吉富羅非魚胃腸道幾丁質(zhì)酶的克隆、組織分布和純化

黃金鳳，李 波，白 瑩，馮禮燊，李文笙，孫彩云

（中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/有害生物控制與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物良種繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省重要經(jīng)濟(jì)魚類健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510006）

【研究意義】幾丁質(zhì)是由β-1,4 糖苷鍵連接N-乙酰氨基葡萄糖的一種線性多糖，是自然界中唯一存在的陽離子型可食用纖維。幾丁質(zhì)貯量十分豐富，僅海洋生物每年所合成的幾丁質(zhì)已超過10 億t，是自然界中貯量?jī)H次于纖維素的第二大天然多糖［1］。幾丁質(zhì)多存在于真菌細(xì)胞壁、昆蟲消化道和多數(shù)節(jié)肢動(dòng)物的外骨骼中，因此研究關(guān)于降解幾丁質(zhì)的酶具有重要意義。幾丁質(zhì)酶（EC 3.2.1.14）是一種糖苷水解酶，催化N-乙酰氨基葡萄糖從幾丁質(zhì)上脫去，從而降解幾丁質(zhì)。幾丁質(zhì)酶根據(jù)其催化結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列相似性主要分為糖基水解酶（GH）家族18、19、23 和48，該酶在自然界分布廣泛，在細(xì)菌到高等植物和動(dòng)物等生物體中均有分布，植物的幾丁質(zhì)酶屬于GH19，魚類的幾丁質(zhì)酶均為GH18，GH23 和GH48 分別在細(xì)菌和真菌中分布［2-4］。幾丁質(zhì)酶具有多種生理作用，如促進(jìn)甲殼類和昆蟲類蛻皮，降解魚類胃腸道里的蝦蟹殼幫助消化，在植物里則參與抵抗含有幾丁質(zhì)的致病菌［4］，在魚皮膚粘液中抵抗寄生蟲等［5］。

【前人研究進(jìn)展】魚類中的幾丁質(zhì)酶最早在海鯛的胃腸道中被發(fā)現(xiàn)［6］。隨著基因組測(cè)序的快速發(fā)展，已研究獲得斑馬魚、日本比目魚等多種魚類的幾丁質(zhì)酶序列［7］。肉食性海水魚類的天然食譜中含有豐富的幾丁質(zhì)，如含有高結(jié)晶度α-幾丁質(zhì)的蝦蟹和浮游動(dòng)物，含有低結(jié)晶度β-幾丁質(zhì)的烏賊等［4,8］。研究表明，魚類消化道組織具有幾丁質(zhì)降解活性，其中胃中的幾丁質(zhì)酶活性最高，降解幾丁質(zhì)寡糖的活性比其他組織高，如白姑魚、日本鯖、斑鱾、琉球棘角魚和梭魚等。而降解單糖的β-N-乙酰氨基葡萄糖酶的活性在各組織中廣泛分布，而非局限于消化道。不同的幾丁質(zhì)降解酶的分布很可能取決于該魚類品種的飲食習(xí)慣和棲息地位置［4,9］。已有研究表明，從魚胃分離獲得的幾丁質(zhì)酶約38～62 ku，與植物幾丁質(zhì)酶大?。?4.5～29 ku）有明顯差異。在實(shí)驗(yàn)室條件下，魚胃的丁質(zhì)酶降解幾丁質(zhì)低聚糖的最適pH 值為2.0～5.0，降解幾丁質(zhì)多聚糖的最適pH 值為1.5～5.5。這表明魚類胃中的幾丁質(zhì)酶適應(yīng)胃組織的酸性環(huán)境來降解幾丁質(zhì)底物［4］。

【本研究切入點(diǎn)】迄今為止，有關(guān)羅非魚幾丁質(zhì)酶的研究報(bào)道僅有1 篇，它揭示了羅非魚血清、胃和腸中存在幾丁質(zhì)酶降解活性，能夠降解4-甲基傘形酮-β-D-N,N-二乙酰殼三糖〔4MU-（GlcNAc）2〕或4-甲基傘形酮-β-D-N,N,N-三乙酰殼三糖〔4MU-（GlcNAc）3〕，其中血清中的幾丁質(zhì)酶具有最高的比活性［10］。但目前仍未見關(guān)于羅非魚幾丁質(zhì)酶序列及其功能的報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究克隆了吉富羅非魚3 種預(yù)測(cè)的酸性幾丁質(zhì)酶，并對(duì)克隆結(jié)果進(jìn)行了進(jìn)化樹分析，同時(shí)檢測(cè)幾丁質(zhì)酶在羅非魚中的組織分布，以期獲得相關(guān)功能信息。提取羅非魚胃組織蛋白并純化其中的幾丁質(zhì)酶，測(cè)定酶活，比較羅非魚和其他魚類幾丁質(zhì)酶的活性，為羅非魚幾丁質(zhì)酶的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所用的吉富羅非魚（70～100 g）約為30 尾，均為雄性，購(gòu)自廣東省國(guó)家羅非魚良種場(chǎng)。試驗(yàn)前，供試羅非魚在12 h ∶12 h 黑暗光照循環(huán)條件下，室溫循環(huán)淡水中馴化1 周，每天9:30 和16:30進(jìn)行飽食投喂。采樣前24 h內(nèi)對(duì)羅非魚停食，在第2 天早上進(jìn)行取樣。

主要試劑：總RNA 提取試劑Trizol Reagent、反轉(zhuǎn)錄試劑盒M-MLV First Strand cDNA Synthesis Kit 購(gòu)自英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司；聚合酶Blend taq plus 和連接試劑Ligation High，購(gòu)自東洋紡（上海）生物科技有限公司；DNase Ⅰ 購(gòu)自美國(guó)紐英倫生物技術(shù)公司；E.Z.N.A? Gel Extraction Kit、E.Z.N.A? Plasmid Extraction Kit，購(gòu)自O(shè)mega Bio-Tek 公司；SYBR? Green Real-time PCR Master Mix 試劑盒、100 bp DNA Ladder，購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司；DEPC、X-gal 和IPTG 購(gòu)自生工生物工程（上海）公司。引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。所用大腸桿菌DH5α 和pUCM-T載體購(gòu)自英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司，感受態(tài)細(xì)菌則由本實(shí)驗(yàn)室制備。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

主要儀器：凝膠成像分析系統(tǒng)和CFX Connect熒光定量PCR 儀購(gòu)于伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司，VeritiTM PCR 儀、高速冷凍離心機(jī)5810R 和移液槍購(gòu)于德國(guó)艾本德股份有限公司，核酸蛋白測(cè)定儀NanoDrop2000 購(gòu)于美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，三洋制冰機(jī)購(gòu)于日本SANYO 公司，微波爐購(gòu)于廣東美的集團(tuán)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 羅非魚tChit1a、tChi3和tChit基因cDNA 的克隆 根據(jù)NCBI 的尼羅羅非魚基因組中3 種預(yù)測(cè)的酸性幾丁質(zhì)酶序列tChit1a（XM_039611991.1）、tChi3（XM_005464320.4）和tChit（XM_003459030.3），采用Primer 5 軟件設(shè)計(jì)特異性引物（表1）。

用丁香酚將羅非魚麻醉，斷頭處死，取出胃、腸用DEPC 水清洗，按照說明書用Trizol Reagent 進(jìn)行總RNA 提取，用DNase Ⅰ去除基因組DNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，并以此為模板按照聚合酶Blend tap plus所要求的反應(yīng)條件進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，所用引物分別 為tChi1a-ORF-F/R、tChi3-ORF-F/R 和tChit-ORF-F/R（表1）。PCR 反應(yīng)程序均為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，40 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min；4 ℃ 保存。對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，加入pUCM-T 載體和Ligation High 室溫孵育連接，然后通過熱激法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 中，陽性克隆經(jīng)菌落PCR 鑒定后，送至生工生物工程（上海）公司進(jìn)行測(cè)序。

表 1 羅非魚3 種幾丁質(zhì)酶tChit1a、tChi3 和tChit 的ORFs 克隆引物及組織分布研究引物Table 1 Primers used in cloning of ORFs and tissue distribution study of three chitinases tChit1a,tChi3 and tChit in tilapia

1.2.2 羅非魚tChit1a、tChi3和tChit基因序列的生物信息學(xué)分析 利用SignalP 5.0 尋找?guī)锥≠|(zhì)酶tChit1a、tChi3和tChit基因的信號(hào)肽（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）［11］；利用ClustalW2軟件進(jìn)行氨基酸序列同源性分析（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）［12］。通過NCBI 在線網(wǎng)站進(jìn)行氨基酸序列相似度分析（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）［13］；采 用MEGA6.0 軟 件Neighbor-Joining 法進(jìn)行進(jìn)化樹分析［14］。

1.2.3 羅非魚tChit1a、tChi3和tChit基因的mRNA 組織分布 用丁香酚麻醉羅非魚，斷頭處死，迅速取出端腦、中腦、小腦、延髓、脊髓、下丘、垂體、鰓、心臟、腎、脾、脂肪、肝、胃、前腸、中腸、后腸、白肌、紅肌和性腺等組織，放入RNase-free 的1.5 mL 離心管中，立即放入液氮，之后置于-80 ℃冰箱中貯藏。按照1.2.1 克隆步驟進(jìn)行總RNA 提取和反轉(zhuǎn)錄，以獲得的第一鏈cDNA 為模板，按照SYBR? Green 說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，所用引物為tChit1a-qt-F/R、tChi3-qt-F/R 和tChit-qt-F/R（表1）。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s、56 ℃ 15 s、72 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)；每個(gè)循環(huán)結(jié)束后在82 ℃收集熒光15 s；95 ℃ 10 s，然后以0.5 ℃/2 s 的遞增速度，65～95 ℃下進(jìn)行溫度梯度退火及收集熒光值。所測(cè)的值以18S rRNA 為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，2-ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)。

1.2.4 羅非魚胃幾丁質(zhì)酶的純化 用丁香酚麻醉羅非魚，斷頭處死，取出其胃組織進(jìn)行清洗，剪下內(nèi)壁粘膜層置于PBS 緩沖液中破碎（70 Hz/ 120 s），隨后12 000 g 離心20 min 后收集上清用于純化。用幾丁質(zhì)樹脂制備重力柱，根據(jù)說明書清洗柱子，隨后將樣品過幾丁質(zhì)柱2 次，緩沖液清洗雜蛋白，然后加入洗脫液，關(guān)閉出樣口，4 ℃過夜。第2 天依次收集濾液，并進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定和Western blot 檢測(cè)。

1.2.5 SDS-PAGE及Western blot驗(yàn)證 制備12% SDS 聚丙烯酰胺凝膠，上樣后80 V 電泳30 min，120 V 電泳60 min。電泳結(jié)束，其中一塊PAGE膠用于G250 染色，另一塊PAGE 膠則按照正極-海綿-濾紙-NC 膜-PAGE 膠-濾紙-海綿-負(fù)極的順序夾緊，放在電泳槽中，裝置在冰浴中恒流200 mA 電泳60 min；電轉(zhuǎn)完的NC 膜用TBST緩沖液漂洗后浸入5%脫脂奶粉中封閉30 min；用1 ∶4 000 的斜帶石斑魚1 型幾丁質(zhì)酶抗體稀釋液孵育過夜，最后放入Goat anti-rabbit IgG按1∶5 000 稀釋液中孵育1 h，最后滴加ECL 熒光混合液到膜上，在化學(xué)發(fā)光儀中顯色并拍照記錄。

1.2.6 酶活測(cè)定 采用4-甲基傘形酮（4-MU）熒光底物測(cè)定酶活。酶活定義為：在37 ℃下，每分鐘釋放1 μmol 4-MU 所需要的酶量，用U 表示。比活力用每克蛋白所含的酶活力單位（U/mg）數(shù)表示。1 μg 待測(cè)樣品、不同pH 的PBS 緩沖液和底物0.5 mmol/L 的4-甲基傘形酮-β-D-N,N-二乙酰殼三糖〔4MU-（GlcNAc）2〕或4-甲基傘形酮-β-D-N,N,N-三乙酰殼三糖〔4MU-（GlcNAc）3〕，在37 ℃下孵育70 min，然后用 0.5 mol/L Na2CO3緩沖液終止反應(yīng)。用pH 7.4 的PBS 緩沖液配制梯度濃度0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 nmol 的4-MU 標(biāo)準(zhǔn)樣品，而待測(cè)樣品是1 μg 純化產(chǎn)物與2.5 nmol 的4MU-（GlcNAc）2/3，標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測(cè)樣品的反應(yīng)終體積均為100 μL，均在37 ℃、500 r/min 反應(yīng)70 min，最后在每孔加入 100 μL 的 0.5 mol/L 的Na2CO3溶液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在激發(fā)波長(zhǎng)370 nm、發(fā)射波長(zhǎng)448 nm 下的熒光強(qiáng)度測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅非魚3 種幾丁質(zhì)酶的cDNA 及其編碼的氨基酸序列

從吉富羅非魚胃中克隆得到tChit1a的ORF序列，全長(zhǎng)1 362 bp，編碼453 個(gè)氨基酸（AA）；Expasy 在線軟件預(yù)測(cè)蛋白大小為50.03 ku，等電點(diǎn)為6.14；SignalP 在線軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，前19 AA 為信號(hào)肽，緊接著為糖苷酶18 家族催化域343 AA，然后為43 AA 的連接區(qū)域，最后為48 AA 的幾丁質(zhì)結(jié)合域（圖1）。

從吉富羅非魚前腸和中腸中克隆得到tChi3的ORF 序 列，全 長(zhǎng)1 362 bp，編 碼453 AA；Expasy 在線軟件預(yù)測(cè)蛋白大小為50.03 ku，等電點(diǎn)為5.39；SignalP 在線軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，前19 AA 為信號(hào)肽，緊接著為糖苷酶18 家族催化域343 AA，然后是43 AA 的連接區(qū)域，最后為48 AA 的幾丁質(zhì)結(jié)合域（圖1）。

圖1 羅非魚3 種幾丁質(zhì)酶氨基酸序列比較Fig.1 Comparison of amino acid sequences of three chitinases of tilapia

從吉富羅非魚中腸中克隆得到tChit的ORF序列，大小為1 422 bp，編碼473AA；Expasy 在線軟件預(yù)測(cè)蛋白大小為52.44 ku，等電點(diǎn)為5.68；SignalP 在線軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，前20 AA 為信號(hào)肽，緊接著為糖苷酶18 家族催化域343 AA，然后為49 AA 的連接區(qū)域，最后為61 AA 的幾丁質(zhì)結(jié)合域（圖1）。

比對(duì)吉富羅非魚3 種幾丁質(zhì)酶序列，結(jié)果顯示tChit1a 與tChi3 的氨基酸序列相似度為83.66%，而tChit 與tChit1a、tChi3 的相似度則較低，分別為49.89%和50.11%。從結(jié)構(gòu)（圖1）來看，3 種幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)相似，在序列N 端具有信號(hào)肽和第18 家族糖苷催化域，C 端具有幾丁質(zhì)結(jié)合域，中間由連接域連接。其中，tChit1a 和tChi3 結(jié)構(gòu)相似，幾丁質(zhì)酶催化活性位點(diǎn)序列一致，而tChit的連接域長(zhǎng)于tChit1a 和tChi3 的連接域，有較多連續(xù)的蘇氨酸（Thr），且在催化活性位點(diǎn)有2 個(gè)氨基酸不一樣。

2.2 羅非魚3 種幾丁質(zhì)酶的進(jìn)行樹分析

本研究供試羅非魚與其他物種的幾丁質(zhì)酶進(jìn)化樹分析結(jié)果（圖2）顯示，羅非魚3 種幾丁質(zhì)酶既不屬于哺乳動(dòng)物的酸性幾丁質(zhì)酶和幾丁三糖苷酶，也不屬于魚類酸性幾丁質(zhì)酶1 和2，可歸類為魚類三型幾丁質(zhì)酶，即非酸性幾丁質(zhì)酶。

圖2 羅非魚與其他物種的幾丁質(zhì)酶進(jìn)化樹分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of chitinases among tilapia and other species

2.3 3 種幾丁質(zhì)酶在羅非魚不同組織中的表達(dá)

3 種幾丁質(zhì)酶在羅非魚不同組織中的表達(dá)結(jié)果顯示，tChit1a 在中腸的表達(dá)量最高，其次是前腸（圖3A）；而tChi3 在前腸的表達(dá)量最高，其次是中腸（圖3B）；tChit 主要在中腸后部表達(dá)（圖3C）?？梢姡_非魚3 種幾丁質(zhì)酶均主要在腸道中表達(dá)，在其他組織中表達(dá)量非常低。

圖3 幾丁質(zhì)酶tChit1a、tChi3 和tChit mRNA 在羅非魚不同組織中的分布Fig.3 Distribution of tChit1a,tChi3 and tChit in different tissues of tilapia

2.4 羅非魚胃幾丁質(zhì)酶的純化和酶活測(cè)定

利用幾丁質(zhì)樹脂純化羅非魚胃幾丁質(zhì)酶，SDS-PAGE 膠在40 ku 附近有兩條明顯條帶，50 ku 附近沒有明顯條帶（圖4A）。本研究所克隆獲得的3 種幾丁質(zhì)酶tChit1a、tChi3 和tChit 預(yù)測(cè)的成熟肽大小分別為48.01、48.11、50.425 ku，但Western blot 驗(yàn)證未在預(yù)測(cè)大小附近發(fā)現(xiàn)明顯條帶（圖4B）。用實(shí)驗(yàn)室前期制備的斜帶石斑魚1型幾丁質(zhì)酶多克隆抗體檢測(cè)，同樣沒有檢測(cè)到同源性高的條帶。

圖4 羅非魚胃幾丁質(zhì)酶的純化結(jié)果Fig.4 Purification of chitinases extracted from the stomach of tilapia

用4-MU法檢測(cè)純化產(chǎn)物的幾丁質(zhì)酶活性，結(jié)果如圖5所示，純化產(chǎn)物的幾丁質(zhì)降解酶活性為弱酸性，在pH 4～7之間活性較高，最適pH值為5.0。1 μg純化產(chǎn)物與2.5 nmol的4MU-（GlcNAc）2/3反應(yīng)70 min，在最適pH值下，降解4MU-（GlcNAc）2的酶活為1.73 U/g，降解4MU-（GlcNAc）3的酶活為4.89 U/g。

3 討論

本研究從吉富羅非魚中克隆獲得3 種幾丁質(zhì) 酶tChit1a、tChi3和tChit的ORF，這3 種 幾丁質(zhì)酶主要分布于中腸和前腸。tChit1a、tChi3和tChit 結(jié)構(gòu)相似，均屬于18 家族幾丁質(zhì)酶，預(yù)測(cè)的成熟肽大小分別為48.01、48.11、50.425 ku。其中tChit1a 和tChi3 的全長(zhǎng)氨基酸序列相似性較高，達(dá)83.66%，催化活性位點(diǎn)序列一致，而tChit 在該位點(diǎn)與它們則有兩個(gè)氨基酸差異，表明tChit1a 和tChi3 親緣關(guān)系更近。進(jìn)化樹分析表明，3 種幾丁質(zhì)酶不屬于魚類酸性幾丁質(zhì)酶-1（AFCase-1）和魚類酸性幾丁質(zhì)酶-2（AFCase-2），而與魚類幾丁質(zhì)酶-3（FCase-3）親緣關(guān)系更近。其中tChit 與金槍魚幾丁質(zhì)酶3、比目魚幾丁質(zhì)酶3 和虹鱒幾丁質(zhì)酶聚成一起，而tChit1a 和tChi3 則聚成另一分支，說明它們親緣關(guān)系較近。為更有效降解食物中的幾丁質(zhì)，硬骨魚魚類胃中表達(dá)兩種不同的幾丁質(zhì)酶，即AFCase-1 和AFCase-2，它們具有不同A：12% SDS-PAGE；B：Western blot，一抗：斜帶石斑魚1 型幾丁質(zhì)酶多克隆抗體（1 ∶4 000）M：Marker；1：純化樣品；箭頭指示克隆獲得的幾丁質(zhì)酶預(yù)測(cè)大小位置

A:12% SDS-PAGE;B:Western blot by using polyclonal anti-Chitinase 1 ofEpinephelus lanceolatus（1 ∶4 000）M:Marker;1:Purified product;Arrowhead showed the predicted protein of tChit1a,tChi3 and tChit的降解模式，AFCase-1 優(yōu)先水解GlcNAc 鏈的非還原端的第二糖苷鍵，而AFCase-2 優(yōu)先水解第三糖苷鍵［15］。但關(guān)于FCase-3 的研究較少。在褐菖鲉肝臟和腎臟表達(dá)的一種幾丁質(zhì)酶屬于FCase-3［16］。有關(guān)FCase-3 的降解特性還沒有報(bào)道。此外，羅非魚3 種幾丁質(zhì)酶的等電點(diǎn)均在5～6.5 間，略小于7.0，說明這3 種酶均偏中性，推測(cè)它們發(fā)揮催化作用的環(huán)境pH 也偏中性，具體功能需要進(jìn)一步探索。此外，為繼續(xù)探索羅非魚酸性幾丁質(zhì)酶，本研究分析了來源于NCBI 的尼羅羅非魚基因組注釋的另外12 種羅非魚幾丁質(zhì)酶，包 括XM_003440467.5、XM_003459039.4、X M_0 1 3 2 6 6 3 5 4.2、X M_0 1 9 3 4 9 7 5 6.2、X M_0 2 5 9 0 1 8 9 2.1、X M_0 2 5 9 0 1 8 9 1.1、X M_0 2 5 9 0 1 8 9 0.1、X M_0 1 9 3 4 9 7 5 0.2、X M_0 1 9 3 4 9 7 4 9.2、X M_0 0 5 4 4 8 5 6 1.3、XM_019355318.2 和XM_003459030.3，進(jìn)化分析結(jié)果顯示，它們不屬于AFCase-1 和AFCase-2，均歸類為FCase-3。

研究表明，tChit、tChit1a 和tChi3 主要在羅非魚前腸和中腸表達(dá)，在胃中的表達(dá)量相對(duì)較低。其他物種研究表明，大菱鲆的3 種幾丁質(zhì)酶在腸道高表達(dá)，其次是腦、皮膚和脾臟［17］；而日本沙丁魚幾丁質(zhì)酶的高表達(dá)組織是性腺［15］；褐菖鲉幾丁質(zhì)酶主要在肝和腎臟中表達(dá)［16］。不同的幾丁質(zhì)酶同工酶可能發(fā)揮不同的作用，包括免疫、消化和蛻皮等［4,18］。本研究中，tChit、tChit1a 和tChi3 幾丁質(zhì)酶均在腸道高表達(dá)，因此，推測(cè)這3種幾丁質(zhì)酶可能主要將上游進(jìn)行了部分分解的幾丁質(zhì)寡糖再進(jìn)一步水解，從而幫助機(jī)體消化吸收幾丁質(zhì)。

為了解羅非魚是否存在高活性的酸性幾丁質(zhì)酶，本研究通過純化胃蛋白以期獲得酸性幾丁質(zhì)酶。已有多種具有活性的幾丁質(zhì)酶在魚類胃中分離出來，且有多種同工酶，例如，在白姑魚的胃組織中純化獲得兩種大小分別為42、56 ku 的幾丁質(zhì)酶［19-20］；在褐菖鲉胃中發(fā)現(xiàn)3 種大小分別為46、52、56 ku 的幾丁質(zhì)酶［21］；在日本沙丁魚胃中純化得到大小為45、56 ku 的幾丁質(zhì)酶［15］。在六線魚胃組織中純化出47、51、62 ku 等3 種幾丁質(zhì)酶［22］。這些純化獲得的幾丁質(zhì)酶具有較高的酶活性，能夠降解pNP-（GlcNAc）n，推測(cè)幾丁質(zhì)酶活性與這些魚類棲息地和食物來源有關(guān)，它們均以海洋富含幾丁質(zhì)的貝類、甲殼類或浮游生物為食，胃組織中高活性的幾丁質(zhì)酶有助于它們消化食物中的幾丁質(zhì)。幾丁質(zhì)酶存在于許多魚類的胃中，但并不局限于胃組織，在其他組織中同樣發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶的表達(dá)和酶活性，例如在褐菖鲉腎臟中發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶mRNA 的表達(dá)［16］，在白姑魚腎臟檢測(cè)到幾丁質(zhì)酶活性［23］，在日本鯖魚幽門盲囊中檢測(cè)到幾丁質(zhì)酶mRNA［23］。但還未有研究展示胃以外組織的純化幾丁質(zhì)酶結(jié)果。

在前期研究中，我們成功純化獲得鞍帶石斑魚和赤點(diǎn)石斑魚胃組織中的幾丁質(zhì)酶，并通過了斜帶石斑魚1 型幾丁質(zhì)酶多克隆抗體的Western blot 驗(yàn)證。本研究中，我們首先從吉富羅非魚的胃組織中提取總蛋白，通過幾丁質(zhì)樹脂親和層析法分離純化幾丁質(zhì)酶，SDS-PAGE 結(jié)果顯示，我們只獲得約40 ku 的兩條條帶，且未能用多克隆抗體檢測(cè)到這兩條條帶。我們使用了較DNS法［24］更為靈敏的4-MU 法分析純化產(chǎn)物酶活性，結(jié)果顯示，在最適pH 5 的條件下，純化產(chǎn)物降解4MU-（GlcNAc）2的酶活為1.73 U/g，降 解4MU-（GlcNAc）3的酶活為4.89 U/g。以4-硝基 苯基-β-D-乙酰氨基葡萄糖〔pNP-（GlcNAc）n〕為底物，從六線魚胃組織純化獲得3 種幾丁質(zhì)酶的最佳酶活分別為3.04、1.25、2.37 U/mg［22］，從白姑魚胃中純化獲得的兩種幾丁質(zhì)酶降解pNP-（GlcNAc）3分別為0.109、2.07 U/mg［15］。本研究的羅非魚純化產(chǎn)物明顯低于這兩種魚的胃幾丁質(zhì)酶。而檢測(cè)真鯛、海鱸魚、六線魚、太平洋鱈魚和黃尾鰤等胃組織粗酶液的幾丁質(zhì)酶活性在0.24～1.59 U/g 之間［9］，與本研究獲得的純化產(chǎn)物幾丁質(zhì)酶活性接近。推測(cè)羅非魚胃中的幾丁質(zhì)酶蛋白表達(dá)量較低，通過幾丁質(zhì)樹脂親和層析法并不能很好地純化幾丁質(zhì)酶，后續(xù)可能需要用多種純化方法相結(jié)合，如在現(xiàn)基礎(chǔ)上再結(jié)合陰/陽離子交換層析方法等，以進(jìn)一步分離天然的幾丁質(zhì)酶，探究它們對(duì)不同形式完整幾丁質(zhì)底物的降解特性及反應(yīng)機(jī)制。幾丁質(zhì)在海洋貯藏量非常豐富［25］，其中包括大量蝦蟹殼。在處理蝦蟹殼廢料方面，除了魚類幾丁質(zhì)酶潛在的降解蝦蟹殼幾丁質(zhì)的作用外，細(xì)菌幾丁質(zhì)降解酶也是重要的潛在候選者。對(duì)蝦醬中篩選分離出來的細(xì)菌進(jìn)行全基因組測(cè)序，灰色鏈霉菌CS1801 包含103 個(gè)糖苷水解酶家族基因，體現(xiàn)了幾丁質(zhì)的降解潛力［26］。在海鮮工業(yè)廢物（蝦殼傾倒區(qū)）分離出的地衣芽孢桿菌（SSCL-10）的最高比活度為3.4 U/mL。對(duì)菌株進(jìn)行化學(xué)誘變并通過紫外線照射來篩選潛在的幾丁質(zhì)分解菌群，誘變模型已成功使突變型產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量提高了5～6 倍［27］。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，不同于以貝類、甲殼類或者浮游生物為食的魚類，羅非魚3 種幾丁質(zhì)酶tChit1a、tChi3和tChit主要在前腸或中腸中高表達(dá)，而在胃中的表達(dá)量很低。推測(cè)主要原因?yàn)榱_非魚是棲息在水體中下層的魚類，是以植物性餌料為主的雜食性魚類，其食物中的蝦蟹殼所占比例較小，這種食性影響到羅非魚幾丁質(zhì)酶的表達(dá)。因此，這3 種在羅非魚腸道不同位置表達(dá)的幾丁質(zhì)酶可能不同程度地參與羅非魚的消化吸收，但降解幾丁質(zhì)可能不是其主要功能。