食源性病原菌激發(fā)固有免疫細胞胞外誘捕網(wǎng)的研究進展

錢 滿，廖成水，張春杰

(河南科技大學動物科技學院 洛陽市活載體生物材料與動物疫病防控重點實驗室，洛陽 471023)

大腸桿菌、沙門菌、單增李斯特菌、葡萄球菌、鏈球菌等食源性病原菌在食品加工、運輸、儲藏過程中造成污染。這些病原菌在食品中能夠引發(fā)食物的腐敗變質(zhì)，病原菌產(chǎn)生的有毒物質(zhì)也在食品中累積，直接或間接導致動物和人體的感染，從而引發(fā)嚴重的公共衛(wèi)生問題。免疫細胞受到病原菌刺激后活化并釋放以DNA為骨架的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，該網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物被稱為胞外誘捕網(wǎng)(extracellular traps,ETs)。ETs是一種新發(fā)現(xiàn)的固有免疫防御機制，可以捕獲入侵的病原菌，使其聚集在較小的范圍內(nèi)，防止其進一步擴散。此外，ETs的DNA骨架上還分布有許多顆粒蛋白和水解酶，這些毒性蛋白和水解酶可殺傷病原菌，從而發(fā)揮抗感染作用[1-2]。目前，食源性人獸共患病的防控是解決公共衛(wèi)生問題的關鍵之一。本文就食源性病原菌激發(fā)固有免疫細胞ETs的研究進展作一綜述(表1)，以期為病原微生物感染性疾病的防控提供新的思路。

1 大腸桿菌與固有免疫細胞ETs

人類單核細胞分別與大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白念珠菌孵育后，均可形成單核細胞胞外誘捕網(wǎng)(mononuclear extracellular traps,MoETs)，并通過吞噬作用、核DNA和MoETs胞外DNA的解聚作用對病原菌作出應答[3]。小鼠巨噬細胞J774A.1在大腸桿菌刺激下可形成類似巨噬細胞胞外誘捕網(wǎng)(macrophage extracellular traps,METs)樣的結(jié)構(gòu)(METs-like structures,METs-LS)，METs-LS由DNA和殺菌蛋白(如組蛋白、髓過氧化物酶和溶菌酶)組成，其形成過程與NADPH氧化酶(NADPH oxidase,NOX)產(chǎn)生的活性氧(reactive oxygen species,ROS)無關，該過程不會導致細胞裂解。另外METs-LS可以在感染部位捕獲入侵的病原菌并防止其擴散，但不能殺死病原菌，且產(chǎn)生過量的METs-LS還會破壞巨噬細胞的正常功能[4]。此外，蝦的血細胞受到大腸桿菌刺激也可形成ETs捕獲大腸桿菌[5]。從患敗血癥兒童外周血中分離得到的大腸桿菌，不能誘導源于健康個體的中性粒細胞釋放中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps,NETs)，這可能與患病兒童的免疫力低下有關[6]。研究發(fā)現(xiàn)，髓系中性粒細胞PLB-985在感染野生型大腸桿菌菌株C1845后形成的NETs，不僅可以捕獲、固定和殺死野生型C1845菌株，還能通過與腸上皮細胞的局部直接接觸導致上皮損傷，尤其在患者患有腸炎性疾病的情況下，其導致的損傷更嚴重[7]。

致病性大腸桿菌(uropathgenicEscherichiacoli,UPEC)感染泌尿系統(tǒng)期間，細菌被中性粒細胞釋放的DNA纖維結(jié)構(gòu)物捕獲，并遭遇到DNA纖維上的抗菌顆粒和組蛋白[8]。人乳鐵蛋白的外源性治療降低了UPEC對上皮細胞的黏附，增強了中性粒細胞的殺菌作用，促進ETs的形成[9]。乳腺病原性大腸桿菌菌株P4能激活正常的牛中性粒細胞產(chǎn)生NETs，利用與臨床牛酮病相當?shù)摩?羥基丁酸酯(β-hydroxybutyrate,BHBA)濃度刺激牛體，發(fā)現(xiàn)BHBA可降低中性粒細胞對牛乳腺致病性大腸桿菌和其他腸致病性大腸桿菌菌株的殺菌活性和NETs釋放水平，原因可能是BHBA會抑制細胞凋亡和影響ROS的形成[10]。NETs存在的條件下，C-型凝集素-1(dendritic cell-associated C-type lectin-1,dectin-1)受體蛋白可作為傳感器，通過下調(diào)中性粒細胞彈性蛋白酶到細胞核的轉(zhuǎn)運過程，從而抑制NETosis的產(chǎn)生，且缺乏dectin-1會加重感染期間NETosis和NETs介導的組織損傷[11]。另外，在腸致病性大腸桿菌和產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌感染時，腸道內(nèi)形成的尿酸晶體可誘導腸道的炎癥反應，從而促進NETs的形成與釋放[12]。

2 沙門菌與固有免疫細胞ETs

腸炎沙門菌或雛雞沙門菌與異嗜性粒細胞共孵育后，異嗜性粒細胞能夠產(chǎn)生ETs[13]。沙門菌耐藥位點SAL1和SLC11A1與嗜異性粒細胞抗菌活性以及胞外誘捕物的產(chǎn)生有關。NETs與SIVA-1/CD27介導的細胞凋亡共同決定了SAL1的抗性作用，而ETs形成的細胞死亡機制ETosis可能通過CD27/SIVA-1介導的凋亡途徑起作用[14]。

生物素A(biochanin A,BCA)、遺傳系差異、飼料日糧中免疫調(diào)節(jié)劑的添加等多種因素影響ETs的形成。BCA是部分植物中存在的異黃酮成分，可通過AMPK/ULK1/mTOR介導的自噬和METs的釋放增強機體對沙門菌的殺傷和清除胞外沙門菌[15]。而日糧中添加免疫調(diào)節(jié)劑可增強雞異嗜性粒細胞ETs的釋放和對病原菌的殺滅作用[16]。

3 單增李斯特菌與固有免疫細胞ETs

單增李斯特菌能夠刺激肥大細胞，使其進行被膜修飾并釋放纖維網(wǎng)狀DNA，該DNA與組蛋白和類胰蛋白酶復合形成肥大細胞胞外誘捕網(wǎng)(mast cell extracellular traps,MCETs)。此外，阻斷NADPH氧化酶可減少肥大細胞釋放DNA，抑制MCETs的形成，從而降低MCETs殺死病原體的能力[17]。小膠質(zhì)細胞屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的單核吞噬細胞，其在受到細菌刺激后，能形成和釋放小膠質(zhì)細胞胞外誘捕網(wǎng)(microglia extracellular traps,MiETs)并殺滅細菌，從而阻止菌體在機體內(nèi)的傳播與擴散[18]。

脫氧核糖核酸酶I(deoxyribonuclease I,DNase I)不能抑制髓過氧化物酶和NADPH氧化酶的活性，但能夠降解ETs的DNA，從而影響ROS的產(chǎn)生。因此，病原微生物衍生的DNase I對ROS產(chǎn)生的抑制作用將有助于病原逃避宿主細胞的殺傷作用[19]。β-己糖胺酶屬外切糖苷酶，是調(diào)控部分MCETs抗菌活性的關鍵酶[18]。C型凝集素5A是黃病毒家族的模式識別受體，其參與NETs和NETosis的形成，也與單增李斯特菌的ROS和促炎細胞因子的產(chǎn)生與釋放有關[20]。BH3-only蛋白是Bcl-2蛋白家族中啟動和調(diào)節(jié)細胞凋亡的重要成員，當細胞受到某些信號刺激后，BH3-only蛋白活化，其活性受轉(zhuǎn)錄和翻譯后修飾的調(diào)控，且BH3-only蛋白缺陷小鼠清除細菌的能力比野生型小鼠強，這可能與ROS的濃度增加、NETs的釋放和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的下調(diào)有關[21]。γ干擾素(IFN-γ)能夠增強NADPH氧化酶介導的單增李斯特菌感染的MiETs的形成，而且李斯特菌腦膜炎模型鼠腦勻漿和腦脊液中IFN-γ、環(huán)境DNA和核小體水平的升高與臨床腦膜炎患者腦脊液中水平呈正相關[18]。

4 葡萄球菌與固有免疫細胞ETs

金黃色葡萄球菌通常不存在于健康人的皮膚中，但易定植在皮炎患者皮膚上。中性粒細胞并非直接捕獲病原微生物[22]，而是間接通過NETs與角質(zhì)形成細胞的相互作用促進金黃色葡萄球菌的皮膚定植[23]。金黃色葡萄球菌通過將NETs轉(zhuǎn)換為脫氧腺苷來逃避中性粒細胞的殺傷，并且脫氧腺苷可誘導Caspase-3介導的免疫細胞凋亡過程。在此過程中，NETs需要金黃色葡萄球菌所分泌的核酸酶和腺苷合酶才能夠轉(zhuǎn)化為脫氧腺苷，且核酸酶和腺苷合酶是巨噬細胞清除葡萄球菌的關鍵酶[24]。DNase I的預防性給藥可顯著減少耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus,MRSA)和甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(methicillin sensitiveStaphylococcusaureus,MSSA)菌株生物被膜的形成。因此，DNase I在臨床中具有控制金黃色葡萄球菌誘導感染性心內(nèi)膜炎的潛力。另外，血小板有助于NETs的形成，在血小板存在的條件下，MRSA分離物(MW2)誘導NETs的形成與產(chǎn)生水平比MSSA分離物(HG001)高[25]。

社區(qū)獲得性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(community-associated methicillin-resistantStaphylococcusaureus,CA-MRSA)菌株能夠分泌高水平的水溶性酚醛樹脂調(diào)控蛋白(PSMs)，這些肽是CA-MRSA的重要毒力因子。CA-MRSA與水溶性酚醛樹脂調(diào)控蛋白α(phenol-soluble modulin α,PSMα)能夠觸發(fā)中性粒細胞迅速形成NET，且該過程不依賴ROS、髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)和去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)的活性，4 ℃條件下也可形成NETs。有趣的是，PSMα誘導形成的細胞外誘捕網(wǎng)的形態(tài)和功能與丙二醇甲醚醋酸酯誘導形成的經(jīng)典NETs難以區(qū)分[26]。蛋白A是金黃色葡萄球菌誘導NETosis的決定因素。添加純化的蛋白A可提高該蛋白基因缺失菌株引起的NETosis，且滅活的金黃色葡萄球菌不會誘導NETosis[27]。殺白細胞素(LukGH)不會引發(fā)人類中性粒細胞產(chǎn)生更多ROS，也不能增強人類中性粒細胞對金黃色葡萄球菌的結(jié)合與攝取。LukGH促進NETs的釋放，釋放的NETs雖然可捕捉金黃色葡萄球菌，但卻無法將其殺死[28]。由于LukGH的作用，中性粒細胞的吞噬作用和NETs兩種殺菌機制均無法有效清除生物被膜，且金黃色葡萄球菌核酸酶介導的NETs DNA降解作用有助于被NET捕獲的生物被膜狀態(tài)細菌的存活[29]。

潘頓-瓦倫丁殺白細胞毒素能刺激中性粒細胞迅速產(chǎn)生針對金黃色葡萄球菌的NETs，這與之前報道的NETs形成方式不同，主要區(qū)別在于它不依賴氧化過程，且中性粒細胞的裂解和線粒體DNA的釋放并不需要破壞質(zhì)膜[30]。Toll樣受體(toll-like receptor,TLR)是脊椎動物天然免疫系統(tǒng)中的關鍵模式識別受體，地塞米松能夠降低中性粒細胞對胞外病原體的殺傷，且金黃色葡萄球菌誘導的中性粒細胞胞外病原體殺傷作用可能是通過調(diào)節(jié)Toll樣受體來控制的[31]。核酸酶Nuc1是金黃色葡萄球菌的主要毒力因子之一，有助于細菌逃避NETs介導的殺傷作用。而克林霉素和免疫球蛋白可降低Nuc1的轉(zhuǎn)錄水平，減弱核酸酶的活性，從而增強NETs介導的清除作用[32]。此外，通過電滲作用在中性粒細胞質(zhì)膜上形成孔洞，也可以誘導NETs的形成，這一發(fā)現(xiàn)與NETs在非特異性細胞溶解過程中形成的觀點一致[28]。白介素33(interleukin-33，IL-33)是IL-1家族細胞因子的一員，被認為是Th2型免疫反應的強觸發(fā)器。在體外和體內(nèi)試驗中，IL-33引起的NETs產(chǎn)量增加提高了NETs對金黃色葡萄球菌的誘捕和殺傷活性[33]。

5 鏈球菌與固有免疫細胞ETs

生物被膜狀態(tài)和浮游狀態(tài)的豬鏈球菌2型(SS2)均能夠誘導中性粒細胞趨向感染部位，且生物被膜狀態(tài)的SS2能夠逃避NETs的殺傷作用。因為生物被膜基質(zhì)可以抑制NETs的釋放，但從生物被膜基質(zhì)中分離出來的細菌卻仍然具有誘導宿主細胞形成NETs的能力[34]。A族鏈球菌是一種重要的人類病原體，參與多種黏膜和系統(tǒng)感染。A族鏈球菌菌毛可誘導中性粒細胞IL-8的產(chǎn)生與釋放，從而促進NETs釋放，捕獲和殺死病原體[35]。研究發(fā)現(xiàn)，NETs的降解產(chǎn)物可能在A族鏈球菌引起的咽部感染中起作用。脫氧核糖核酸酶通過降解NETs逃避中性粒細胞胞外殺傷作用，且經(jīng)消化處理的NETs上清液可促進A族鏈球菌誘導的細胞死亡[36]。噬菌體編碼的A族鏈球菌DNase(Sda1)有利于病原體逃避NETs的殺傷。固有免疫系統(tǒng)的免疫壓力可促進高毒力突變細菌的產(chǎn)生，從而增加感染與傳播的風險[37]。通過研究馬鏈球菌亞種胞外核酸酶單突變ENuc或5 Nuc菌株及雙突變ENuc和5 Nuc菌株發(fā)現(xiàn)，馬鏈球菌主要通過ENuc或5 Nuc的作用直接將NETs DNA主鏈降解為脫氧腺苷，但雙突變ENuc 5 Nuc菌株不能將NETs DNA主鏈降解為脫氧腺苷[38]。

肺炎鏈球菌是引起兒科傳染病——中耳炎的重要病原菌。在患急性中耳炎期間，Toll樣受體4通過調(diào)節(jié)ROS和自噬來控制抗肺炎鏈球菌的NETs形成，且NETs能夠捕獲并殺死肺炎鏈球菌[39]。肺炎鏈球菌α-烯醇化酶是一種新型的中性粒細胞結(jié)合蛋白，可誘導NETs的形成，增加中性粒細胞的遷移活性并誘導中性粒細胞的死亡[40]。NETs的形成依賴于自噬，不受溶血素的影響，但溶血素能夠抑制NETs對細菌的捕獲和殺傷[41]。豬鏈球菌膜囊泡(MVs)中存在的枯草素樣蛋白酶(SspA)和DNase(SsnA)兩種毒力因子也可降解NETs，這將有助于豬鏈球菌逃避NETs的殺傷作用[42]。肺炎鏈球菌菌株具有不同程度的耐藥性，這種耐藥性的變異是由于肺炎鏈球菌毒力因子表面蛋白A(PspA)的異質(zhì)性造成的。缺乏PspA表達的菌株對NETs介導的殺傷作用更加敏感。經(jīng)抗PspA抗體處理的肺炎球菌對NETs的黏附性增強，但對NETs殺傷的敏感性降低[43]。鏈球菌膠原樣蛋白1(Scl-1)是侵襲性M1T1血清型A族鏈球菌中表達水平較高的蛋白之一。Scl-1保護A族鏈球菌免受NETs內(nèi)抗菌肽的影響，有利于細菌抵抗NETs的殺傷作用。此外，Scl-1可干擾髓過氧化物酶的產(chǎn)生，從而抑制NETs的形成與釋放[44]。

6 其他病原菌與固有免疫細胞ETs

結(jié)核分枝桿菌可在體內(nèi)誘導NETs的產(chǎn)生，且滅活的結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌卡介苗、恥垢分枝桿菌以及結(jié)核分枝桿菌衍生的脂質(zhì)體均是NETs的良好誘導劑[45]。另外，缺氧條件下，結(jié)核分枝桿菌抑制NETs的產(chǎn)生以及影響中性粒細胞的凋亡和壞死[46]。在指數(shù)生長期，銅綠假單胞菌誘導人中性粒細胞ETs的形成，而在細菌生長的后期，其誘導NETs能力顯著下降。鞭毛是銅綠假單胞菌的主要成分，可誘導NETs的產(chǎn)生，但純化的銅綠假單胞菌鞭毛蛋白卻不能刺激人中性粒細胞產(chǎn)生ETs。因此，銅綠假單胞菌誘導NETs釋放需要的是鞭毛的運動性，而不是鞭毛與宿主細胞上的鞭毛感受器的結(jié)合活性[47]。從嚴重慢性疲勞綜合征重癥患者中獲得的NETs結(jié)構(gòu)為擴散形式，而從輕/中度疾病患者中獲得的NETs為球形，且細菌分子外毒素S、綠膿桿菌素S2和銅綠假單胞菌鐵載體均與NET的形成有關[48]。人的中性粒細胞在體外受到煙曲霉菌刺激時也會產(chǎn)生NETs，NETosis對菌絲的抑制作用最強，但對休眠和膨大的分生孢子抑制作用較弱。此外，煙曲霉中疏水蛋白RodA是一種能夠引發(fā)免疫抑制作用的表面蛋白，可減少NETs的形成與釋放[49]。

C型凝集素受體Mincle在肺炎克雷伯菌感染期可誘導NETs的形成，Mincle-/-能夠減弱中性粒細胞形成NETs的能力，這與體內(nèi)外自噬激活過程的受損有關，但中性粒細胞ROS的形成并不受影響。利用外源性自噬誘導物三苯氧胺的治療研究解決了Mincle-/-中性粒細胞的NETs形成能力減弱的問題，這進一步證明了Mincle具有調(diào)節(jié)自噬的重要作用[50]。結(jié)核分枝桿菌誘導的NETs依賴于活性氧和吞噬作用，且中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑可延遲NETs的形成。而結(jié)核分枝桿菌誘導的NETs與熱休克蛋白72(Hsp72)結(jié)合，可觸發(fā)Hsp72介導的巨噬細胞促炎作用[51]。雙功能酶Rv0888是一種新的結(jié)核分枝桿菌細胞外因子，具有核酸酶和鞘磷脂酶活性，Rv0888鞘磷脂酶活性可以在小鼠體外和肺中誘導NETs的形成，并增強恥垢分枝桿菌在小鼠肺中的定植能力[52]。ESX-1分泌系統(tǒng)是結(jié)核分枝桿菌中存在的一種特殊的蛋白分泌系統(tǒng)，也被稱為VII型分泌系統(tǒng)，ESX-1分泌系統(tǒng)在細菌發(fā)揮毒力的過程中起著重要作用。ESAT-6是最早發(fā)現(xiàn)的ESX-1分泌蛋白之一，它引起細胞內(nèi)Ca2+超負荷，緊接著磷脂酰絲氨酸翻轉(zhuǎn)到細胞外表面，中性粒細胞發(fā)生壞死，并刺激以DNA和髓過氧化物酶為主要成分的NETs的形成[53]。ESX-1分泌系統(tǒng)能夠促進IFN-γ誘導的METs形成，有助于結(jié)核分枝桿菌在METs中的聚集，且IFN-γ反過來能夠增強ESX-1介導的巨噬細胞壞死[54]。

銅綠假單胞菌是造成細菌性角膜炎的主要原因?；铙w顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，中性粒細胞移動到銅綠假單胞菌生物被膜處，在細菌三型分泌系統(tǒng)釋放的毒力因子刺激下形成NETs。此時NETs作為一個類似屏障的結(jié)構(gòu)，將細菌限制在局部環(huán)境中，阻止細菌的進一步擴散[55]。Zn2+螯合劑鈣衛(wèi)蛋白與曲霉誘導的NETs有關，雖然加入的Zn2+能消除NETs介導的煙曲霉芽管生長的抑制作用，但是還不足以殺死煙曲霉菌[56]?；魜y弧菌胞外核酸酶Xds和Dns在與中性粒細胞接觸后誘導NETs的形成，而霍亂弧菌在NETs的存在下反過來誘導兩種胞外核酸酶并迅速降解NETs的DNA組分[57]。銅綠假單胞菌能夠編碼DNA酶的操縱子，分泌的DNA酶有助于降解NETs 的DNA，有利于銅綠假單胞菌逃避NETs介導的殺傷作用[58]。黏附素A(YadA)是食源性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌和假結(jié)核耶爾森菌的重要毒力因子，NETs能捕獲并殺滅表達YadA的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌。此外，野生型鼠疫耶爾森菌EV76能夠逃避NETs的殺傷作用，而表達YadA的重組菌EV76不能夠逃避NETs的殺傷作用[59]。

7 展 望

食源性病原菌污染造成的食品公共衛(wèi)生安全問題形勢愈加嚴峻。作為新型的抗菌機制，ETs可以捕獲和殺死病原體，阻止病原體的擴散與傳播，表現(xiàn)出抗病毒、抗菌、抗寄生蟲等活性[60]，這為食源性疾病的預防和治療提供了新的方向。盡管國內(nèi)外學者針對病原體與固有免疫細胞ETs的互作已開展了大量研究，但絕大多數(shù)工作仍停留在病原體激發(fā)ETs釋放的淺層次階段，對于ETs形成的分子機制及信號通路僅限于初步研究。此外，ETs是一把“固有免疫的雙刃劍”，ETs的主骨架DNA可作為抗原誘導局部組織損傷或血栓形成，進而導致自身免疫性疾病[61]。因此，在未來的研究中，應進一步揭示病原體激發(fā)ETs形成的機制，并明確異常ETs對自身正常細胞和組織產(chǎn)生損傷的相關機制。