基于重測序的民豬與大白豬SLAⅠ類基因多態(tài)性及抗病潛能差異分析

李婧娜，疏 澤，吳俊超，程 鋒，王立剛，王立賢

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

養(yǎng)豬業(yè)在我國畜牧業(yè)，甚至整個國民經(jīng)濟中都占著舉足輕重的地位。經(jīng)過長期發(fā)展，我國養(yǎng)豬業(yè)規(guī)?；潭仍絹碓礁撸请S著飼養(yǎng)密度增大，豬群的健康開始惡化，嚴重限制了生產(chǎn)效率，降低了豬場收益[1]。研究發(fā)現(xiàn)，中外豬種對疾病的抗性以及敏感性不同[2-3]。因此，通過對我國地方豬抗病機理的研究，可以提高豬的免疫能力、生活力及生產(chǎn)力[1]。

動物的免疫識別、對疾病的抵抗能力以及免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)一定程度上依賴于主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC，在豬中稱為豬白細胞抗原(swine leukocyte antigen,SLA))[4-5]。SLA對感染疾病后的免疫反應(yīng)以及對病毒的識別和清除具有很重要的作用[6-7]。SLA基因位于豬7號染色體著絲粒兩端，分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類[8-9]，具有高度多態(tài)性、單倍型遺傳、連鎖不平衡等特征[10]。SLAⅠ類基因主要分為3類：Ⅰa、Ⅰb和Ⅰc。Ⅰa包括SLA-1、SLA-2、SLA-3、SLA-4、SLA-5、SLA-9、SLA-11；Ⅰb包括SLA-6、SLA-7、SLA-8；Ⅰc包括MIC1和MIC2[11]。Ⅰa類基因中只有SLA-1、SLA-2、SLA-3具有完整的Ⅰ類基因結(jié)構(gòu)，可編碼SLAⅠ類分子。經(jīng)典SLAⅠ類基因包含8個 外顯子，其中前導(dǎo)多肽鏈是由外顯子1編碼，α1-3功能區(qū)域分別由外顯子2～4編碼，跨膜區(qū)由外顯子5編碼，胞質(zhì)區(qū)由外顯子6～8編碼。SLAⅠ類分子由重鏈和輕鏈(β2 m)組成，重鏈分為3個區(qū)，為胞漿區(qū)、跨膜區(qū)、胞外區(qū)。胞外區(qū)包含α1、α2和α3三個結(jié)構(gòu)域，多態(tài)性主要集中在α1、α2[12]。α1、α2形成抗原肽結(jié)合槽，α1和α2功能區(qū)的α螺旋結(jié)構(gòu)為該槽的兩側(cè)壁，底部為與α螺旋呈直角排列的8條反平行β片層鏈。肽結(jié)合槽底部有6個不同的口袋，決定了T淋巴細胞表位結(jié)合的特異性，不同的等位基因與不同類型的T細胞表位結(jié)合是由錨定殘基和氨基酸共同決定的[13]。SLAⅠ類分子多態(tài)性位點與HLAⅠ類分子多態(tài)性位點幾乎完全重疊，這些氨基酸多態(tài)性位點在HLAⅠ類分子中參與抗原肽遞呈或與T細胞受體結(jié)合[14]。在MHC分子中，與抗原肽結(jié)合起遞呈作用的主要是抗原識別位點(ARSs)。在人類MHC(HLA)Ⅰ類分子中，ARSs由57個氨基酸組成，分為3部分，即抗原結(jié)合槽、T細胞受體結(jié)合區(qū)、外側(cè)的氨基酸殘基，其側(cè)鏈遠離抗原結(jié)合槽及TCR。MHCⅠ類分子在疾病發(fā)生中的作用研究除了人和其他哺乳動物以及禽類，同樣對魚類、兩棲類、鳥類、哺乳類的MHC的研究也有很多[15-23]。

我國地方豬資源豐富，高抗病力是地方豬種的重要特性。研究發(fā)現(xiàn)，在感染不同的病原體之后，中國地方豬種對疾病的敏感性比其他引入品種要強，具有較為明顯的抗病力，其癥狀和病變也相對較輕[24-26]。一些中國地方豬種，如中國合作豬的SLAⅠ類分子的多態(tài)性要高于商品化白豬，這與合作豬對周圍環(huán)境高度的適應(yīng)性、耐粗飼、抗病性強等特點一致[27]。民豬是分布在中國東北地區(qū)的優(yōu)良品種，具有免疫力較高、抗病性強等特征。為找出該豬種與大白豬經(jīng)典SLAⅠ類基因及其編碼蛋白的差異，為地方豬抗病力的研究提供分子基礎(chǔ)，本研究選取了具有高抗病能力的地方豬種——民豬，與大白豬進行基因組重測序，擬分析不同品種經(jīng)典SLAⅠ類基因的遺傳多態(tài)性及對抗病潛能的影響，旨在為闡明民豬的抗病機理提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所使用的樣本均來自于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所昌平種豬場，飼養(yǎng)條件、飼喂方式和飼料等均始終保持一致。試驗樣本包括8頭民豬和4頭大白豬的耳組織。

1.2 組織DNA提取及測序

對大白豬和民豬的耳組織采用常規(guī)的酚仿法提取DNA，利用NanoDrop 1000 (Thermo Scientific,USA)測定DNA的濃度與質(zhì)量。將質(zhì)檢合格的樣品利用Illumina Hi-seq2500進行雙末端測序，測序深度為5×～7×。

1.3 測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制與多態(tài)位點的檢測和注釋

獲得原始測序序列后，利用GATK軟件中的Base Recalibration進行質(zhì)控，對reads的堿基質(zhì)量值進行校正。對接頭序列及poly N，poly A等序列進行刪除，將過濾后的reads數(shù)通過BWA比對到豬參考基因組(Susscrofa11.1)，并進行SNP calling，進一步質(zhì)控得到可用于后續(xù)分析的SNP，在ENSEMBL的VEP工具中導(dǎo)入SNP，使用Gene symbol、Transcript version、Transcript biotype、Transcript support level、APPRIS、MANE參數(shù)進行注釋，并統(tǒng)計突變類型和數(shù)量。

1.4 SLAⅠ類基因單倍型塊分析

使用VCFtools中的-vcf、-out、-chr、-from-bp、-to-bp 參數(shù)提取SNP后利用GEVALT[28]軟件Gerbil模塊中的-pedfile、-blockputput參數(shù)對SNP進行單倍型塊分析[29]。利用R(R version 3.6.1)包的circlize進行單倍型圖譜構(gòu)建，進一步統(tǒng)計單倍型長度和數(shù)目作為單倍型結(jié)構(gòu)的指標。

1.5 經(jīng)典SLAⅠ類基因核苷酸序列比對和核苷酸多態(tài)性分析

在Mega 7[30]軟件中利用Clustal W進行分析，得到核苷酸以及氨基酸序列的比對結(jié)果。利用DnaSP 6.12[31]統(tǒng)計序列的核苷酸多態(tài)性。

1.6 經(jīng)典SLAⅠ類基因編碼蛋白質(zhì)一般特性分析

運用Expasy服務(wù)器上的ProtParam工具(https://web.expasy.org/protparam)對經(jīng)典SLAⅠ類基因所編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進行預(yù)測和分析，同時利用Expasy服務(wù)器上的Protscale程序(https://web.expasy.org/protscale)進行疏水性、親水性預(yù)測，分析不同突變對經(jīng)典SLAⅠ類基因所編碼蛋白質(zhì)性質(zhì)的影響。

2 結(jié) 果

2.1 民豬和大白豬SLAⅠ類基因的SNP和單倍型比較分析

本研究使用單倍型塊長度作為單倍型結(jié)構(gòu)多樣性的指標。本試驗對民豬和大白豬的SLAⅠ類基因進行SNP和單倍型塊的分析，其中單倍型塊的長度越短、數(shù)量越多代表其多樣性越高。表1顯示，民豬SLAⅠ類基因的SNP數(shù)量要多于大白豬。通過對兩豬種SNP突變類型所占比例的分析發(fā)現(xiàn)，民豬中錯義突變共248個占比為2%，內(nèi)含子變異共8 069個占比65%(圖1A)；大白豬共有196個SNP為錯義突變占比2%，內(nèi)含子變異共6 266個 占比64%(圖1B)。通過對不同品種的單倍型長度及每一個單倍型塊中單倍型個數(shù)的分析發(fā)現(xiàn)，民豬的SLAⅠ類基因平均單倍型個數(shù)(4.107)要多于大白豬的SLAⅠ類基因平均單倍型個數(shù)(3.547)(圖2A)。民豬中長度較短的單倍型所占比例(>60%，圖2B)要大于大白豬的占比(>50%，圖2C)。

表1 東北民豬和大白豬SLAⅠ類基因單核苷酸多態(tài)性分布表Table 1 Single nucleotide polymorphism distribution of SLA class I genes of the Min pigs and Large White pigs 個

A.民豬堿基突變類型所占比例；B.大白豬堿基突變類型所占比例A.Proportion of base mutation types in Min pigs;B.Proportion of base mutation types in Large White pigs圖1 民豬和大白豬SLAⅠ類基因突變類型統(tǒng)計圖Fig.1 Statistics of mutation types of SLAⅠ gene in Min pigs and Large White pigs

2.2 民豬和大白豬經(jīng)典SLAⅠ類基因的等位基因多樣性

本研究對基因SLA-1、SLA-2和SLA-3等位基因序列進行分析，并計算核苷酸多樣性(Pi)，其結(jié)果如表2所示。對于3個經(jīng)典SLAⅠ類基因，民豬的核苷酸多樣性都要高于大白豬，說明民豬的遺傳多樣性高于大白豬。

表2 SLA-1、SLA-2、SLA-3基因的核苷酸多態(tài)性Table 2 Nucleotide polymorphisms of SLA-1,SLA-2 and SLA-3 genes

2.3 民豬和大白豬經(jīng)典SLAⅠ類基因及編碼氨基酸多態(tài)性比較分析

對民豬和大白豬12個樣本所測得的SLA-1、SLA-2、SLA-3的第2和3外顯子的核苷酸序列與杜洛克豬基因序列進行多態(tài)性比較分析。結(jié)果表明，在3個基因中民豬的堿基突變及位于抗原結(jié)合位點的氨基酸突變數(shù)量都要多于大白豬的數(shù)量。

2.3.1 兩豬種SLA-1基因及氨基酸多態(tài)性比較 在SLA-1基因中共發(fā)現(xiàn)了2種等位基因。民豬中共有39個堿基發(fā)生突變，共導(dǎo)致10個氨基酸發(fā)生改變，其中有4個位于抗原結(jié)合位點上；大白豬中共有14個堿基發(fā)生突變，共有3個氨基酸發(fā)生改變，并無氨基酸位于抗原結(jié)合位點上(圖3和圖4)。SLA-1基因所編碼的20種氨基酸中，精氨酸(Arg)數(shù)目最多，在民豬中占整個氨基酸組成的18.9%，在大白豬中占18.4%。民豬負電荷殘基總數(shù)(Asp+Glu)為20，正電荷殘基總數(shù)(Arg+Lys)為34，大白豬分別為20和33，民豬和大白豬中編碼產(chǎn)物的不穩(wěn)定指數(shù)分別為76.24和80.37，不穩(wěn)定指數(shù)大于40，則兩品種豬SLA-1基因編碼產(chǎn)物都是不穩(wěn)定的。氨基酸序列親水性/疏水性預(yù)測結(jié)果如圖5A和5B所示，民豬第73位的蘇氨酸和第74位的丙氨酸分值最低(-2.989)，親水性最強，第161位的絲氨酸疏水性最強(1.211)；大白豬中第26位的半胱氨酸親水性最強(-2.833)，第160位的絲氨酸疏水性最強(1.211)。在整條氨基酸肽鏈中，民豬的總平均親水性為-0.931，大白豬的總平均親水性為-0.901，二者都表現(xiàn)為親水性。

A.民豬和大白豬單倍型分布；B.民豬不同單倍型塊長度所占比例；C.大白豬不同單倍型塊長度所占比例A.Haplotype distribution of Min pigs and Large White pigs;B.Proportion of different haplotype blocks length of Min pigs;C.Proportion of different haplotype blocks length of Large White pigs圖2 民豬和大白豬SLAⅠ類基因的單倍型及單倍型塊長度百分比Fig.2 The percentage of haplotypes and haplotype blocks length of the SLA classⅠ genes of Min pigs and Large White pigs

2.3.2 兩豬種SLA-2基因及氨基酸多態(tài)性比較 在SLA-2基因中共發(fā)現(xiàn)了2種等位基因。民豬中共有25個堿基發(fā)生突變，共導(dǎo)致18個氨基酸發(fā)生改變，其中有3個位于抗原結(jié)合位點上；大白豬中共有17個堿基發(fā)生突變，共有13個氨基酸發(fā)生改變，并無氨基酸位于抗原結(jié)合位點上(圖3和圖4)。SLA-2基因所編碼的20種氨基酸中，丙氨酸在民豬中占比最多為9.4%，精氨酸在大白豬中占比最多為9.4%，半胱氨酸占比最低，在兩種豬中均為1.1%，民豬負電荷殘基總數(shù)(Asp+Glu)為24，正電荷殘基總數(shù)(Arg+Lys)為22，大白豬分別為26和22，民豬和大白豬的氨基酸理論等電點(PI)分別為5.97和5.27，編碼產(chǎn)物的不穩(wěn)定指數(shù)分別為24.88和32.02，不穩(wěn)定指數(shù)小于40，則兩品種豬SLA-2基因編碼產(chǎn)物都是穩(wěn)定的。氨基酸序列親水性/疏水性預(yù)測結(jié)果如圖5C和圖5D所示，民豬第16位的丙氨酸分值最低(-2.811)，親水性最強，第23位的甘氨酸疏水性最強(1.078)。大白豬第60位的亮氨酸親水性最強(-2.878)，同時第105位的亮氨酸疏水性最強(1.089)。在整條氨基酸肽鏈中，民豬的總平均親水性為-0.835，大白豬的總平均親水性為-0.823，二者都表現(xiàn)為親水性。

2.3.3 兩豬種SLA-3基因及氨基酸多態(tài)性比較 在SLA-3基因中共發(fā)現(xiàn)了2種等位基因。對于民豬，共有39個堿基發(fā)生突變，共導(dǎo)致9個氨基酸發(fā)生改變，其中有7個位于抗原結(jié)合位點上；對于大白豬，共有30個堿基發(fā)生突變，共有8個氨基酸發(fā)生改變，有2個氨基酸位于抗原結(jié)合位點上(圖3和圖4)。SLA-3基因所編碼的20種氨基酸中，精氨酸(Arg)數(shù)目最多，在民豬中占整個氨基酸組成的19.6%，在大白豬中占19.00%。民豬負電荷殘基總數(shù)(Asp+Glu)為18，正電荷殘基總數(shù)(Arg+Lys)為36，大白豬分別為18和35，民豬和大白豬的氨基酸理論等電點(PI)分別為11.82和11.79，編碼產(chǎn)物的不穩(wěn)定指數(shù)分別為76.44和79.12，不穩(wěn)定指數(shù)大于40，則兩品種豬SLA-3基因編碼產(chǎn)物都是不穩(wěn)定的。氨基酸序列親水性/疏水性預(yù)測結(jié)果如圖5E和圖5F所示，民豬和大白豬第121位的半胱氨酸和第122位的絲氨酸分值最低(-3.000)，親水性最強。民豬和大白豬第166位的甘氨酸疏水性最強(1.122)。在整條氨基酸肽鏈中，民豬的總平均親水性為-1.000，大白豬的總平均親水性為-0.965，二者都表現(xiàn)為親水性。

圓點代表氨基酸相同，字母代表氨基酸發(fā)生改變,星號表示抗原結(jié)合位點Dots indicate the same amino acid as reference,letters show substitutions of amino acid,and the putative peptide-binding regions (PBR)are marked with asterisks圖4 SLA-1、SLA-2、SLA-3基因第2、3外顯子編碼氨基酸序列比對Fig.4 Alignment of the SLA-1,SLA-2,SLA-3 amino acid sequences in exon 2 and 3

A.民豬SLA-1;B.大白豬SLA-1;C.民豬SLA-2;D.大白豬SLA-2;E.民豬 SLA-3;F.大白豬SLA-3A.SLA-1 of Min pigs;B.SLA-1 of Large White pigs;C.SLA-2 of Min pigs;D.SLA-2 of Large White pigs;E.SLA-3 of Min pigs;F.SLA-3 of Large White pigs圖5 SLA-1、SLA-2、SLA-3蛋白的疏水性預(yù)測結(jié)果Fig.5 The hydrophobicity profile of SLA-1,SLA-2,SLA-3 analyzed by ProtScale program

3 討 論

在2006年全國藍耳病爆發(fā)期間，某項調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，萊蕪豬、魯萊黑豬、萊蕪雜交二元母豬的死亡率較低，分別為0、0、0.6%，但是國外品種母豬的死亡率則高達54%，說明我國地方豬的抗病能力要高于外種豬，暗示中外豬種的免疫能力可能存在差異。民豬與萊蕪黑豬同屬黃淮海黑豬，是我國優(yōu)良的地方品種，同樣具有抗病力強的特點[32]。本試驗從全局層面闡述了中外豬種不同SLAⅠ類基因多樣性，對抗病力較強的地方豬——民豬和大白豬SLAⅠ類基因的SNP以及發(fā)生錯義突變的SNP進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)民豬的數(shù)量都要高于大白豬，這可能使多肽鏈的氨基酸種類和序列發(fā)生改變。本試驗還對單倍型進行分析，發(fā)現(xiàn)民豬具有更多長度較短的單倍型塊，并且平均單倍型個數(shù)要高于大白豬，表明民豬的單倍型復(fù)雜程度更高，排列的方式更多，具有豐富的多樣性[33]。

MHCⅠ類分子都含兩條獨立的多肽鏈，一條為MHC編碼的α或重鏈，另一條為非MHC編碼的β鏈。MHCⅠ類分子包含4個獨立區(qū)：氨基末端細胞外肽結(jié)合區(qū)、細胞外免疫球蛋白樣區(qū)、穿膜區(qū)和胞漿區(qū)。SLAⅠ類基因具有高度豐富的多態(tài)序列區(qū)域主要集中在編碼區(qū)的第2和第3外顯子[34]，其主要編碼SLAⅠ類分子的α1和α2區(qū)域[35](氨基末端細胞外肽結(jié)合區(qū))，而α3區(qū)域則是高度保守的。編碼SLA抗原的基因具有豐富的多態(tài)性，多等位基因決定了多種SLA分子，其可結(jié)合不同的蛋白質(zhì)抗原肽。劉建欣和鄭昌學(xué)[36]的研究發(fā)現(xiàn)，MHC基因復(fù)合體多態(tài)性位點是由基因重復(fù)產(chǎn)生的。新的位點形成以后，不再受原功能限制，因而可以產(chǎn)生新的功能。Ando等[37-38]在SLA-1、SLA-2、SLA-3外顯子1、2、3中發(fā)現(xiàn)了等位基因多樣化，并且導(dǎo)致其編碼的SLAⅠ類分子的α1和α2區(qū)的氨基酸呈現(xiàn)高度多態(tài)性。核苷酸多樣性是衡量群體遺傳多樣性的重要指標，該值越高表示群體遺傳變異程度越高，對不同的環(huán)境具有很強的適應(yīng)能力[39]。劉德武等[40]對廣東藍塘豬、大花白豬及4個引入品種的群體遺傳結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，地方品種的群體內(nèi)遺傳變異要高于引入品種。本研究對民豬和大白豬SLA-1、SLA-2、SLA-3的核苷酸多樣性進行分析，民豬3個基因的核苷酸多樣性均高于大白豬。結(jié)果表明，民豬的遺傳多樣性優(yōu)于大白豬?？赡苁且驗椴煌i種所生長的環(huán)境不同，從而具有不同的抵抗能力，導(dǎo)致具有不同的遺傳多態(tài)性[41]。

MHC多態(tài)性明顯表現(xiàn)出適應(yīng)性意義，如抗病性和免疫應(yīng)答能力增強，對環(huán)境適應(yīng)性能力的提高等[27]。SLAⅠ類分子中參與抗原肽結(jié)合的主要是抗原識別位點(ARSs)，由α1和α2區(qū)兩個α螺旋結(jié)構(gòu)及一個β片層結(jié)構(gòu)構(gòu)成。本試驗中，民豬和大白豬經(jīng)典SLAⅠ類基因在3個基因位點都高度雜合，SLA-1、SLA-2、SLA-3基因外顯子2、3序列上的堿基突變表現(xiàn)出了多態(tài)性，具有極為豐富的變異。在民豬和大白豬中所檢測到的SLA-1、SLA-2、SLA-3等位基因各有2個，表現(xiàn)出等位基因多樣化，民豬堿基突變的數(shù)量均多于大白豬，編碼的氨基酸位于抗原結(jié)合位點的數(shù)量也均多于大白豬，這可能是民豬的抗病力比大白豬強的原因之一。同樣，這些變異位點也可以為豬抗病能力的分子標記輔助選擇育種提供新的候選分子標記。

MHCⅠ類分子幾乎表達于所有有核細胞表面[42]，其多態(tài)性位點主要分布在與肽結(jié)合的區(qū)域，使得MHCⅠ類分子具有不同的抗原遞呈特征。本研究對SLA-1、SLA-2、SLA-3基因編碼產(chǎn)物氨基酸的組成、疏水性預(yù)測分析的結(jié)果對其蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、構(gòu)象和功能的研究具有重要意義，是進一步研究該基因作為疾病候選基因可能性的基礎(chǔ)。對于SLA-1、SLA-3基因，兩個豬種編碼產(chǎn)物均為不穩(wěn)定蛋白，且大白豬的不穩(wěn)定性要高于民豬；對于SLA-2，兩個豬種編碼產(chǎn)物均為穩(wěn)定蛋白。兩個豬種的SLA-1、SLA-2、SLA-3氨基酸均表現(xiàn)為親水性，編碼產(chǎn)物均為可溶性蛋白，并且民豬的SLA-1、SLA-2、SLA-3氨基酸親水性都要比大白豬強，民豬3個 基因編碼產(chǎn)物具有較高的親水性可能是由于較高的氨基酸變異率造成的。

4 結(jié) 論

本研究通過對民豬和大白豬SLAⅠ類基因的研究，發(fā)現(xiàn)民豬具有更強的多態(tài)性。同時，本研究對經(jīng)典SLAⅠ類基因的外顯子2和3進行分析，發(fā)現(xiàn)民豬的堿基突變以及位于抗原結(jié)合位點上氨基酸突變的數(shù)量都要多于大白豬。結(jié)果表明，民豬的SLAⅠ類基因具有更加豐富的多態(tài)性。本研究結(jié)果為分析不同豬種SLAⅠ類基因的遺傳多態(tài)性提供了理論基礎(chǔ)。