基于抗體篩查的美國豬群流行性腹瀉病毒真流行率分布推斷

張志誠，陳梅娟，艾 軍

(1.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，國家非洲豬瘟參考實驗室，青島 266032;2.寧夏大學農學院,銀川 750000；3.昆明海關技術中心，昆明 650228)

豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)為尼多病毒(Nidovirales)目、冠狀病毒(Coronaviridae)科、α-冠狀病毒(Alphacoronavirus)屬成員[1]，是一種可引起豬急性腹瀉、嘔吐、脫水和仔豬高死亡率的傳染性腸道病毒。PEDV最初20世紀70年代出現(xiàn)在英國，隨后迅速傳至西班牙等其他歐洲國家。PEDV于2013年5月首次在美國發(fā)現(xiàn)，并迅速傳播，導致美國養(yǎng)豬業(yè)損失嚴重[2]。PEDV感染對豬健康危害極大，雖然其對人的感染和直接危害尚未報道，但單就PEDV病毒遺傳基因序列與在蝙蝠體內發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒具有高度相似性[3-6]以及實際生活場景中人-豬生態(tài)界面的多重重復性、深度交叉性和互動性而言，提示該病毒對公共衛(wèi)生安全具有特殊意義，隨著2020年新型冠狀病毒Sars-CoV-2(COVID-19)在全球大流行以來，這種不確定性風險越來越被廣泛關注。冠狀病毒科由4個屬組成：α冠狀病毒、β冠狀病毒、γ冠狀病毒和δ冠狀病毒[7-8]。α屬的冠狀病毒和β屬冠狀病毒對哺乳類動物危害極大，α屬的冠狀病毒對哺乳動物致病的代表性成員有HCoV-229E、HCoV-NL63、PEDV、傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)、豬呼吸道冠狀病毒(porcine respiratory coronavirus,PRCV)以及近些年發(fā)現(xiàn)的由蝙蝠中一種新型的HKU2冠狀病毒外溢到豬群的高致死性豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒(swine acute diarrhoea syndrome coronavirus,SADS-CoV)等[9-10]。β冠狀病毒包括HCoV-OC43、HCoV-HKU1、severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus (SARS-CoV)、Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV)以及目前全球流行的SARS-CoV2(COVID-19)等[7]。γ冠狀病毒和δ冠狀病毒主要對禽類等危害嚴重，但也會對哺乳動物有嚴重危害，如δ屬的成員有豬δ冠狀病毒 (porcine delta-coronavirus,PDCoV)[7-8]。養(yǎng)殖家畜及野生哺乳動物豬、牛、蝙蝠等在Sars-CoV-1、Mers-CoV以及Sars-CoV-2等人間冠狀病毒的幾次大流行中都被認為具有某種特殊的流行病學意義，蝙蝠體內冠狀病毒與PEDV高度相似的基因序列[3-6]，提示養(yǎng)殖家畜和人群的生態(tài)界面的互動可能會加速病毒的種間變異。PEDV作為一種感染可導致豬高死亡率的冠狀病毒，目前雖無直接證據(jù)表明其和目前全球流行的新型冠狀病毒COVID-19的直接關聯(lián)，但其作為RNA病毒的冠狀病毒科、α-冠狀病毒亞屬成員，在遺傳變異、致病力、傳播擴散以及宿主危害選擇等方面存在極大的不確定性和可變性，同時其也是國際貿易，尤其是當前中美生豬及豬肉貿易中具有重要檢疫性意義的病原微生物。為此，本文在對PEDV的病原學、流行病學、傳播途徑結合近年來美國PEDV流行株發(fā)生和監(jiān)測等方面信息挖掘基礎上，基于2019年美國生豬入境我國西南地區(qū)陸路口岸利用抗體檢測篩查結果，結合貝葉斯統(tǒng)計推斷，依托Poptools在Excel的插件作為量化平臺，開展對美國豬群中的PEDV真流行率的分布推斷研究，以期為當前美國生豬及豬肉制品入境我國口岸的風險管理及其檢疫監(jiān)測和抽樣技術提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

本研究中美國養(yǎng)殖豬群PEDV先驗信息表觀流行率的咨詢主要包括來自2019年11和12月美國豬病報告系統(tǒng)對育肥豬(wean to market)、母豬(sow)和無法確定生長階段和身份的豬(unknown status)的監(jiān)測結果(檢測數(shù)和陽性數(shù))的報告[Domestic Disease Monitoring Reports-Swine Health Information Center &Swine Disease Reporting System(SDRS)|College of Veterinary Medicine |Iowa State University (iastate.edu)]，美國豬病研究平臺系統(tǒng)(SDRS)[11]是一個可以公開訪問的監(jiān)測報告系統(tǒng)，游走的不確定身份豬PEDV監(jiān)測信息[12]來自PubMed國際科技網絡平臺文獻資料查新。2019年度來自美國進口生豬入境中國口岸監(jiān)測和檢測信息，來自國家出入境檢驗檢疫局昆明海關技術中心實驗室。

1.2 PEDV入境我國口岸篩查與檢測

目前PEDV診斷試劑可分為病毒學和血清學方法的試劑兩類。病毒學的試劑主要針對病原、核酸和蛋白，而血清學的試劑主要是針對由于感染引起的免疫應答的抗體檢測。2019年，美國入境中國西南陸路昆明海關的活豬的口岸篩查使用ID Screen PEDV Indirect ELISA抗體檢測試劑盒 (ID Screen?PEDV Indirect Screening test (IDvet,Grabels,France)。按照ID Screen?PEDV Indirect Screening test試劑盒判定標準的說明，S /P%≥60%被認為是抗體陽性，而<60%被認為是陰性。

1.3 貝葉斯統(tǒng)計推斷

貝葉斯理論和方法是知識學習、統(tǒng)計決策以及風險優(yōu)化過程[13]，同時也是人工智能(artificial intelligence-AI)技術和機器學習的統(tǒng)計理論基礎，其廣泛應用于進化醫(yī)學和生物學、醫(yī)療診斷[10,14-17]、人口調查與統(tǒng)計評估、監(jiān)測與抽樣[18-29]等多個方面。貝葉斯統(tǒng)計的表達公式：

①

其中，Pr(θ)為“先驗分布”，它表達了觀察和認知X事件前對X事件相關因素的認識程度或經驗的描述，為處理問題實際需要，它通?？梢杂媒y(tǒng)計分布函數(shù)來簡化，用以表達對事件X事件的一種確認度不高的,或者不確定性的認識。X在本文中為美國豬群中的PEDV感染狀況分布。動物個體對特定病源微生物的感染狀態(tài)函數(shù)通常用二項分布函數(shù)(Binomial distribution)或者伯努利分布 (Burnell distribution)函數(shù)來描述[25,30-31]，但畜群感染特定病源微生物流行率推斷要復雜得多，臨床癥狀或者可靠的實驗室檢測可以為該參數(shù)的估計和推斷提供先驗認知。先驗分布代表了在探究、探索和查詢目標事件發(fā)生前，人們已經存在的對目標事件的一種經驗分布和認識，對該概念及其參數(shù)化的認識是貝葉斯統(tǒng)計與傳統(tǒng)的基于頻率分布的數(shù)值統(tǒng)計的最本質區(qū)別。本研究的先驗分布函數(shù)定義為在開展美國生豬入境昆明口岸開展抗體檢測篩查前的PEDV在美國的發(fā)生狀況的認識。本文中美國豬群中攜帶PEDV的先驗分布信息主要是通過查詢美國豬病研究平臺(SDRS)咨詢，以2019年11—12月監(jiān)測報告中的陽性檢測數(shù)及其表觀流行率分布為基數(shù)，選擇利用二項分布模型的共軛分布函數(shù)模型Beta(α，β)來描述美國豬群PEDV在開展本研究之前的未知患病率，以其作為統(tǒng)計推斷真流行率的先驗信息，其中，α=陽性檢測數(shù)量+1，β =陰性檢測數(shù)量+1[10,25]，Beta分布：

Prior P(ρ)～Beta(α,β)=>ρ|α,β=B (α,β)ρα-1(1-ρ)β-1

②

Pr(X|θ)“似然函數(shù)”(likelihood function)，Pr(X|θ)表達為在給定先驗分布Pr(θ)的條件下隨機觀察到事件X的概率分布。二項分布的X(xi)的概率質量函數(shù)-Binomial distribution probability mass function (pmf)的計算表達式

③

Pr(θ|X)為“后驗分布”，它用來描述觀察x事件后先驗認知和綜合了新咨詢后認知到的X，它也是貝葉斯推斷的最終目標。在本文中指代美國豬群PEDV真流行率分布函數(shù)，該分布函數(shù)的真實數(shù)值分布可以通過系統(tǒng)監(jiān)測和大樣本抽樣來獲取，更大的樣本抽樣監(jiān)測可以為獲取真實流行率提供更加有把握的統(tǒng)計認知和確認，但大樣本的監(jiān)測和抽樣對應的是大的人力、物力和財力投入。統(tǒng)計抽樣提供了解決此問題的思路，通常通過一定數(shù)量小樣本抽樣可以獲取近似準確的認識?；诖苏J識作為假設，以入境我國西南陸路昆明口岸的美國生豬作為美國養(yǎng)殖豬群中的一個小樣本抽樣，該入境豬群樣本可以在一定程度上反映美國豬群的統(tǒng)計特征，但不同樣本數(shù)量大小(N)所附帶的統(tǒng)計特征的不確定性會有較大差異?；谠撁绹刖成i小樣本在昆明口岸利用IDVetScreen?PEDV Indirect Screening test試劑盒開展的PEDV實驗室抗體篩查檢測為進一步從統(tǒng)計上更新了對美國豬群的PEDV實際流行率的認識。

2 結 果

2.1 口岸PEDV抗體檢測及其參數(shù)分布

PEDV基因組是單股正鏈RNA，基因組全長約 28 kb,其主要由3個部分組成，包括 5′端非編碼區(qū)(5′-UTR)，3′非編碼區(qū)(3′-UTR)，7 個開放閱讀框(ORF1a、ORF1b、ORF2～6)，其中ORF編碼12種非結構蛋白與4種結構蛋白[spike (S)、envelope (E)、membrane (M)、nucleocapsid (N)]和1種ORF3編碼的NS3B輔助蛋白[32]。目前，在美國豬群中至少存在兩種遺傳上不同的PEDV菌株，即PEDV原型菌株(U.S.PEDV prototype strain)和S-INDEL變異菌株(S-INDEL-variant strain)[33-36]。此外新近分離到的 PEDV PC177和 Minnesota188被認為是原型菌株的變種[37]。目前，對PEDV的血清學檢測試劑包括間接熒光抗體 (indirect fluorescent antibody，IFA)、病毒中和試驗 (virus neutralization，VN)、基于全病毒(whole virus，WV)酶聯(lián)免疫ELISA抗體試劑，基于重組的S1蛋白ELISA和基于N (nucleocapsid)蛋白的ELISA等[37],其都是基于原型毒株(U.S.PEDV prototype),但Chen 等[37]2016的研究顯示，目前基于原型株-U.S.PEDV prototype的血清學檢測試劑都可以檢出變異株-S-INDEL-variant strain的抗體。

2019—2020年，美國入境的生豬在西南陸路口岸實驗室利用IDVet ELISA開展抗體篩查，該試劑盒主要是針對PEDV G2b基因組的N蛋白。Gerber等[38]2016年度在美國開展的針對IDVetScreen?PEDV Indirect Screening test試劑盒的驗證試驗顯示，該試劑盒的檢測敏感性 (diagnostic sensitivity,DSe)為73.7% (95% CI=71.5%～79.6%)，檢測的特異性(diagnostic specificity,DSp)為98.4% (95% CI=96.6%～99.5%)。從Gerber等[38]的驗證試驗看，基于重組N蛋白的IDVet-ELISA抗體試劑盒監(jiān)測PEDV感染后生豬的免疫球蛋白的敏感性和特異性數(shù)值區(qū)域分布與其他參評試驗的4個劑盒差異并不明顯。5個試劑盒都具有相對較低的敏感性和表現(xiàn)一般的特異性，從側面說明豬群感染PEDV隱秘性和準確探測的難度，同時也指示出目前應用的商用試劑盒開展的對PEDV監(jiān)測檢測準確性都存在一定的不確定性。要準確推導發(fā)病狀況，利用具有明確驗證參數(shù)的檢測試劑和方法的監(jiān)測，才可以用以有效推斷特定病原微生物在特定群體中的真實流行狀況。Gerber等[38]研究已經為推斷PEDV流行率提供了非常有價值的參數(shù)，為較好地描述該試劑盒探測PEDV抗體數(shù)值準確程度的變化性和不確定性，基于Gerber等參數(shù)驗證的研究和實驗室測試的感染數(shù)據(jù)，利用Pert (Min,Median,Max)統(tǒng)計分布來隨機表達該試劑盒的檢測準確性(diagnostic sensitivity-DSe、Diagnostic specificity-DSp)參數(shù)分布，此分布參數(shù)涵蓋的數(shù)值區(qū)間的變化性將參與后續(xù)的真流行率的分布估計和推斷。該試劑盒的Dse和DSp的數(shù)值區(qū)間的統(tǒng)計分布如圖1所示。

圖1 2019—2020年美國入境中國西南陸路口岸豬只的抗體篩查方法的檢測敏感性與檢測特異性分布Fig.1 Distribution of the diagnostic sensitivity &diagnostic specificity of antibody screening test used for PEDV detection in Kunming entry port

2.2 美國豬群2019年PEDV監(jiān)測及其先驗發(fā)生率

美國豬病監(jiān)測包括養(yǎng)殖豬群的SDRS (swine disease reporting system)監(jiān)測和對游走的不確定身份豬的監(jiān)視。美國無身份游蕩豬群的監(jiān)視主要由美國動植物檢疫局(US Department of Agriculture Animal &Plant Health Inspection Services)野生動物研究中心(Wildlife Services National Wildlife Research Center,WSNWR)負責系統(tǒng)實施和開展。Bowman等[39]和Scott等[40]的研究認為美國PEDV的發(fā)生是養(yǎng)殖豬群的感染發(fā)生在先，然后傳播擴散到了游走的不確定身份豬等其他豬的群體，這一結論的證據(jù)是游走的不確定身份豬等監(jiān)測的PEDV陽性核酸要比養(yǎng)殖豬群的PEDV陽性核酸的出現(xiàn)晚一年以上。針對現(xiàn)階段美國游走的不確定身份豬群PEDV的感染狀況，Bevins等[12]采集了大量野豬的血清，并對其進行了PEDV暴露風險和兩次抗體檢測篩查，結果推斷美國游走的不確定身份豬的PEDV血清患病率為0.1% (95%CI=0.03%～0.16%)。美國豬病監(jiān)測報告系統(tǒng)基于PEDV核酸PCR分析[11]顯示，2017—2019年，美國養(yǎng)殖豬群的PEDV RNA核酸陽性檢出隨月份和不同抽檢群體間都具有較明顯差異，其中育肥 (wean to market)階段豬群體中的陽性檢出最高，能繁母豬(adult/sow)次之，而其他不確定生長階段類型豬的樣品(unknown)的檢出率最低。2019年9月份為12.98%，母豬場的PEDV檢測水平為5.24%，11月份為14.19% (415/2 129),12月份陽性檢出比例升至15.64% (483/3 089)。2020年1月份PEDV陽性病例的百分比較2019年12月份有較大幅度提高，其中明尼蘇達州和北卡羅來納州的陽性檢出率升幅較為顯著，最高可以達到25.3%。2020年2—5月，PEDV感染呈現(xiàn)下降態(tài)勢，考慮到2020年COVID-19在美國流行狀況的影響，此階段的PEDV陽性檢出率下降可能和這段區(qū)間內豬群監(jiān)測的范圍、取樣頻率、樣本選擇和取樣數(shù)量等有一定關聯(lián)。此外，PEDV陽性檢出率還受監(jiān)測方案中的檢測方法和試劑選擇的影響?；诿庖邞鸬拈g接免疫抗體檢測方法更能有效反映病原感染的真實發(fā)病率，而PCR的檢測超高敏感性由于樣品在豬場采集以及實驗室質量控制的不確定性可能導致出現(xiàn)的大量假陽性問題也被廣為關注[41-45]。

2.3 美國豬群PEDV后驗流行率分布推斷

美國豬群2019年PEDV監(jiān)測的先驗發(fā)生率顯示，美國豬群中PEDV感染發(fā)病狀況分布上隨著生豬生產不同階段感染狀況具有時間差異性和不同地理區(qū)域的空間異質性，PEDV在美國豬群中的感染面廣，且其分布有極大的區(qū)間不確定性，這給區(qū)間生豬移動和豬肉貿易帶來了巨大的挑戰(zhàn)和安全威脅。根據(jù)中華人民共和國海關與出入境檢驗檢疫局的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示：2016—2020年，來自美國入境我國口岸的活豬數(shù)量巨大，特別是自2018年8月我國非洲豬瘟疫情發(fā)生后，國內豬的存欄和種質資源減小，豬肉市場受到極大沖擊，美國入境的豬及其產品數(shù)量會在近幾年呈現(xiàn)大幅度增加的態(tài)勢。2019年，來自美國South Dakota(Mound City)、Kentucky(Adolphus)、Missouri(Washburn,Montgomery City)等地入境中國西南陸路口岸的生豬1 930頭份，其中利用ID Screen PEDV Indirect ELISA抗體檢測試劑盒(ID Screen?PEDV Indirect Screening test (IDvet,Grabels,France)隨機抽檢開展檢疫篩查的184頭份樣品，結果顯示無抗體陽性樣品檢出?；谶@一批次樣品利用抗體檢測試劑盒的檢測結果，作為對美國豬群PEDV的貝葉斯認知更新，利用貝葉斯推斷模型①-②-③來優(yōu)化美國豬群PEDV真流行率，推斷結果顯示PEDV在美國豬群中的真流行率分布中位值(Median)為0.005 22(95% CI=0.000 424～0.022 5)，如圖2概率密度高度右偏(Positively Skewed &Right Skew)紅色曲線所示，而基于PubMed及美國豬病檢測平臺等科技咨詢的檢出率作為先驗信息的流行率中位值為0.065 4(95% CI=0.06～0.07)(圖2藍色曲線所示)。在對美國豬群PEDV發(fā)生率先驗分布和口岸實驗室的抗體檢測方法參數(shù)分布認識的基礎上，利用貝葉斯推斷模型①-②-③，在基于2019年度口岸實驗室對美國South Dakota、Kentucky、Missouri等三地入境豬的血清樣品的抗體檢測結果更新優(yōu)化基礎上，利用概率密度統(tǒng)計分布特性可以推斷：美國豬群的PEDV真流行率最大可能分布主要集中在2.5%百分位數(shù)(P2.5%=0.000 19)與中位數(shù)(P50%=0.005 22)之間(圖2)。概率密度高度正偏的數(shù)據(jù)統(tǒng)計分布的趨勢顯示，美國PEDV真流行率大于0.02的可能性相對較低，雖然隨機抽樣群體的PEDV分布值可能會有小概率(P≤2.5%)溢出分布大于0.03的可能(圖2)?；谪惾~斯統(tǒng)計推斷和口岸實驗室抗體檢測結果優(yōu)化的美國PEDV真流行率最大可能分布區(qū)間這一統(tǒng)計特征值將會作為美國PEDV疫情發(fā)生狀況更新前，我國口岸針對PEDV檢驗檢疫抽樣樣品計算量的最主要依據(jù)。

圖2 貝葉斯推斷的美國豬群PEDV感染的先驗流行率與后驗流行率分布Fig.2 Distribution of Bayesian inference on posterior prevalence and prior prevalence of PEDV in US swine population

3 討 論

2013年，PEDV傳入美國 (US PEDV isolate，USA/NC35140/2013)[12],給美國養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大危害和損失。作為冠狀病毒的PEDV 屬于RNA病毒，具有可變性強、易于發(fā)生突變等的特點。目前研究顯示在美國豬群中至少存在兩種遺傳上不同的PEDV毒株，即PEDV原型株 (U.S.PEDV prototype strain)和S-INDEL變異株 (S-INDEL-variant strain)[33-36]。

美國豬群PEDV先驗分布的數(shù)據(jù)挖掘顯示，美國養(yǎng)殖豬群和游走的不確定身份豬的PEDV表觀流行率分布具有極大區(qū)間差異和群間差異。SDRS應用PCR的監(jiān)測顯示[11]：育肥豬的陽性率明顯高于能繁母豬和其他豬群，而利用基于N蛋白和S1重組蛋白的免疫抗體ELISA方法篩查的游走豬的PEDV感染率(IgG)較PCR檢測的養(yǎng)殖豬群的PEDV顯著的低。常規(guī)PCR和實時逆轉錄聚合酶鏈反應(rRT-PCR)等分子診斷方法與傳統(tǒng)的其他方法相比被認為具有更高的分析敏感性和分析特異性。不同PEDV rRT-PCR的敏感性和特異性雖有差異，但Miller等[41]研究顯示，PEDV rRT-PCR分析敏感性通?？梢赃_到1個拷貝的RNA。極高的分析敏感性也就意味著極高概率的污染風險，對實驗室生物安全水平、污染控制、樣品處理及其實驗室檢測等提出了極高的要求,同時證據(jù)也顯示，大量rRT-PCR陽性樣品在動物回歸試驗和攻毒試驗中不顯示感染性。特別是在用消毒劑處理的PEDV樣品用PCR處理后依然呈現(xiàn)陽性，故而研究認為對PCR陽性或者弱陽性的實驗室結果的需要謹慎的解釋[41-45]。從這個角度解釋，養(yǎng)殖豬群的PEDV核酸檢測結果可能會存在有部分陽性樣品為假陽性結果。

2019年，來自美國South Dakota等三州入境中國西南陸路口岸的生豬，利用IDVet抗體檢測試劑盒(ID Screen?PEDV Indirect Screening test (IDvet,Grabels,France)檢疫篩查的184頭份樣品，無抗體陽性樣品檢出。基于這一批次樣品抗體檢測結果，作為對美國豬群PEDV流行率的貝葉斯認知更新，利用貝葉斯推斷模型①-②-③來優(yōu)化美國豬群PEDV真流行率，推斷結果顯示PEDV在美國豬群中的真流行率中位值(Median)為0.005 22(95% CI=0.000 424～0.022 5)(圖2)?；诤篁灧植剂餍新实母怕拭芏瘸尸F(xiàn)高度右偏(Positive Skew)的統(tǒng)計特征，推斷美國豬群的PEDV真流行率最大可能分布值主要集中在2.5%百分位數(shù)(P2.5%=0.000 19)與中位數(shù)(P50%=0.005 22)之間區(qū)域，95%的高置信上限(UCL)的流行率分布為3%。統(tǒng)計概率密度高度正偏(圖2)的分布數(shù)據(jù)也提示：美國PEDV真流行率大于0.02的可能性相對較低，雖然局部地區(qū)隨機抽樣群體的PEDV分布值可能會有小概率溢出分布大于0.03的可能(P≤2.5%)。這一估計值與美國WSNWR Bevins等[12]基于2012—2015年度間大樣本(n=7 997)利用高特異性(DSp=100%)和高敏感性(DSe=88%)的基于S1重組蛋白ELISA方法監(jiān)測結果推斷的PEDV在游走豬群體中95% UCL-高置信上限保持一致 (online Technical Appendix Tables 1,2,https://wwwnc.cdc.gov/EID/article/24/7/17-2077-Techapp1.pdf)。

利用貝葉斯統(tǒng)計方法推斷，在先驗信息挖掘的基礎上，結合口岸實驗室抗體檢測結果，優(yōu)化對美國PEDV真流行率的估計，對認識和了解美國豬群感染PEDV狀況及對來自美國的生豬入境我國口岸的檢疫監(jiān)管、風險管控和風險決策具有突破性的技術意義。流行率是公共衛(wèi)生和動物衛(wèi)生健康應對傳染病流行認知最為基本和關鍵的指標，同時其也是后續(xù)風險干預、風險管理和風險監(jiān)測的基礎指標。流行率通常有表觀流行率和真流行率之分。表觀流行率最為常見，是檢測陽性數(shù)量與檢測樣本量的比率，其以假定檢測方法為金標準，以100%準確性(100% DSe,100% DSp,100% 重復率等)為假設。但在實際場景中，金標的方法雖然可能存在，但其適用范圍和場景非常有限，或者僅在試劑比對和驗證中應用。在常規(guī)監(jiān)測檢測中所應用的方法很少可以或者基本無法達到金標的要求。檢測總是會有錯誤率和不確定性，假陰性和假陽性結果總是會與檢測結果相伴隨。故而在很多情景下，表觀流行率給我們提供的咨詢雖然有一定意義，但也可能是一種直觀的誤導。如以口岸實驗室檢測結果的表觀流行率來比較，口岸利用抗體檢測試劑盒的陽性檢出數(shù)量為0，其表觀流行率為0，直觀的解釋是此次入境的動物100%不存在PEDV感染或者不攜帶PEDV病原微生物。但考慮到檢測方法的檢測敏感性和檢測特異性不可能同時達到100%[10,25,27]，這種推斷顯然是不符合常識和實際。

與表觀流行率相對應的是真流行率，對真流行率的認識是傳染病控制和預防的基礎。真流行率表達的是在特定測試條件下對某種疫病在群體中流行狀況的認識。由于生物機體、致病微生物及健康的復雜性，群體中特定疫病發(fā)生的真流行率數(shù)值通常很難獲取，但貝葉斯統(tǒng)計推斷為人們提供了一種思路和解決方案，即后驗分布可以無限逼近這一分布。基于對先驗信息的認知，在后驗信息如最新實驗室檢測數(shù)據(jù)和結果更新的基礎上，利用統(tǒng)計推斷方法不斷提高和優(yōu)化對真實發(fā)病率的認識，這就是本文推導美國PEDV真實發(fā)病率的思路。在本研究如圖2的概率密度分布顯示，貝葉斯優(yōu)化后的后驗概率分布的中位值(紅色曲線)，即美國PEDV真流行率最可能值0.005 22(95% CI=0.000 424～0.022 5)與先驗分布的統(tǒng)計中位值(藍色曲線)0.065 4(95% CI=0.06～0.07)存在多達十多倍以上的數(shù)值差距?？梢悦黠@看出，先驗分布的流行率認識要明顯高于后驗分布的流行率，其基本假設是檢測所用試劑的完全理想化以及假定檢測方法具有100%的臨床檢測敏感性DSe和100%臨床檢測特異性DSp的準確度。PEDV自2013年在美國出現(xiàn)US PEDV分離株USA/NC35140/2013后，很快鑒定出原型毒株(US PEDV Protoype)和變異毒株(S INDEL)，此后報道的PC177以及2014年Marthaler 等[36-37]分離到的可能的第三毒株 Minnesota188?？紤]到目前的血清學方法和檢測試劑如IFA、VN、WV-ELISA、S1-ELISA、N-ELISA等都是基于美國原型毒株(US PEDV Protoype)設計[37]的，故而在美國豬群中PEDV毒株分布存在多樣性的條件下，利用現(xiàn)有試劑達到100%準確性，在理論上是不具有操作性和可能性的。

PEDV真流行率分布受到PEDV病原微生物學特性、流行毒株分布類型、樣品抽檢類型與方法、樣品處理技術、實驗室檢測、試劑盒檢測準確性等一系列環(huán)境和質量控制等因素綜合決定的，故而具有一定的不確定性。由于生物遺傳多樣性和環(huán)境變量控制的難度，特定疫病在特定群體中的流行率分布具有不確定性是一種客觀存在。對于PEDV，其流行毒株多、進化變異快、且其宿主數(shù)量分布廣，加之小樣本監(jiān)測、抽樣檢測及實驗室等環(huán)境控制的隨機性和不確定性，其真流行率具有較大的區(qū)間變化和時間變化，為降低這種不確定性，其真流行率分布可以通過大量先驗信息的挖掘和基于更新數(shù)據(jù)的實驗室基于N蛋白ELISA的抗體檢測篩查，以優(yōu)化和統(tǒng)計迫近我們對美國豬群的PEDV真流行率統(tǒng)計分布的認識，特別是更新信息的大樣本數(shù)量可以為統(tǒng)計置信分布和決策提供大概率的統(tǒng)計認知和確信度，從而降低對美國豬群PEDV流行率分布估計的不確定性認識。

真流行率分布的認識對口岸檢測檢疫和風險決策管理具有重要意義，可以為實現(xiàn)口岸風險量化管理和風險決策，減小和降低特定病原微生物傳入的風險不確定性提供操作的可能性和可行性。如以此次PEDV口岸篩查為例，如以先驗分布的流行率為基準，計算檢測檢疫抽樣量，會存在顯著的缺陷。其一是基于先驗分布流行率模擬計算出的抽取至少一頭份陽性動物的抽樣量會顯著的降低十多倍以上。其二是以錯誤的流行率抽取的動物數(shù)量的降低，也會顯著的增加該種病毒越過國界和檢疫口岸，導致傳入內地的風險不確定顯著增加。而基于后驗貝葉斯推斷的流行率估計的最大可能值計算的口岸抽樣數(shù)量，將會在現(xiàn)有研究認知基礎上最大程度確定需要隨機抽檢的數(shù)量和存在的可能入境不確定性，從而降低在特定階段來自美國入境的活豬攜帶PEDV病原的可能性。

此外，在口岸檢疫篩查的方法、試劑選擇和鑒別準確性方面，因為目前PEDV ELISA抗體檢測的方法是基于美國PEDV分離株(USA /NC35140 /2013)設計，其可以探測樣品中是否有當前美國PEDV流行毒株 (PEDV Protoype &S INDEL)的IgA和IgG的存在，但其對同屬于α冠狀病毒的TGEV沒有有效的鑒別篩查能力，因為證據(jù)顯示TGEV會對PEDV的ELISA抗體檢測有較為明顯的干擾和交叉反應，而對豬的其他冠狀病毒如PRCoV和DeltaCoV不產生干擾[12]。Bevins等[12]對美國野豬的PEDV初篩試驗和利用基于S1蛋白的ELISA復核試驗驗證了這一點，其中在7 997份野豬樣本中，253份經PEDV-ELISA初篩呈抗體陽性，然后對這253份樣本利用基于特異性S1重組蛋白ELISA方法進行復篩，發(fā)現(xiàn)其中8份被確認為PEDV抗體陽性，另外兩個樣本被認為是疑似陽性，而其余243份陽性樣本被認為是TGEV。PEDV和TGEV同屬α冠狀病毒(圖3)，其對我國動物衛(wèi)生健康和公共衛(wèi)生安全都具有潛在威脅，為進一步明確和降低來自美國的α冠狀病毒入境我國風險，故而建議目前口岸首先使用基于N蛋白的ELISA抗體作為初篩，然后以基于S1重組蛋白ELISA抗體篩查作為復篩，來提高口岸對來自美國豬的α冠狀病毒入境我國的風險認知、管控和鑒別能力。

冠狀病毒科4個屬(圖3)中的α冠狀病毒和β冠狀病毒對哺乳動物危害極大。豬感染冠狀病毒對公共衛(wèi)生的不確定性風險隨著近期Sars-CoV-2(COVID-19)全球流行越來越被廣泛關注。作為歸屬于豬的冠狀病毒，雖然PEDV、TGEV、PRCV、SADS-CoV和PDCoV等引起豬的傳染性腸道和呼吸道感染并導致大量死亡，但其在人群流行的冠狀病毒的形成和病毒演化中的影響和風險尚不明確[7]?？诎稒z疫檢測是抵御外來入侵疫病傳入的最后一道防線，故而來自異域可能出現(xiàn)的新的冠狀病毒毒株給我國口岸監(jiān)測、檢疫監(jiān)管帶來了巨大技術挑戰(zhàn)，利用貝葉斯統(tǒng)計推斷，結合選擇具有高度特異性和敏感性的口岸篩查試劑和方法，以實時更新的實驗室檢測咨詢?yōu)橹R更新，適時優(yōu)化口岸檢測抽樣，對強化我國動物衛(wèi)生和公共衛(wèi)生安全，降低潛在入侵畜禽疫病傳入風險具有突破性的意義。

該亞科的病毒分為4個屬：α冠狀病毒(紫色)、β冠狀病毒(粉色)、γ冠狀病毒(綠色)和δ冠狀病毒(藍色),系統(tǒng)發(fā)育樹是基于已發(fā)表的管狀病毒進化樹[7,46-48]The viruses in this subfamily group into four genera (prototype or representative strains shown):Alphacoronavirus (purple),Betacoronavirus (pink),Gammacoronavirus (green)and Deltacoronavirus (blue).Classic subgroup clusters are labelled 1a and 1b for the alphacoronaviruses and 2a-2d for the betacoronaviruses.The tree is based on published trees of Coronavirinae [7,46-48]圖3 冠狀病毒亞科系統(tǒng)發(fā)育關系Fig.3 Phylogenetic relationships in the Coronavirinae subfamily

4 結 論

PEDV可引起仔豬的高死亡率，對豬的健康生長以及動物衛(wèi)生和公共衛(wèi)生的暴露風險不確定性高，潛在危害大。目前，美國豬群中至少存在兩種遺傳上不同的PEDV毒株——PEDV原型株U.S.PEDV prototype strain 和S-INDEL變異株S-INDEL-variant strain。本文基于對美國PEDV流行毒株監(jiān)測及先驗信息挖掘，利用貝葉斯統(tǒng)計推斷，結合選擇具有高度特異性和敏感性的口岸篩查試劑和方法，以更新的實驗室篩查檢測咨詢?yōu)橹R更新，推斷美國豬群PEDV發(fā)生的真流行率，以期為現(xiàn)階段美國生豬入境我國的口岸檢驗檢疫、監(jiān)測抽樣提供基于科學證據(jù)的風險決策技術支撐。分析結果顯示，PEDV在美國豬群中的真流行率分布中位值為0.005 22(95% CI=0.000 424～0.022 5)，95%的高置信上限的流行率分布為3%，高度右偏的統(tǒng)計分布推斷美國豬群當前的PEDV真流行率最大可能分布主要集中在2.5%百分位數(shù)(P2.5%=0.000 2)與中位數(shù)(P50%=0.005 22)之間。概率密度高度正偏的數(shù)據(jù)分布趨勢顯示，美國PEDV真流行率大于0.02的可能性相對較低,雖然在美國不同地理空間中，隨機豬群PEDV真流行率分布值可能會存在有小概率溢出分布大于0.03(P≤2.5%)的可能?？诎稒z疫與監(jiān)測是抵御外來入侵疫病傳入的最后一道防線，在現(xiàn)階段口岸篩查的試劑選擇方面，建議口岸首先使用基于N蛋白的ELISA抗體作為初篩方法，然后以基于S1重組蛋白ELISA抗體篩查作為復篩方法，來提高口岸對來自美國入境生豬的α冠狀病毒潛在侵入我國的風險認知、管控和鑒別能力。基于口岸實驗室檢測結果優(yōu)化的貝葉斯統(tǒng)計推斷方法可以為在現(xiàn)有知識和認知基礎上，最大程度阻斷來自異域病原微生物入侵提供監(jiān)測技術支持，對口岸檢驗檢疫、抽樣監(jiān)測、風險管控和通關決策具有現(xiàn)實和突破性的意義。