CAF-1在體細胞重編程中的作用機制

張迎冰，于芮巒，喬培培，楊 瑩，張 涌，蘇建民

(西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院 農(nóng)業(yè)部動物生物技術重點實驗室，楊凌 712100)

染色質組裝因子 1 (chromatin assembly factor-1，CAF-1)，是由p150、p60、p48 三個亞單位按1∶ 1∶1組合構成的三聚體組蛋白伴侶[1-2]。CAF-1主要功能是在DNA復制中與增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)相互作用，負責募集組蛋白 H3、H4 沉積在新合成的DNA 上以促進核小體裝配。CAF-1不僅參與 DNA復制和修復后染色質裝配，而且參與細胞增殖調(diào)控、胚胎干細胞的表觀遺傳學變化及異染色質的合成和修復。

隨著細胞分化，染色質越來越凝集。體細胞重編程為全能性的胚胎，首先要進行染色質的去凝集。在卵母細胞介導的重編程過程中，組蛋白發(fā)生置換，并擦除來自體細胞的抑制型表觀修飾使染色質去凝聚。但是，體細胞克隆胚胎重編程過程中，來自體細胞的遺留表觀遺傳修飾擦除不完全，抑制胚胎基因組激活，導致胚胎發(fā)育失敗、克隆動物死亡。而CAF-1通過H3K9 me3等組蛋白修飾在異染色質形成、染色質凝集事件上扮演著重要角色。因此，本文從CAF-1的結構、生物學功能和參與體細胞重編程的研究3部分作了簡要的綜述。

1 CAF-1的結構

CAF-1包含3個亞基并依其大小命名：分別為150 ku亞基(p150亞基，CHAF1a)、60 ku亞基(p60，CHAF1b)和48 ku亞基(p48，RbAp48)。CAF-1復合體在不同物種上都參與DNA的合成和修復、染色質的組裝，具有高度的結構和功能保守性。

CHAF1a的N端存在一個在體外具有強活性的PIP (PCNA相互作用肽)，以及一個小泛素樣修飾相互作用區(qū)域，這是與SUMO2/3相互作用所必需的[3]。在PxVxL區(qū)域還存在一個HP1(異染色質蛋白1)相互作用域[4]。一個PEST結構域驅動蛋白質的快速降解。在PEST結構域之后是一個KER結構域，這是一個高酸性的區(qū)域，被認為有利于與組蛋白的相互作用。在KER域內(nèi)是另一個PIP，已被試驗證實其在體內(nèi)與PCNA相互作用和核小體形成有關。隨后，還存在一個與CHAF1b相互作用域和ED區(qū)域，ED區(qū)域被認為與組蛋白和有翼螺旋結構域(WHD)結合[5]。一個與p48相互作用區(qū)域和一個有翼螺旋結構域位于CHAF1a的C端(圖1)[6]。

CHAF1b位于21號染色體上，是由位于N端7×WD重復區(qū)域、位于C端B區(qū)結構域和PEST 結構域3部分組成(圖1)。CHAF1b的7×WD重復區(qū)域過去被認為是提供CHAF1b-/ASF1a/H3/H4復合物作用所需的位點，研究證明，CHAF1b的7×WD重復區(qū)域并不是結合ASF1a/b的區(qū)域[7]。研究表明，CHAF1b依賴于B區(qū)結構域與ASF1a結合，形成CHAF1b/ASF1a/H3/H4復合物，再通過與CHAF1a和PCNA 相互作用，定位在復制叉位置募集組蛋白，完成 DNA 的復制和核小體的組裝。而這種結合是CHAF1b的B區(qū)結構形成β-發(fā)夾能與ASF1a氨基端核心區(qū)域的β-sandwich結構產(chǎn)生特異性的交互反應[8]。此外，CHAF1b的B區(qū)結構域與HIRA同源，因此，ASF1a與HIRA或CHAF1b的結合是相互排斥的，這表明HIRA表達可能是調(diào)節(jié)CHAF1b活性的一種間接方法[9]。CHAF1b的PEST結構域也發(fā)揮重要的作用。shRNA介導的CHAF1a的敲除會導致CHAF1b的表達減少則證明這一點[10]。

p48是7×WD重復區(qū)域，還包括兩個分別在N和C末端的α-helical區(qū)域，它們可促進與H4組蛋白的結合(圖1)。它可能與組蛋白去乙?；窰DAC1的催化亞基密切相關，這表明它可能有助于新合成的H4在核小體中沉積后去乙?；痆11-13]。p48也是其他幾個染色質調(diào)節(jié)復合物的組成部分，如核心蛋白復合體PRC2 (PRC2)、核小體重塑因子 (NURF)、核小體重塑和去乙酰酶 (NURD)和組蛋白去乙?；?(HDAC1)，提示該亞基在組蛋白修飾酶與其底物之間起著分子橋梁作用。除了與核心蛋白復合體PRC2作用外，p48也被認為在NURD重塑/去乙?；笍秃衔锖蚇URF重塑復合物中發(fā)揮重要作用。

圖1 CAF-1復合體的結構(根據(jù)參考文獻[14-15]修改)Fig.1 Architecture of the CAF-1 complex (modified from reference [14-15])

2 CAF-1的生物學功能

2.1 CAF-1參與DNA復制偶聯(lián)的核小體組裝

在真核生物DNA復制過程中，CAF-1作為組蛋白伴侶，將組蛋白H3-H4異二聚體沉積到新合成的DNA上，促進復制叉后的核小體組裝(圖2)[16-17]。在這個過程中組蛋白H3-H4二聚體與乙酰化的H3K56殘基首先被組蛋白伴侶ASF1捕獲，然后轉移到CAF-1，這一過程是通過ASF1與CHAF1b直接相互作用介導的[16,18]。據(jù)報道，組蛋白H3K56殘基在人體內(nèi)被CBP或Gcn5乙?；?，在酵母體內(nèi)被Rtt109乙酰化[19-22]。乙?；蟮腍3K56增加了酵母模型中CAF-1與H3-H4結合的親和力，促進了CAF-1介導的核小體組裝[19-23]。據(jù)報道，酵母和人類細胞中的HAT1負責H4K5和H4K12的乙?；?。然而，與H3K56的乙酰化作用不同，H4K5或K12的乙?；饔媒档土瞬溉閯游锛毎蠬3-H4與CAF-1的結合，而H3K56的乙?；饔迷鰪娏薈AF-1與H3-H4的體外結合親和力[16,19]。最后，CAF-1通過與“滑動的夾子”PCNA 相互作用，將組蛋白H3-H4四聚體招募到復制叉，完成染色質組裝。

圖2 CAF-1參與DNA復制偶聯(lián)型核小體組裝過程 (根據(jù)參考文獻[4]修改)Fig.2 CAF-1 participates in the DNA replication-coupled nucleosome assembly process (modified from reference [4])

2.2 CAF-1在細胞周期中的功能

CAF-1主要功能就是在S期，與ASF1a和/H3/H4組蛋白結合成CHAF1b/ASF1a/H3/H4復合物再與 PCNA相互作用，定位在復制叉位置募集組蛋白，完成DNA復制耦聯(lián)的核小體組裝。因此，CHAF1b對S期過程維持是至關重要的。比如，敲除CHAF1b將使動物細胞由于染色質組裝缺陷而停滯在S期，導致細胞死亡。敲降CHAF1b的HUH-7細胞導致細胞周期 G0/G1期細胞比例減少，而S期細胞數(shù)目增多，G2/M 期細胞數(shù)量變化不大，表明敲減 CHAF1b基因減少G1期細胞的數(shù)量并增加S期細胞比例，導致細胞在不同階段的分布發(fā)生變化[24]。干擾 CHAF1b 的表達可導致95-D細胞的細胞周期停滯。G1期細胞百分比顯著增加，而S 期細胞的比例減少，說明 CHAF1b促進了細胞周期 S 期的 DNA 復制和核小體組裝[25]。用 CAF-1 的特異性抑制劑 HA-p150C，破壞內(nèi)源性 CHAF1a 和CHAF1b 之間的相互作用，阻止CHAF1b 與染色質和 DNA 合成位點緊密結合，導致S期停滯。

2.3 CAF-1在細胞增殖中的功能

CAF-1 的主要功能是S期將新合成的 H3/H4 二聚體遞送至復制叉的位置。在分裂間期局限在核仁，在S期集中于核內(nèi)DNA復制的位點[26]，可作為區(qū)別增殖期細胞和靜止期細胞的標志物。因此，CHAF1b是和細胞增殖呈正相關的一種組蛋白伴侶[27]。CAF-1參與復制偶聯(lián)染色質組裝過程，其中CAF-1的消耗導致Chk1的激活和S期阻滯。沉默CHAF1b 基因能抑制肝癌細胞的增殖能力，抵抗細胞死亡[28]。然而，在小鼠ES細胞中，CHAF1a敲降后DNA復制仍然進行。大量研究證明，CAF-1能通過調(diào)整S期特定染色質重組來促進細胞周期的進程從而影響細胞的增殖[29]。

2.4 CAF-1在細胞分化中的功能

細胞分化是細胞類型特化的過程，在細胞發(fā)育過程中受特定基因表達的調(diào)控。研究表明，CHAF1a的下調(diào)足以通過神經(jīng)母細胞瘤基因的失調(diào)和H3K9 me3修飾的整體減少導致代謝基因表達的缺失而誘導神經(jīng)母細胞瘤細胞分化[30]。另一項研究表明，在MLL-AF9白血病細胞中，CHAF1b通過染色質中離散位點的直接積累來維持其未分化狀態(tài)[28]。然而，在纖維母細胞中，CHAF1b也可以控制染色質可及性來抑制干細胞基因的表達，從而保持體細胞的分化狀態(tài)[31]。因此，CHAF1b對基因具有細胞類型特異性作用調(diào)節(jié):在分化細胞中，CHAF1b保持細胞同一性；在惡性細胞中，CHAF1b保持未分化狀態(tài)。這種CHAF1b的差異活性可能是由細胞核內(nèi)的系特異性轉錄因子和染色質可達區(qū)域的組成介導的[28]。

2.5 CAF-1參與組蛋白修飾

CAF-1一方面直接識別表觀遺傳。CAF-1將組蛋白H3-H4復合物靶向到DNA上。首先是新合成組蛋白H3和H4上面位點的乙?；?，然后CAF-1識別H4K5、H4K12和H3K56的乙酰化[32]。CAF-1另一方面間接調(diào)節(jié)表觀遺傳。在果蠅上研究發(fā)現(xiàn)，CAF-1對異染色質區(qū)域組蛋白H3K9位點的甲基化水平以及HP1蛋白的募集具有調(diào)節(jié)作用，從而決定異染色質結構的形成與穩(wěn)定性的維持[33]。實際上，CHAF1a和HP1a互作從而維持果蠅異染色質[34]。小鼠胚胎干細胞的研究中，CHAF1a的缺失導致了包括HP1和H3K9 me3在內(nèi)的構成性異染色質特征的嚴重改變，而中心性異染色質H3K9 me3和H4K20 me3的表觀遺傳標記完全被消除。甲基化CpG結合蛋白MBD1募集組蛋白甲基化酶SETDB1到CHAF1a形成MBD1/SETDB1/CAF-1復合體，促使H3K9位點甲基化，對異染色質的形成具有重要作用。最近研究顯示，CAF-1聯(lián)合Kdm1a、Hdac1/2參與調(diào)節(jié)異染色質ERVs的轉錄抑制[35-36]。Hatanaka 等[37]詳細研究了CHAF1a 通過調(diào)節(jié)組蛋白 H3.1/3.2與 H3.3的置換將H3K9 me3、H4K20 me3 等多種抑制型組蛋白修飾富集到對應區(qū)域。在植物中，CAF-1與H3K27甲基轉移酶,即PRC2相互作用;有助于在DNA復制過程中保護H3K27 me3介導的沉默染色質[38]。與此觀點一致，在小鼠胚胎干細胞中CAF-1也與PRC2復合物相互作用(圖3)[39]。

圖3 CAF-1參與組蛋白修飾 (根據(jù)參考文獻[40]修改)Fig.3 CAF-1 is involved in histone modification (modified from reference [40])

3 CAF-1是體細胞重編程的重要障礙

體細胞注入卵母細胞后，在卵胞質中重編程因子的作用下，將體細胞重編程為全能性的胚胎[41]。在此過程中，染色質重編程是克隆胚胎發(fā)育成敗的關鍵所在，主要包括染色質去凝集、染色質重構和組蛋白修飾等。但是，由于來自體細胞的遺留表觀遺傳修飾擦除不完全以及抑制型組蛋白的異常嵌入，將抑制胚胎基因組激活，導致胚胎發(fā)育失敗以及克隆動物死亡[42-44]。

3.1 CAF-1在早期胚胎發(fā)育中的作用

在早期胚胎發(fā)育過程中，CHAF1b 蛋白表達水平在2細胞期胚胎之后逐漸升高，這可能主要與在發(fā)育過程中細胞復制的高需求有關。在小鼠上，完全定點突變CHAF1a使小鼠胚胎發(fā)育阻滯在16-細胞期胚胎，表明CHAF1a是早期胚胎和多能性干細胞的異染色質組裝和維持所必需的[45]。敲降CHAF1a，降低組蛋白H3.1水平，升高H3.3水平，阻抑異染色質形成，可使小鼠胚胎的發(fā)育阻滯在囊胚前[46]。Hatanaka等[37]詳細研究了CHAF1a在小鼠附植前胚胎上的作用機理,CHAF1a通過調(diào)節(jié)組蛋白H3.1/3.2與H3.3的置換將H3K9 me3、H4K20 me3等多種抑制型組蛋白修飾富集到異染色質區(qū)LINE1等反轉座子，從而維持反轉座子等異染色質區(qū)域的穩(wěn)定。

3.2 CAF-1是體細胞重編程的重要障礙

CAF-1是動物乃至植物上細胞分化過程中的關鍵蛋白。Cheloufi等[31]通過大范圍 RNAi篩選技術發(fā)現(xiàn)，CAF-1 兩個亞基 CHAF1a和 CHAF1b是體細胞重編程障礙因子。通過敲降CHAF1a 或CHAF1b可顯著提高iPS重編程效率。抑制CAF-1表達除了可促進分化細胞誘導為多能性細胞，還促使細胞轉分化，說明CAF-1守衛(wèi)體細胞特性，阻抑轉錄因子誘導細胞命運的轉換。但CAF-1在體細胞克隆胚胎重編程過程中的作用及其機理尚不清楚。在小鼠胚胎干細胞上敲降 CHAF1b，可使多能性的 ES 細胞轉化為更多的全能性 ES 細胞，這種全能性ES細胞用于核移植后重編程效率顯著提高,同時促進了類似于兩細胞階段卵裂球的全能樣細胞的出現(xiàn)[47]。表明CAF-1是體細胞重編程的重要障礙。

在iPSCs的重編程過程中，CAF-1的抑制作用于局部的增強子元件，使它們更容易與轉錄因子結合。在小鼠和人早期核移植胚胎上，位于異染色質區(qū)的反轉錄轉座子重復序列(LINE和LTR等)遺留著來自體細胞的抑制型組蛋白修飾H3K9 me3，使得這些區(qū)域沉默，被稱為抗重編程區(qū)(reprogramming-resistant regions,RRRs)[45,48-49]。而這些異染色質區(qū)重復序列在小鼠附植前胚胎高表達，對胚胎基因組激活和胚胎發(fā)育具有重要作用[50-52]。研究人員通過擦除H3K9 me3，重新激活RRRs，顯著提高小鼠克隆效率并促進人核移植胚胎發(fā)育[45,48]。當然，這些異染色質區(qū)重復序列通常在受精卵來源的胚胎中2細胞期胚胎活躍，但在SCNT胚胎中仍然沉默，從而阻礙了克隆小鼠出生。相比ES細胞，敲降CHAF1b 獲得的全能性 ES 細胞用于核移植，小鼠胚胎的 RRRs 區(qū)域大量激活(圖4)[35]。

圖4 CAF-1是體細胞重編程的重要障礙 (根據(jù)參考文獻[40]修改)Fig.4 CAF-1 is an important obstacle to somatic cell reprogramming (modified from reference[40])

在通過CAF-1沉默將ESC轉換為類似兩細胞階段的全能樣細胞的狀態(tài)期間，染色質可及性減小，從而導致內(nèi)源性逆轉錄元件(例如MERVL)和鄰近基因的激活。MERVL是小鼠2-細胞期胚胎特異性表達的反轉座子，MERVL 的轉錄可以激活2-細胞期特異基因的表達，對于胚胎正常發(fā)育至關重要。全基因組siRNA篩發(fā)現(xiàn)，CAF-1 是主要的 MERVL 抑制因子[35]，在小鼠 2-細胞期胚胎上 CHAF1b 表達水平和 MERVL 表達負相關，MERVL 轉錄的位置檢測不到 CHAF1b，敲降 CHAF1b 可上調(diào) MERVL 的表達[35]。與此同時證明敲除CAF-1導致內(nèi)源性逆轉錄病毒元件(例如MERVL)高表達(圖4)[45]。

3.3 組蛋白 H3.1 的異常嵌入可能導致克隆胚胎重編程失敗

在小鼠核移植中，供體細胞來源的 H3.2、H3.3 和 H2A 迅速地被卵胞質中的組蛋白 H3 變體和 H2AX 替換。克隆胚胎上組蛋白 H3.2 和 3.3 與體外受精胚胎一樣，而組蛋白變體 H3.1 嵌入到克隆胚胎但未嵌入體外受精胚胎[53]。組蛋白 H3.1 上富集抑制型組蛋白修飾，與轉錄抑制相關；而組蛋白 H3.3 主要富集在轉錄起始位點、增強子以及轉錄激活的基因上，和轉錄激活相關。多項研究顯示，母源組蛋白 H3.3 是重要的重編程因子，體細胞核移植到卵胞質后，組蛋白 H3.3 和體細胞組蛋白發(fā)生置換，并啟動克隆胚胎基因組激活，在克隆胚胎重編程過程中扮演重要角色[54]。所以，組蛋白變體 H3.1 異常嵌入到克隆胚胎可能是克隆胚胎重編程失敗的重要原因。

組蛋白H3.1上富集的抑制型組蛋白修飾H3K9 me3是染色質凝集狀態(tài)的標志。H3K9 me3 形成異染色質蛋白 HP1 結合位點，HP1 識別并結合在甲基化修飾的組蛋白，募集 DNA 甲基化轉移酶 DNMT，使該位點 DNA 甲基化修飾[55]。另外，HP1 結合甲基化的組蛋白后可以招募組蛋白甲基化轉移酶 Suv39 h1，使附近的組蛋白也發(fā)生組蛋白甲基化，向兩邊延伸，形成異染色質，使染色質發(fā)生凝集。

3.4 CAF-1 介導H3.1/3.2與H3.3的置換可能導致克隆胚胎重編程失敗

CAF-1是組蛋白H3.1的伴侶蛋白，促進H3.1嵌入到新合成的DNA[56]。組蛋白H3.1上富集抑制型組蛋白修飾，與轉錄抑制相關[57]；而組蛋白H3.3主要富集在轉錄起始位點、增強子以及轉錄激活的基因上，和轉錄激活相關[58]。由于CAF-1是組蛋白變體H3.1的伴侶蛋白，在小鼠早期胚胎負責組蛋白3.1和組蛋白3.3置換，置換過程中將抑制型表觀修飾例如H3K9 me3富集到對應區(qū)域[37]。敲降CHAF1a導致組蛋白H3.1去除，而促進H3.3的嵌入，阻抑異染色質形成[46,59]。同樣，敲降CHAF1b調(diào)控組蛋白H3.1嵌入到新合成的DNA上，而促進組蛋白H3.3沉積[60]。

研究顯示，CAF-1和異染色質蛋白HP1以及H3K9 me3的互作，能夠促進細胞分化過程中異染色質形成和染色質的凝集。在誘導多能性干細胞(iPS)的研究中發(fā)現(xiàn)，CAF-1是體細胞重編程的抑制因子，敲降其表達可促進體細胞向iPS的轉化，顯著提高iPS重編程效率[61-62]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，敲降CHAF1b可上調(diào)?？寺∨咛ソM蛋白變體H3.3的含量，降低組蛋白H3K9 me3豐度，并顯著提高?？寺∨咛サ纳ｉ┡吆湍遗甙l(fā)育率(未發(fā)表數(shù)據(jù))。推斷在?？寺∨咛ド锨媒礐HAF1b很可能引起組蛋白變體置換，并在置換過程中將高豐度的抑制型組蛋白修飾例如H3K9 me3去除，導致原有被其抑制的抗重編程區(qū)重新激活，從而促進?？寺∨咛グl(fā)育。

4 小 結

自從1986年第1次報道CAF-1，距今已經(jīng)有34年。在這些年的研究中，CAF-1的結構已清晰，正如前文所述，CAF-1由p150、p60、p48 三個亞基的組蛋白伴侶，每個亞基的不同結構域都行使著不同的功能，它們負責與不同的蛋白相互作用。當然，CAF-1也參與多種生物學進程，包括DNA復制偶聯(lián)的核小體組裝、細胞周期、細胞增殖和細胞分化等。最近幾年來，CAF-1被不斷證明是體細胞重編程障礙因子。敲降CAF-1可顯著提高iPS重編程效率。抑制CAF-1表達除了可促進分化細胞誘導為多能性細胞，還促使細胞轉分化，說明CAF-1守衛(wèi)體細胞特性，阻抑轉錄因子誘導細胞命運的轉換。結合本課題組前期的試驗結果，猜測CAF-1 介導H3.1/3.2與H3.3的置換可能會導致克隆胚胎重編程失敗。