天然冰片對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

孫志軍，吳 丹，張俊婷，鄭 琴，張群林*

（1. 安徽醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，安徽 合肥 230032；2. 江西中醫(yī)藥大學(xué) 現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330004）

冰片包括天然冰片和合成冰片，天然冰片由樟科植物樟Cinnamomum camphora(L.) presl的新鮮枝、葉經(jīng)提取加工制成。冰片在古籍中多以“龍腦香”“龍腦”為正名。宋代《本草衍義》記載：“此物大通，利關(guān)膈熱塞，其清香為百藥之先”。明代《本草綱目》記載：“龍腦香，釋名片香、羯婆羅香。辛、苦，微寒，無(wú)毒。療腦痛，通諸竅，散郁火”。研究表明冰片可通過(guò)鎮(zhèn)痛[1]、抗炎[2]、抗氧化[3]和抗癲癇[4]等機(jī)制發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，從而改善局灶性腦缺血[5]、阿爾茨海默癥[6]等神經(jīng)系統(tǒng)疾病導(dǎo)致的神經(jīng)功能損傷。PC12細(xì)胞是一種可顯示多種神經(jīng)元特性的神經(jīng)細(xì)胞株，已被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的體外研究[7-9]。6-OHDA是一種常見(jiàn)的用于實(shí)驗(yàn)?zāi)M黑質(zhì)變性的神經(jīng)毒素[10]。本實(shí)驗(yàn)將建立6-OHDA誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷模型，用于研究天然冰片是否對(duì)PC12細(xì)胞具有保護(hù)作用，分別利用MTT法、倒置顯微鏡和流式細(xì)胞儀來(lái)檢測(cè)細(xì)胞存活率、觀察細(xì)胞形態(tài)以及檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1 材料與方法

1.1 試藥與儀器

天然冰片（批號(hào)：20170112）購(gòu)于吉安市聚鵬天然香料油有限公司；6-OHDA（批號(hào)：18834）購(gòu)于美國(guó)MCE生物科技公司；Annexin V-FITC/PI試劑盒購(gòu)于上海貝博生物科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)于上海源培生物科技股份有限公司；胎牛血清、青霉素-鏈霉素溶液（100 ×）、胰酶購(gòu)于中國(guó)碧云天生物有限公司；噻唑藍(lán)（MTT）購(gòu)于西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司；二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)于國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司；TH4-200型倒置顯微鏡（日本奧林巴斯株式會(huì)社）；FACSVerse型流式細(xì)胞儀（美國(guó)碧迪公司）；Synergy HTX型酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1天然冰片溶液的配制 精密稱取天然冰片粉末適量，用DMSO溶解配成濃度為200 mg/mL的儲(chǔ)備液，4°C保存，使用時(shí)用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) PC12細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清中，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 U/mL的DMEM高糖培養(yǎng)液，37℃，5% CO2。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞傳代，用胰酶消化，倒置顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3天然冰片對(duì)正常PC12細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 將PC12細(xì)胞分為對(duì)照組和天然冰片濃度分別為20、40、60、80、100、120、140、160、180、200 μg/mL的實(shí)驗(yàn)組。首先，將PC12細(xì)胞接種到96孔板中培養(yǎng)24 h。然后，對(duì)照組加入100 μL細(xì)胞培養(yǎng)液；實(shí)驗(yàn)組加入100 μL不同濃度的天然冰片溶液。每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，用PBS沖洗3次。接著，在每孔中加入20 μL MTT（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO溶液。最后，將96孔板置于37℃搖床上震蕩10 min至顆粒充分溶解，在酶標(biāo)儀上測(cè)定490 nm處的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.4細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn) 將PC12細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組和天然冰片濃度分別為7.5、15、30、60、120 μg/mL的實(shí)驗(yàn)組。首先，將PC12細(xì)胞接種到96孔板中培養(yǎng)24 h。然后，對(duì)照組加入100 μL細(xì)胞培養(yǎng)液；模型組加入100 μL 100 μmol/L的6-OHDA溶液；實(shí)驗(yàn)組提前24 h加入100 μL不同濃度天然冰片溶液培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后棄去孔內(nèi)天然冰片溶液，PBS沖洗3次，加入100 μL 100 μmol/L的6-OHDA溶液。6-OHDA作用24 h后用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。（MTT實(shí)驗(yàn)方法同“1.2.3”）

1.2.5細(xì)胞形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn) 將PC12細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組和天然冰片濃度分別為7.5、15、30 μg/mL的實(shí)驗(yàn)組。首先，將PC12細(xì)胞接種到6孔板中培養(yǎng)24 h；然后，對(duì)照組加入2 mL細(xì)胞培養(yǎng)液；模型組加入2 mL 100 μmol/L的6-OHDA溶液；實(shí)驗(yàn)組提前24 h加入2 mL不同濃度天然冰片溶液培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后棄去孔內(nèi)天然冰片溶液，PBS沖洗3次，加入2 mL 100 μmol/L的6-OHDA溶液。6-OHDA作用24 h后置倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6細(xì)胞凋亡率實(shí)驗(yàn) PC12細(xì)胞分組及給藥方法同“1.2.5”。按照Annexin V-FITC/PI試劑盒操作說(shuō)明，胰酶消化并收集各組細(xì)胞于15 mL離心管中，在4℃、1 500 r/min條件下離心5 min，棄上清；用PBS沖洗2次后再次離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞，用400 μL Annexin V結(jié)合液重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)至流式管中，在細(xì)胞懸液中加入Annexin V-FITC染色液5 μL，輕輕混勻后，置于冰上避光孵育15 min，然后加入10 μL PI染色液，輕輕混勻后于冰上避光孵育5 min后即可用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為488 nm。

1.2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 天然冰片對(duì)正常PC12細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，天然冰片濃度在0 ～ 200 μg/mL范圍內(nèi)時(shí)，PC12細(xì)胞存活率大于85%；當(dāng)天然冰片濃度低于140 μg/mL時(shí)，PC12細(xì)胞存活率高于對(duì)照組細(xì)胞存活率，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說(shuō)明該濃度范圍的天然冰片對(duì)正常PC12細(xì)胞具有增殖作用；當(dāng)天然冰片濃度高于160 μg/mL時(shí)，PC12細(xì)胞存活率低于對(duì)照組細(xì)胞存活率，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明該濃度范圍的天然冰片對(duì)正常PC12細(xì)胞有一定的毒性作用，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 天然冰片對(duì)正常PC12細(xì)胞存活率的影響（±s, n = 6）Tab. 1 Effect of natural borneol on the cell viability of normal PC12 cells（±s, n = 6）

表1 天然冰片對(duì)正常PC12細(xì)胞存活率的影響（±s, n = 6）Tab. 1 Effect of natural borneol on the cell viability of normal PC12 cells（±s, n = 6）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 細(xì)胞存活率/%對(duì)照組 100.0 ± 0.5天然冰片組（20 μg/mL） 158.2 ± 2.6**天然冰片組（40 μg/mL） 156.3 ± 2.1**天然冰片組（60 μg/mL） 152.1 ± 1.4**天然冰片組（80 μg/mL） 149.6 ± 0.6**天然冰片組（100 μg/mL） 146.2 ± 1.1**天然冰片組（120 μg/mL） 117.4 ± 1.0**天然冰片組（140 μg/mL） 112.6 ± 2.3**天然冰片組（160 μg/mL） 97.6 ± 1.5*天然冰片組（180 μg/mL） 94.3 ± 2.1*天然冰片組（200 μg/mL） 86.3 ± 1.5**F 1 447.318 P 0.000

2.2 天然冰片對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)損傷的PC12細(xì)胞存活率的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞存活率為（100 ±1.2）%，模型組細(xì)胞存活率為（71.5 ± 2.3）%，模型組細(xì)胞存活率低于對(duì)照組細(xì)胞存活率，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），該結(jié)果表明6-OHDA對(duì)PC12細(xì)胞具有損傷作用，提示建模成功；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率高于模型組細(xì)胞存活率，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），天然冰片濃度為15 μg/mL時(shí)，PC12細(xì)胞存活率最高，為（96.7 ± 2.6）%，結(jié)果見(jiàn)表2。以上結(jié)果表明，天然冰片可提高6-OHDA誘導(dǎo)損傷的PC12細(xì)胞的存活率。

表2 天然冰片對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)損傷的PC12細(xì)胞存活率的影響 （±s, n = 6）Tab. 2 Effect of natural borneol on the cell viability of PC12 cells injured by 6-OHDA （±s, n = 6）

表2 天然冰片對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)損傷的PC12細(xì)胞存活率的影響 （±s, n = 6）Tab. 2 Effect of natural borneol on the cell viability of PC12 cells injured by 6-OHDA （±s, n = 6）

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 細(xì)胞存活率/%對(duì)照組 100.0 ± 1.2模型組 71.5 ± 2.3**天然冰片組（7.5 μg/mL） 83.5 ± 1.9##天然冰片組（15 μg/mL） 96.7 ± 2.6##天然冰片組（30 μg/mL） 87.4 ± 3.9##天然冰片組（60 μg/mL） 80.7 ± 4.5##天然冰片組（120 μg/mL） 77.6 ± 5.1#F 47.167 P 0.000

2.3 天然冰片對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)損傷的PC12細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)，可見(jiàn)對(duì)照組PC12細(xì)胞呈梭形，胞體飽滿，密度大，折光性較強(qiáng)（圖1A）；與對(duì)照組相比，模型組PC12細(xì)胞體型變小，部分細(xì)胞損傷成圓形，密度減小，折光性減弱（圖1B）；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組PC12細(xì)胞體型變大，密度增大，折光性增強(qiáng)，天然冰片濃度為15 μg/mL時(shí)效果最好（圖1C、D、E）。以上結(jié)果表明，天然冰片對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)損傷的PC12細(xì)胞有形態(tài)保護(hù)作用。

圖1 天然冰片對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)損傷的PC12細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響Fig.1 Effect of natural borneol on the cell morphology of PC12 cells injured by 6-OHDA

2.4 天然冰片對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)損傷的PC12細(xì)胞凋亡的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，6-OHDA主要誘導(dǎo)PC12細(xì)胞早期凋亡，見(jiàn)圖2。對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為 （0.6 ± 0.02） %，模型組細(xì)胞凋亡率為（28.7 ± 0.6）%，模型組細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組細(xì)胞凋亡率，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），該結(jié)果表明6-OHDA對(duì)PC12細(xì)胞具有損傷作用，提示建模成功。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率低于模型組細(xì)胞凋亡率，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），天然冰片濃度為15 μg/mL時(shí)，PC12細(xì)胞凋亡率最低，為（7.3 ± 0.4）%，結(jié)果見(jiàn)表3。以上結(jié)果表明，天然冰片對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)損傷的PC12細(xì)胞凋亡有抑制作用。

圖2 天然冰片對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)損傷的PC12細(xì)胞凋亡的影響 （±s, n = 6）Fig.2 Effect of natural borneol on the apoptosis of PC12 cells injured by 6-OHDA （±s, n = 6）

表3 天然冰片對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)損傷的PC12細(xì)胞凋亡率的影響（±s, n = 6）Tab. 3 Effect of natural borneol on the apoptotic rate of PC12 cells injured by 6-OHDA （±s, n = 6）

表3 天然冰片對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)損傷的PC12細(xì)胞凋亡率的影響（±s, n = 6）Tab. 3 Effect of natural borneol on the apoptotic rate of PC12 cells injured by 6-OHDA （±s, n = 6）

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

組別 細(xì)胞凋亡率/%對(duì)照組 0.6 ± 0.02模型組 28.7 ± 0.6**天然冰片組（7.5 μg/mL） 20.4 ± 0.4##天然冰片組（15 μg/mL） 7.3 ± 0.4##天然冰片組（30 μg/mL） 11.7 ± 0.4##F 2 019.042 P 0.000

3 討論

有文獻(xiàn)報(bào)道芳香開(kāi)竅藥對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有很好的保護(hù)作用，蘇合香揮發(fā)油可保護(hù)大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞免受糖氧剝奪/再?gòu)?fù)氧（OGD/R）的損傷[11]；麝香可保護(hù)局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)元[12]。但這類(lèi)中藥大部分成分復(fù)雜，藥效成分不明確，生物靶點(diǎn)多，這就導(dǎo)致其發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的藥效成分很難確定。天然冰片為小分子化合物，2020年版《中國(guó)藥典》規(guī)定天然冰片含右旋龍腦不得少于96.0%，其具有藥效成分單一、明確、純度高的優(yōu)點(diǎn)。本研究以6-OHDA誘導(dǎo)損傷的PC12細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，對(duì)天然冰片的神經(jīng)保護(hù)作用進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，天然冰片可以保護(hù)PC12細(xì)胞免受神經(jīng)毒素6-OHDA的損傷，但天然冰片保護(hù)PC12細(xì)胞的機(jī)制尚不明確。芳香開(kāi)竅藥石菖蒲的藥效成分β-細(xì)辛醚可通過(guò)抑制TNF-α、IL-1β的分泌，下調(diào)水通道蛋白4（AQP4）的表達(dá)來(lái)保護(hù)星形膠質(zhì)細(xì)胞，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[13]，天然冰片可能通過(guò)相似的機(jī)制發(fā)揮對(duì)PC12細(xì)胞的保護(hù)作用，課題組后期將對(duì)其機(jī)制進(jìn)行研究。

有文獻(xiàn)報(bào)道天然冰片可通過(guò)抑制腦海馬體CA1、CA3區(qū)中瞬時(shí)受體電位錨蛋白1（TRPA1）和瞬時(shí)感受器電位香草酸受體Ⅰ型蛋白（TRPV1）的表達(dá)以及增加神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸（GABA）的釋放，對(duì)癲癇持續(xù)狀態(tài)模型小鼠發(fā)揮抗驚厥作用[14]；天然冰片可通過(guò)增加B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）基因表達(dá)量，降低Bcl-2相關(guān)蛋白的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)阿爾茲海默癥的治療作用[6]。已有研究表明天然冰片對(duì)神經(jīng)損傷有治療作用。本研究不足之處在于未對(duì)天然冰片對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)損傷的PC12細(xì)胞的治療作用進(jìn)行研究，后期將進(jìn)行考察。

4 結(jié)論

本研究表明芳香開(kāi)竅藥天然冰片可以保護(hù)6-OHDA誘導(dǎo)損傷的PC12細(xì)胞，具有神經(jīng)保護(hù)作用。但天然冰片發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用具體的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究為芳香開(kāi)竅藥天然冰片的神經(jīng)保護(hù)作用提供了理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)支持，為天然冰片應(yīng)用到神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供了理論基礎(chǔ)。