頂空固相微萃取-氣質(zhì)分析油茶籽油揮發(fā)性成分方法優(yōu)化

楊剴舟，魏 征，王佳雅，欒 霞，段章群，郭咪咪，楊 茜，薛雅琳

（國(guó)家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院，北京 100037）

風(fēng)味是植物油最具特征的感官屬性，也是評(píng)價(jià)植物油品質(zhì)的重要指標(biāo)[1]。油茶（Camellia Oleifera）作為我國(guó)最具特色的木本油料作物，被譽(yù)為“東方橄欖油”，主要經(jīng)過(guò)原料精選、炒制、物理壓榨（螺旋壓榨或者液壓榨）以及最后經(jīng)過(guò)濾技術(shù)生產(chǎn)而成，因具有濃郁、獨(dú)特的風(fēng)味及豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值作用而備受消費(fèi)者青睞[2]。因此研究和分析油茶籽油的揮發(fā)性成分，對(duì)進(jìn)一步提升油茶籽油的風(fēng)味品質(zhì)及加工工藝，具有極其重要的意義。

固相微萃取（Solid Phase Micro-Extraction，SPME）是一種新型樣品預(yù)處理富集技術(shù)，該技術(shù)具有無(wú)溶劑、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便和檢測(cè)限低（ng/g～pg/g）等優(yōu)點(diǎn)，并可實(shí)現(xiàn)復(fù)雜樣品的高通量檢測(cè)、自動(dòng)化分析，與高效液相色譜（HPLC）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）等分析儀器聯(lián)用，可實(shí)現(xiàn)同一樣品富集、進(jìn)樣和檢測(cè)等過(guò)程的統(tǒng)一，顯著提高了分析方法的靈敏度和分析效率[3]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用固相微萃取（SPME）技術(shù)對(duì)于油茶籽油風(fēng)味進(jìn)行了一系列的研究，包括萃取技術(shù)優(yōu)化[4]、加工工藝[5]對(duì)揮發(fā)性成分的作用以及不同品種地域風(fēng)味特性[6]等。Guoyan Liu等[6]、Wenming Cao等[2]和楊春英等[4]分別采用 HSSPME-GC/MS對(duì)4種固相微萃取柱吸附效果進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)50/30 μm二乙烯基苯/羧基/聚二甲基硅氧烷（DVB/CAR/PDMS）柱子均具有最高的總峰面積、主峰面積和總峰數(shù)，但研究都采用水浴手動(dòng)萃取，對(duì)風(fēng)味物質(zhì)信號(hào)種類和強(qiáng)度存在一定程度的影響；而全自動(dòng)樣品前處理（加熱、攪拌和萃?。┭b置如頂空進(jìn)樣和CTC樣品自動(dòng)前處理已逐步開(kāi)始應(yīng)用在油脂風(fēng)味研究中[7]，這對(duì)提高風(fēng)味物質(zhì)研究的可靠性和準(zhǔn)確性提供了可能，但目前缺乏對(duì)該技術(shù)的優(yōu)化研究。

因此本文選用壓榨油茶籽油為原料，采用全自動(dòng)樣品前處理-頂空固相微萃?。℉S-SPME）結(jié)合 GC/MS技術(shù)建立了壓榨油茶籽油揮發(fā)性成分的分析方法，并采用該方法對(duì)油茶籽油揮發(fā)性成分進(jìn)行了初步鑒定和定量，同時(shí)對(duì)油茶籽油特征性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行解析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

壓榨油茶籽油，加工工藝為螺桿壓榨法，毛油經(jīng)自然沉降制得：北京市建宏中天農(nóng)林發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

COMBI-xt PAL氣相色譜多功能自動(dòng)進(jìn)樣器暨樣品前處理系統(tǒng)：瑞士CTC公司；Agilent 7890A-5975氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)安捷倫科技有限公司；100 μm聚二甲基硅氧烷（PDMS）、75 μm羧基/聚二甲基硅氧烷（CAR/PDMS）、65 μm 二甲基硅氧烷/二乙烯基苯（PDMS/DVB）和50/30 μm二乙烯基苯/羧基/聚二甲基硅氧烷（DVB/CAR/PDMS）固相萃取頭：美國(guó)Supelco公司；頂空進(jìn)樣瓶：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；實(shí)驗(yàn)所需其他試劑均為分析純：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 風(fēng)味物質(zhì)萃取步驟

參考劉曉君等[8]方法。將固相微萃取頭固定后插入GC進(jìn)樣口進(jìn)行老化，老化溫度250 ℃，老化時(shí)間 30 min，載氣速率 2 mL/min，分流比20∶1。稱取4.00 g樣品置于20 mL頂空瓶中，在CTC進(jìn)樣系統(tǒng)60 ℃保溫箱中恒溫?cái)嚢?0 min，待風(fēng)味物質(zhì)飽和后將萃取頭暴露于樣品頂空1.0 cm處解析20 min，最后取出萃取頭在進(jìn)樣口250 ℃解析，同時(shí)啟動(dòng)儀器采集數(shù)據(jù)。

1.3.2 固相微萃取條件優(yōu)化

參考LIU等[6]方法。篩選4種SPME萃取頭100 μm PDMS、75 μm CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB和50/30 μm DVB/CAR/PDMS，分別研究了萃取溫度（40、50、60、70、80 ℃）、萃取時(shí)間（20、30、40、50、60 min）和解析時(shí)間（3、4、5、6、7 min）對(duì)萃取效果的影響并確定最佳萃取條件。

1.3.3 GC-MS分析

參考LIU等[6]方法。

GC：色譜柱，HP-5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 μm×0.25 μm）；程序升溫：起始溫度 35 ℃，以 4 ℃/min升到 160 ℃，保持 1 min，再以10 ℃/min升到 220 ℃，保持 0.1 min，最后以15 ℃/min升到250 ℃，保持1 min。載氣為高純氦氣，流速0.9 mL/min，進(jìn)樣口溫度250 ℃，不分流進(jìn)樣。

MS條件：離子源，電子轟擊；檢測(cè)器電壓70 Ev，傳輸線溫度250 ℃，離子源溫度250 ℃，四極桿溫度150 ℃，質(zhì)量掃描范圍50～500 u。

揮發(fā)性組分的定量采用內(nèi)標(biāo)法[4]，在樣品中加入20 μL 1.142 mg/mL 1,2,3-三氯甲烷甲醇溶液作為內(nèi)標(biāo)，揮發(fā)性組分的含量為相當(dāng)于內(nèi)標(biāo)物的相對(duì)濃度，計(jì)算公式如下：

化合物濃度（mg/Kg油茶籽油）= 化合物峰面積/內(nèi)標(biāo)物峰面積×內(nèi)標(biāo)物濃度。

1.3.4 相對(duì)氣味活度值（ROAV）評(píng)價(jià)

參考孫寶國(guó)[9]方法。采用相對(duì)氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）對(duì)油茶籽油樣品關(guān)鍵揮發(fā)性組分進(jìn)行評(píng)價(jià)，對(duì)樣品風(fēng)味貢獻(xiàn)最大組分的ROAVmax定義為100，其他揮發(fā)性組分計(jì)算如下：

其中：Ci和Ti分別為揮發(fā)性組分的相對(duì)百分含量及其對(duì)應(yīng)的嗅覺(jué)閾值；Cmax和Tmax為對(duì)油茶籽油樣品風(fēng)味貢獻(xiàn)最大組分的相對(duì)百分含量及其對(duì)應(yīng)的嗅覺(jué)閾值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

GC-MS分析結(jié)果由Mass Hunter軟件檢索計(jì)算機(jī)譜庫(kù)NIST和WILLY定性分析，僅報(bào)道匹配度和純度大于 80的鑒定結(jié)果（最大值 100），利用面積歸一法計(jì)算揮發(fā)性成分的相對(duì)含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取條件對(duì)萃取效果的影響

2.1.1 萃取頭對(duì)萃取效果的影響

采用4種商業(yè)化固相微萃取頭PDMS、CAR/PDMS、PDMS/DVB和CAR/PDMS進(jìn)行篩選，以總峰面積、主峰面積和總峰數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)萃取頭的萃取效果。其中PDMS用于分析非極性揮發(fā)性物質(zhì)，CAR/PDMS用于分析氣體和小分子量化合物，PDMS/DVB用于揮發(fā)性物質(zhì)、胺類、硝基芳香類化合物等，DVB/CAR/PDMS用于香味物質(zhì)（揮發(fā)性和半揮發(fā)性 C3～C20）[10]。具體結(jié)果如圖 1所示。

圖1 萃取頭對(duì)萃取效果的影響Fig.1 The influence of the extraction head on the extraction effect

從圖 1中可以看出，DVB/CAR/PDMS在總峰面積、主峰面積和總峰數(shù)都是最高的，分別為10.07*108、6.94*108和61，總峰面積和主峰面積高于Guoyan Liu等[6]采用TR-5MS柱子對(duì)不同固相微萃取柱手動(dòng)萃取氣質(zhì)分析得到的結(jié)果，DVB/CAR/PDMS分別為8.85*108、6.54*108，其中總峰數(shù)低于后者的92個(gè)，主要原因是作者采用的茶葉籽油樣品是在炒制溫度 180 ℃和炒制時(shí)間20 min下制備的，風(fēng)味組成更加豐富。吳蘇喜等[7]采用 DVB/CAR/PDMS通過(guò)頂空進(jìn)樣器對(duì)不同熱處理壓榨油茶籽油的風(fēng)味研究時(shí)也得到了良好的效果，但是總峰數(shù)較少，可能與樣品加工工藝有關(guān)。因此選擇DVB/CAR/PDMS固相微萃取柱進(jìn)行萃取條件優(yōu)化。

2.1.2 萃取溫度對(duì)萃取效果的影響

萃取溫度升高時(shí)，待測(cè)物揮發(fā)成分在頂空的分配提高，縮短萃取平衡時(shí)間；但溫度過(guò)高會(huì)降低待測(cè)物在涂層與基質(zhì)中的分配系數(shù)，減少吸附量，影響方法靈敏度，同時(shí)溫度過(guò)高可能會(huì)引起待測(cè)樣品在萃取過(guò)程中發(fā)生如熱降解、氧化反應(yīng)等一些化學(xué)變化，影響檢測(cè)結(jié)果。具體結(jié)果如圖2所示。

圖2 萃取溫度對(duì)萃取效果的影響Fig.2 The effect of extraction temperature on the extraction effect

從圖 2中可以看出，隨著溫度的升高，總峰面積和主峰面積逐漸上升，在 70 ℃達(dá)到平衡，而總峰數(shù)呈現(xiàn)一直上升的趨勢(shì)，這與夏欣等[2]、Wenming Cao等[8]和劉曉君等[11]采用手動(dòng)水浴加熱萃取揮發(fā)性物質(zhì)得出的研究結(jié)果不同，后者研究發(fā)現(xiàn)總峰面積和主峰面積在萃取溫度高于 60 ℃后均出現(xiàn)了下降。這可能是由于在CTC電加熱固相微萃取體系中，當(dāng)萃取溫度超過(guò) 60 ℃后，油茶籽油中風(fēng)味物質(zhì)發(fā)生分解以及高溫導(dǎo)致脂肪酸氧化分解，生成的新的風(fēng)味物質(zhì)除了彌補(bǔ)風(fēng)味物質(zhì)損失，還與風(fēng)味物質(zhì)在微萃取柱涂層表面發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性吸附，最終導(dǎo)致總峰數(shù)逐漸增加，而總峰面積和主峰面積不增加；同時(shí)在水浴加熱體系下，由于加熱方式的不同，造成風(fēng)味物質(zhì)的揮發(fā)和飽和過(guò)程的差異?？紤]到高溫下脂肪酸氧化對(duì)油脂本體風(fēng)味物質(zhì)的干擾以及風(fēng)味物質(zhì)的分解，因此選擇60 ℃作為固相微萃取最佳溫度。

2.1.3 萃取時(shí)間對(duì)萃取效果的影響

萃取時(shí)間是萃取過(guò)程達(dá)到平衡時(shí)所需要的時(shí)間。萃取過(guò)程剛開(kāi)始時(shí)固相微萃取柱的吸附量會(huì)出現(xiàn)迅速增加，當(dāng)達(dá)到平衡點(diǎn)后上升趨勢(shì)就變得異常緩慢。風(fēng)味揮發(fā)性有機(jī)物平衡所需時(shí)間較短，一般十分鐘內(nèi)可達(dá)最大吸附量，而復(fù)雜基質(zhì)及半揮發(fā)有機(jī)物平衡時(shí)間一般至少需要30～60 min[8]。

從圖 3中可以看出，隨著萃取時(shí)間的增加，總峰數(shù)、總峰面積和主峰面積逐漸上升，在50 min時(shí)達(dá)到平衡，風(fēng)味物質(zhì)在固相微萃取柱上的吸附解吸達(dá)到平衡。因此選擇萃取時(shí)間為50 min進(jìn)行下一步研究。

圖3 萃取時(shí)間對(duì)萃取效果的影響Fig.3 The effect of extraction time on the extraction effect

2.1.4 解吸時(shí)間對(duì)萃取效果的影響

當(dāng)解吸溫度固定時(shí)，解吸時(shí)間與風(fēng)味物質(zhì)解吸程度緊密相關(guān)。時(shí)間不足，解析不完全，數(shù)據(jù)失真，后續(xù)樣品受到污染；時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，固相微萃取柱涂層在高溫下流失，縮短使用壽命。

從圖 4中可以看出，總峰數(shù)、總峰面積和主峰面積受解吸時(shí)間影響變化并不顯著，在 5 min時(shí)大致達(dá)到平衡，考慮到長(zhǎng)時(shí)間高溫對(duì)萃取柱的影響，因此選擇5 min作為較佳的解吸時(shí)間。

圖4 解析時(shí)間對(duì)萃取效果的影響Fig.4 The effect of desorption time on the extraction effect

綜上所述，選擇 DVB/CAR/PDMS固相微萃取柱進(jìn)行壓榨油茶籽油風(fēng)味物質(zhì)萃取實(shí)驗(yàn)，最佳萃取條件為萃取溫度60 ℃，萃取時(shí)間50 min，解析時(shí)間5 min。

2.2 油茶籽油風(fēng)味物質(zhì)氣質(zhì)分析

采用優(yōu)化后的HS-SPME/GC-MS技術(shù)分離鑒定油茶籽油風(fēng)味化合物，得到揮發(fā)性成分的總離子流圖如圖5所示。經(jīng)NIST和WILEY數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，得到的定性結(jié)果和定量結(jié)果如表1所示。

圖5 油茶籽油揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總離子流圖Fig.5 Total ion current diagram of volatile flavor compounds in camellia seed oil

表1 油茶籽油揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)GC-MS分析結(jié)果Table 1 GC-MS analysis results of volatile flavor substances in camellia seed oil

續(xù)表1

由表1可知，實(shí)驗(yàn)共鑒定出油茶籽油風(fēng)味物質(zhì)共60多種，其中匹配度大于80的約47種，分別為11種醛類、7種醇類、5種呋喃、5種烴類、4種吡嗪、3種酸類、2種吡喃、2種酯類、2種酮類和1種吡咯。

鑒定出的醛類物質(zhì)含量最高，占油茶籽油揮發(fā)性成分的56.28%，濃度為140.29 mg/kg油茶籽油，主要為脂肪族醛，一般被描述為青草味、豆味或酸敗味，如正己醛是亞油酸主要氧化產(chǎn)物之一，反-2-癸烯醛、2-十一碳烯醛和癸醛是油酸的過(guò)氧化產(chǎn)物[12]；其次為芳香族醛，苯甲醛和苯乙醛具有與脂肪族醛完全不同的風(fēng)味特征，分別具有類杏仁味和類蜂蜜味[13]。呋喃類化合物是油茶籽油揮發(fā)性成分的第二大化合物，占總含量的16.06%，濃度為 39.99 mg/kg油茶籽油，主要為呋喃醛和呋喃酮類，氣味閾值較低，一般處于mg/kg水平，呋喃類化合物具有焦糖味、甜味、水果味和堅(jiān)果味等風(fēng)味特征[13]；醇類化合物是油茶籽油揮發(fā)性成分的第三大化合物，占總含量的8.43%，濃度為21.01 mg/kg油茶籽油，一般氣味閾值較高，通常不認(rèn)為是油脂的風(fēng)味物質(zhì)，其中苯乙醇的氣味閾值較低，具有甜玫瑰花味和桃子味[13]。吡嗪類化合物是油茶籽油揮發(fā)性成分的第四大化合物，占總含量的 7.58%，濃度為 18.90 mg/kg油茶籽油，一般甲基吡嗪、二甲基吡嗪的氣味閾值相對(duì)較高，而甲基或乙基取代吡嗪的閾值相對(duì)較低，一般是 μg/kg級(jí)別，吡嗪類化合物研究中認(rèn)為與熱加工中的堅(jiān)果味、烘烤味、泥土味或土豆味顯著相關(guān)[14]；此外鑒定出一種酮類化合物2-壬酮，通常被描述為玫瑰花味和茶葉味；一般酯類和烴類物質(zhì)氣味閾值相對(duì)較高，一般不認(rèn)為是油脂的風(fēng)味物質(zhì)。

羅凡等[15]采用 HS-GC研究不同炒制條件下壓榨油茶籽油的揮發(fā)性成分組成時(shí)發(fā)現(xiàn)約 18種主要揮發(fā)性成分，在炒制溫度140 ℃時(shí)，醛類物質(zhì)約為 46.84%，呋喃類約 11.91%，醇類約為10.92%等，相對(duì)含量與我們的差別較大，可能與采用的萃取技術(shù)有關(guān)。況小玲等[16]采用 GC-MS對(duì)螺旋壓榨法制備的油茶籽油風(fēng)味組分分析發(fā)現(xiàn)，得到的風(fēng)味物質(zhì)為 57種，其中醛類物質(zhì)59.23%，酸類物質(zhì)16.89%，醇類物質(zhì)9.16%，烴類物質(zhì) 5.62%，雜環(huán)類 0.48%，除了酸類和雜環(huán)類，其他與我們的結(jié)果基本一致。

2.3 油茶籽油風(fēng)味物質(zhì)ROAV分析

風(fēng)味物質(zhì)對(duì)于油脂整體風(fēng)味的貢獻(xiàn)除了與含量有關(guān)以外，還與風(fēng)味物質(zhì)的閾值緊密相關(guān)。因此通過(guò)比較風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)氣味活度值可以近似判定整體風(fēng)味貢獻(xiàn)度。一般認(rèn)為 ROAV≥1的物質(zhì)為樣品中的關(guān)鍵性揮發(fā)組分，而0.1≤ROAV<1的物質(zhì)為樣品中重要的修飾組分[9]。結(jié)合油茶籽油揮發(fā)性組分的相對(duì)百分含量（4.40%）和嗅覺(jué)閾值（0.7 μg/kg），確定辛醛的相對(duì)氣味活度值ROAVmax=100。油茶籽油揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對(duì)氣味活度值如表2所示。

從表2中可以看出，ROAV>100的風(fēng)味物質(zhì)為2-氫-3-羥基-4,4-二甲基-2（3H）呋喃酮和二羥基-2（3H）呋喃酮，該類化合物主要在炒籽后期產(chǎn)生，一般具有甜焦糖味；其次為ROAV=100的辛醛，一般具有脂肪味、柑橘味和蜂蜜味；再次為0.1≤ROAV<1，2-甲基丙醛、苯乙醛、壬醛、正己醛、反-2-壬烯醛、癸醛、1-庚醇、3-乙基-3,5-二甲基-吡嗪，主要為醛類物質(zhì)，一般為脂肪味、青草味和香橙味等，輔以吡嗪的堅(jiān)果味和燒烤味；最后是ROAV≈0.1的1-辛烯-3-醇和2-戊基呋喃，一般為香草味、薰衣草味、玫瑰香味和水果香味等。上述14種風(fēng)味物質(zhì)各具特點(diǎn)，通過(guò)相互之間的協(xié)同作用，共同構(gòu)成了油茶籽油特征風(fēng)味物質(zhì)。李梓銘等[17]通過(guò)HS-SPME-GC-MS對(duì)物理壓榨油茶籽油揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析并結(jié)合相對(duì)氣味活度值發(fā)現(xiàn)，壓榨油茶籽油中特征風(fēng)味物質(zhì)（17種）主要由醛類物質(zhì)（10種）組成，和我們的研究結(jié)論相對(duì)一致，但我們研究中關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)為呋喃酮類物質(zhì)，醛類等為風(fēng)味修飾成分，而后者醛類作為關(guān)鍵性風(fēng)味成分，分別為辛醛、壬醛、反-2-癸烯醛、2-庚烯醛、甲酸辛酯、己醛、庚醛、庚醇和2-戊基呋喃。

表2 油茶籽油揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對(duì)氣味活度值Table 2 Relative odor activity value of volatile flavor substances in camellia seed oil

3 結(jié)論

本文采用全自動(dòng)樣品前處理-頂空固相微萃?。℉S-SPME）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC/MS）技術(shù)建立了壓榨油茶籽油揮發(fā)性成分的分析方法，最佳的萃取條件為：DVB/CAR/PDMS固相微萃取柱，萃取溫度60 ℃，萃取時(shí)間50 min，解析時(shí)間5 min，相比較傳統(tǒng)手動(dòng)水浴萃取法具有更高的總峰面積和主峰面積；采用該技術(shù)共鑒定和定量出壓榨油茶籽油揮發(fā)性成分47種，其中醛類化合物是油茶籽油中主要的揮發(fā)性成分；通過(guò)ROAV分析得到壓榨油茶籽油的特征風(fēng)味物質(zhì)為2-氫-3-羥基-4,4-二甲基-2（3H）呋喃酮、二羥基-2（3H）呋喃酮、2-甲基丙醛、苯乙醛、壬醛、正己醛、反-2-壬烯醛、癸醛、1-庚醇、3-乙基-3,5-二甲基-吡嗪。