隨后都下降；對(duì)照果皮H2O2含量下降斜率最高，其次為PP19，且在24 h 下降幅度達(dá)18.92%，其他時(shí)間點(diǎn)含量均增加，最高可達(dá)74.05%（72 h）；SI17處理果皮H2O2含量在24～48 h 下降最高，分別為22.58%和21.36%，72 h 增加58.05%。并且，在0～24 h（無(wú)病原菌）時(shí)，三者差異較?。?4～72 h（接種霜疫霉菌）的含量均下降，但PP19 含量高于對(duì)照，可能此過(guò)程具有保護(hù)細(xì)胞的功能。PP19 和SI17 處理果實(shí)后，CAT 活性在48～72 h 高于對(duì)照，而24～48 h 的兩個(gè)處理和對(duì)照的變化趨勢(shì)較為相似，呈現(xiàn)“平穩(wěn)-上升-下降-上升”。PP19和SI17 處理后，果皮CAT 活性僅在48～72 h 增幅較大（60 h 分別增加15.65%和19.75%）。PP19和SI17 處理果實(shí)，在24～48 h 果皮SOD 活性顯著高于對(duì)照，隨后相似，趨勢(shì)為“下降-上升-下降”，36 h 分別增加18.89%和17.35%。PP19 和SI17 菌懸液處理可提高果實(shí)的CAT、SOD 活性，接種霜疫霉后果皮的H2O2含量表現(xiàn)增加，可能激發(fā)了果皮的抗病性。

圖2 PP19 和SI17 菌懸液對(duì)荔枝果皮H2O2 含量及CAT、SOD 活性的影響 Fig.2 Effects of bacterial suspensions of PP19 and SI17 on the content of H2O2 content and CAT,SOD activity in litchi fruit peel

2.2.2 菌懸液對(duì)果皮GLU、CHI 和PAL 活性分析 PP19 菌懸液預(yù)處理果皮，結(jié)果（圖3）顯示，接種后36～60 h 顯著提高果皮GLU 活性（分別增加200%、92.23%和7.84%），而SI17 則在12～36 h 表現(xiàn)更優(yōu)（分別增加89.13%、651.18%、184.62%），變化趨勢(shì)均為“上升-下降-上升-下降”。PP19 和SI17 菌懸液對(duì)CHI 活性影響較小，在病原菌侵染后期60～72 h 可提高其活性，SI17在48 h 活性表現(xiàn)最高（增加12.36%），48～72 h 下降幅度和對(duì)照無(wú)差異，PP19 在60～72 h 其活性高于對(duì)照（分別增加95.29%和43.63%），且在0～24 h CHI 活性和對(duì)照無(wú)差異；三者變化趨勢(shì)相似，為“上升-下降-上升-下降”。PP19 和SI17 處理果皮PAL 活性呈現(xiàn)相似趨勢(shì)“，為上升-下降-上升/下降”，PP19 在24～36 h（分別增加11.44%和12.96%）和60～72 h（分別增加5.55%和166.90%）活性高于對(duì)照，SI17 則在60～72 h高于對(duì)照（分別增加16.94%和169.54%），二者均提高PAL 活性。

圖3 PP19 和SI17 菌懸液對(duì)荔枝果皮GLU、CHI 和PAL 活性的影響 Fig.3 Effects of bacterial suspensions of PP19 and SI17 on the activity of GLU,CHI and PAL in litchi fruit peel

2.2.3 菌懸液對(duì)果皮POD 和PPO 活性分析 POD 和PPO 均表現(xiàn)為對(duì)照果皮酶活性高于PP19和SI17 處理，其中PP19 處理對(duì)2 種酶影響更大，下降趨勢(shì)更為顯著（變化斜率更大）。PP19 和SI17 處理果皮POD 活性在24、60、72 h 分別減少24.96%、25.10%、31.39%和4.73%、20.68%、30.87%，三者變化趨勢(shì)相似為“下降-上升”；而PP19 處理果皮PPO 活性在24、48 h 分別減少37.18%和93.75%，SI17 處理果皮PPO 活性在24、48、60 h 分別減少50%、62.50%、30.16%，三者變化趨勢(shì)相似為“下降-上升-下降”（圖4）。

圖4 PP19 和SI17 菌懸液對(duì)荔枝果皮POD 和PPO 活性的影響 Fig.4 Effects of bacterial suspensions of PP19 and SI17 on the activity of POD and PPO in litchi fruit peel

2.2.4 生防菌對(duì)果皮總酚和花色素苷含量及花色素苷酶分析 和褐變有關(guān)的酶和物質(zhì)主要有總酚、花色素苷和花色素苷酶。結(jié)果（圖5）顯示，菌懸液可增加總酚和花色素苷含量（48、60 h 和24、36 h 高于對(duì)照）。PP19 處理可降低花色素苷酶活性（36～60 h），SI17處理后期活性也低于對(duì)照，但變化斜率高于PP19 處理的果皮，顯示PP19 處理更利于降低果皮花色素苷酶活性。PP19 處理果皮總酚在48、60 h 分別增加13.29%和9.68%，在36 h 下降5.39%；SI17 處理果皮在60 h 增加28.59%，其他時(shí)間點(diǎn)總酚含量低于對(duì)照，其中在36 h 下降20.21%，三者變化趨勢(shì)相似，均呈現(xiàn)“下降”。PP19 處理果皮花色素苷含量和花色素苷酶活性在36 h 增加124%、48 h 減少78.52%，SI17處理則在72 h 增加55%、48 h 減少31.17%，花色素苷變化趨勢(shì)為“下降-上升-下降”，花色素苷酶變化趨勢(shì)為“下降-上升-下降”。

圖5 PP19 和SI17 菌懸液對(duì)荔枝果皮總酚和花色素苷含量及花色素苷酶活性的影響 Fig.5 Effects of bacterial suspensions of PP19 and SI17 on the content of total phenolic and activity of anthocyanin and anthocyanase in litchi fruit peel

3 討論

生物防治由于其高效持久、環(huán)境友好以及無(wú)藥劑殘留的特點(diǎn)被廣泛用于防治植物病害，成為防治植物病害的主流研究方向［30］。而生防菌作為一種生物防治的方法，常被用于誘導(dǎo)果實(shí)提高自身的抗病性［31-32］。當(dāng)植物受到病原菌入侵時(shí)，體內(nèi)多種與抗病性有關(guān)的酶會(huì)參與其中，這些酶作為衡量植物抗病性能力的指標(biāo)，主要包括PAL、SOD、PPO、CAT、POD 等，受到外界生物或者非生物脅迫時(shí)植物體內(nèi)防御酶體系就會(huì)被啟動(dòng)［33-35］，從而延緩果實(shí)劣變［36］、提高植株抗病性［37-38］以及限制病害的擴(kuò)展［39］。本研究發(fā)現(xiàn)，PP19 和SI17 菌懸液能顯著降低荔枝果實(shí)霜疫病的發(fā)生，且能改變相關(guān)抗病保鮮酶的活性。接種后12、36、48 h，生防菌處理抗病相關(guān)酶（GLU、CHI、POD、PAL）活性稍高于對(duì)照；PP19 接種后72 h CAT 活性高于對(duì)照，SOD 活性在36 h 高于對(duì)照。接種后12～48 h，生防菌處理總酚、花色素苷含量高于對(duì)照；PP19 和SI17 對(duì)荔枝果皮酶活性影響不完全相同，對(duì)酶活性的影響存在差異，如SI17 比PP19 更能提高植物CHI 活性；PP19 處理果皮H2O2含量下降較多；SI17 和PP19 從48 h開始可降低花色素苷酶活性。

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)POD 活性（生防菌處理后POD活性低于對(duì)照）和蔡學(xué)清［13］報(bào)道的研究結(jié)果不完全一致，其研究數(shù)據(jù)顯示內(nèi)生菌處理后荔枝果皮POD 活性大于對(duì)照。關(guān)于POD 活性變化趨勢(shì)，目前并無(wú)統(tǒng)一定論，也有文獻(xiàn)報(bào)道其含量越低越好，其可能參與酚的氧化，活性越高越容易使果皮褐變；但也有研究認(rèn)為其活性可能與植物抗病相關(guān)，比如參與了植物的木質(zhì)化過(guò)程［40］。由此推測(cè)，本實(shí)驗(yàn)中生防菌處理果皮POD 可能主要影響了果皮褐變過(guò)程。

在病原菌脅迫下，PP19 處理果皮H2O2含量下降較多，對(duì)荔枝果實(shí)起保護(hù)作用；生防菌可提前增加總酚、花色素苷含量（12～48 h 高于對(duì)照）；SI17 和PP19 從48 h 開始可降低花色素苷酶活性，前期（12～36 h）絕對(duì)含量雖然高于對(duì)照，但變化斜率低于對(duì)照，故對(duì)照對(duì)花色素苷影響更大，導(dǎo)致其含量比生防菌處理的要低。但隨著果實(shí)褐變和病情加重，活性或含量均表現(xiàn)下降。此研究數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)報(bào)道保持一致［13，29］。

4 結(jié)論

生防菌PP19 和SI17 菌懸液噴霧預(yù)處理荔枝果實(shí)后，可顯著降低采后荔枝霜疫病的發(fā)生；它們處理果實(shí)后，可能通過(guò)改變果皮相關(guān)抗病保鮮酶活性或物質(zhì)含量起到防病保鮮效果。菌懸液處理果實(shí)后，影響果皮CAT、SOD、GLU、PAL、PPO、POD、花色素苷酶的活性和總酚及花色素苷含量；SI17 比PP19 更能提高果皮CHI 活性；PP19 對(duì)果皮酶活性或相關(guān)物質(zhì)含量影響更大。在下一步研究中，我們將進(jìn)一步分析兩株菌菌懸液對(duì)調(diào)控酶活性或活性物質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)的定量分析，深入揭示菌懸液防病的作用機(jī)制。