三黃連復(fù)方制劑治療尼羅羅非魚(yú)鏈球菌病的試驗(yàn)

周淑棉，盧燕婷，朱萌，梁萬(wàn)文，劉高玫，韋英益，胡庭俊

（1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530005；2.廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究院，廣西 南寧 530021）

無(wú)乳鏈球菌Streptococcus agalactiae 是鏈球菌病的主要病原，主要侵入機(jī)體腸道，破壞機(jī)體的免疫系統(tǒng)，在宿主血液內(nèi)增殖，透過(guò)血-腦屏障侵入腦組織，導(dǎo)致羅非魚(yú)呈現(xiàn)典型的臨床癥狀和組織病理學(xué)變化[1]，近年來(lái)，在粵西地區(qū)的發(fā)病率高達(dá)70%，給羅非魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，防控羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌病的有效途徑是接種疫苗[2]，疫苗接種方式主要有腹腔注射、浸泡噴霧和口服等[3-5]。腹腔注射疫苗途徑治療效果最佳，無(wú)須穿越魚(yú)體的黏膜屏障即可快速誘導(dǎo)機(jī)體啟動(dòng)獲得性免疫反應(yīng)，還可根據(jù)保護(hù)效果來(lái)優(yōu)化抗原劑量，缺點(diǎn)是注射時(shí)操作煩瑣，耗時(shí)耗力，還會(huì)對(duì)魚(yú)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。因此，抗生素防控羅非魚(yú)鏈球菌病仍然是主流，但長(zhǎng)期使用化學(xué)藥物和抗生素不僅對(duì)環(huán)境造成污染，還會(huì)引起細(xì)菌的耐藥性。

中草藥是“綠色環(huán)?？咕鷦薄Ｑ芯勘砻?，含青蒿、苦楝、檳榔、辣廖和苦參的復(fù)方中草藥顯著降低了患小瓜蟲(chóng)病草魚(yú)的死亡率[6]。給患肝膽綜合征的草魚(yú)投喂含有奶薊果復(fù)合物、胡黃連、乙酰半胱氨酸、綠茶、五味子和姜黃素等中草藥，起到了一定的治療作用[7]。潑灑含有2～16 mg·L-1黃芩和麻黃等復(fù)方中草藥制劑能提高患水霉菌錦鯉的免疫能力[8]。這些成功的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)為中藥制劑的臨床應(yīng)用提供了實(shí)踐依據(jù)。本試驗(yàn)通過(guò)給感染的吉富羅非魚(yú)Oreochromis niloticus 飼喂不同劑量的三黃連復(fù)方制劑，觀察中藥制劑對(duì)感染魚(yú)的治療效率、免疫指標(biāo)和肝臟生化指標(biāo)的影響，可為中藥制劑的臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)菌與藥物

無(wú)乳鏈球菌B（GX107）由廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院魚(yú)病研究室提供，保存于廣西大學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)室。三黃連復(fù)方制劑由廣西大學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)室提取制備，100 mL 相當(dāng)于原生藥50 g，即0.5 g·mL-1。氟苯尼考購(gòu)自廣西北斗星動(dòng)物保健品有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

吉富羅非魚(yú)體質(zhì)量為（41.7±8.6）g，由廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院國(guó)家級(jí)廣西南寧羅非魚(yú)良種場(chǎng)提供，試驗(yàn)前在研究所水族樓大缸內(nèi)暫養(yǎng)7 d。試驗(yàn)期間，池水溫28℃，24 h 不間斷充氧。試驗(yàn)前隨機(jī)取5 尾魚(yú)，取腦組織進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，確保試驗(yàn)魚(yú)未感染細(xì)菌。

1.1.3 試劑

總超氧化物歧化酶（T-SOD）、堿性磷酸酶（AKP）、溶菌酶（LSZ）、淀粉酶、總蛋白、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT/GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST/GOT）、谷胱甘肽（GSH）和黃嘌呤氧化酶（XOD）試劑盒均為南京建成生物有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 飼料制備

取相應(yīng)體積中藥制劑提取物，用噴霧器均勻噴灑于羅非魚(yú)膨化飼料表面，充分混勻。待藥物被飼料充分吸收后于室溫下陰干，用塑料袋分裝及密封，保存于-20℃。

1.2.2 攻毒菌液的制備

試驗(yàn)用無(wú)乳鏈球菌提前接種于血平板上，37℃恒溫箱中培養(yǎng)20～24 h。試驗(yàn)前使用PBS 緩沖液洗下平板上的菌落，根據(jù)比濁法調(diào)整菌液濃度至1.5×109CFU·mL-1備用。

1.2.3 試驗(yàn)分組與處理

將暫養(yǎng)的180 尾吉富羅非魚(yú)隨機(jī)分為空白對(duì)照組、感染不給藥組、氟苯尼考對(duì)照組及低、中、高三黃連合劑組（30 mL·kg-1、60 mL·kg-1和120 mL·kg-1），每組30 尾。

試驗(yàn)第1 d，空白對(duì)照組腹腔注射0.2 mL 的PBS 緩沖液，其他組均腹腔注射0.2 mL 濃度為1.5×109CFU·mL-1的無(wú)乳鏈球菌液。空白對(duì)照組與感染不給藥組均飼喂不加藥的基礎(chǔ)料，不同劑量給藥組分別飼喂含相應(yīng)劑量三黃連復(fù)方制劑添加飼料，氟苯尼考對(duì)照組飼喂0.05 g·kg-1的含藥飼料。試驗(yàn)期間，早中晚各飼喂一次，連續(xù)7 d。觀察感染無(wú)乳鏈球菌的羅非魚(yú)的發(fā)病情況，及時(shí)清理死魚(yú)，每天統(tǒng)計(jì)各實(shí)驗(yàn)組羅非魚(yú)的死亡率，計(jì)算組方對(duì)吉富羅非魚(yú)的有效率。有效率＝（存活數(shù)/感染數(shù)）×100%。

1.2.4 測(cè)定免疫、消化和生化指標(biāo)

血清免疫學(xué)指標(biāo)：試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每組隨機(jī)選取10 尾魚(yú)，尾靜脈采血1 mL 左右，分離血清測(cè)定T-SOD、AKP 和LSZ 的活性。

生化學(xué)指標(biāo)：準(zhǔn)確稱量所取羅非魚(yú)經(jīng)臟組織的重量，按重量（g）∶體積（mL）＝1∶9 的比例加入預(yù)冷PBS，制備10%肝臟組織勻漿，4℃，2 500～3 500 r·min-1離心20 min，按照各試劑盒的說(shuō)明書(shū)取上清液測(cè)定肝臟總蛋白、肝臟淀粉酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT/GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST/GOT）、谷胱甘肽（GSH）和黃嘌呤氧化酶（XOD）等的活性。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著，P＞0.05 為差異不顯著。有效率等計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 攻毒后羅非魚(yú)的臨床癥狀

攻毒后，感染吉富羅非魚(yú)食欲廢絕，行動(dòng)遲緩，離群獨(dú)游于水面，有時(shí)作旋轉(zhuǎn)游泳后再沉于水底。攻毒后的羅非魚(yú)體色發(fā)黑，眼球渾濁，突出，鰓部和胸鰭發(fā)紅，肛門紅腫。解剖發(fā)現(xiàn)病魚(yú)腦組織水腫、出血，腹腔有黃色膠凍樣積液，肝臟出現(xiàn)灰白色島嶼狀的壞死斑，腸道糜爛。

2.2 有效率統(tǒng)計(jì)分析

由表1 可知，經(jīng)三黃連制劑處理的感染魚(yú)死亡率降低；與空白對(duì)照組比較，感染不給藥組羅非魚(yú)死亡率顯著升高（P＜0.01）；低、中、高劑量的三黃連復(fù)方制劑對(duì)羅非魚(yú)鏈球菌病治療的有效率分別為50.00%、43.33%和60.00%。

表1 三黃連復(fù)方制劑對(duì)羅非魚(yú)鏈球菌病的有效率Tab.1 The effective rates of Sanhuanglian compound preparation against tilapia streptococcosis

2.3 淀粉酶活性測(cè)定

人工感染無(wú)乳鏈球菌7 d 后，病原體對(duì)吉富羅非魚(yú)機(jī)體的消化系統(tǒng)產(chǎn)生了一定的影響，與空白組比較，接種無(wú)乳鏈球菌試驗(yàn)魚(yú)淀粉酶活性顯著下調(diào)（P＜0.05）；與感染不給藥組比較，中、高劑量的三黃連復(fù)方制劑組羅非魚(yú)淀粉酶活性顯著升高（P＜0.05），呈一定的劑量效率關(guān)系（表2）。

表2 試驗(yàn)魚(yú)淀粉酶測(cè)定結(jié)果Tab.2 The amylase activities in the tilapia

2.4 血清免疫學(xué)指標(biāo)及肝生化指標(biāo)活性測(cè)定

由表3 可知，與空白對(duì)照比較，人工感染無(wú)乳鏈球菌7 d，感染不給藥組羅非魚(yú)血清中免疫因子AST 和AKP 的活性顯著升高（P＜0.05），而LSZ 和ALT 的活性顯著降低（P＜0.05）。與感染不給藥組對(duì)比，低、中、高劑量的三黃連制劑顯著升高了T-SOD的活性（P＜0.05），高劑量的三黃連制劑顯著升高了AKP 的活性；中劑量三黃連制劑顯著升高了LSZ 的活性（P＜0.05）；中、高劑量的三黃連制劑顯著升高了ALT 的活性（P＜0.05）；低劑量的三黃連制劑顯著升高了AST 的活性，中、高劑量的三黃連制劑顯著降低了AST 的活性（P＜0.05）。

表3 試驗(yàn)魚(yú)血清免疫因子及肝生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果Tab.3 The results of the immune index and liver biochemical index of infected fish

2.5 吉富羅非魚(yú)肝臟生化指標(biāo)測(cè)定

由表4 可知，與空白對(duì)照組比較，在人工感染無(wú)乳鏈球菌7 d 后，下調(diào)了羅非魚(yú)肝臟中的GSH-Px 的活性（P＞0.05）。與感染不給藥組比較，不同劑量三黃連復(fù)方制劑上調(diào)了羅非魚(yú)肝臟中GSH-Px 和GSH 的活性，下調(diào)XOD 的活性。中、高劑量三黃連復(fù)方制劑顯著上調(diào)病魚(yú)肝臟中的GSH活性（P＜0.05），低、中、高劑量三黃連復(fù)方制劑顯著降低了病魚(yú)肝臟XOD 活性（P＜0.05）。

表4 試驗(yàn)魚(yú)GSH-PX、GSH 和XOD 活性分析Tab.4 Activities of GSH-PX,GSH and XOD in the tilapia

3 討論

鏈球菌病是造成水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)巨大損失的主要因素之一，病原已經(jīng)由海豚鏈球菌Streptococcus iniae 轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)乳鏈球菌，發(fā)病率為20%～30%，死亡率高達(dá)80%以上，目前，疫苗和免疫增強(qiáng)劑開(kāi)發(fā)尚未取得完全的成功，中草藥混飼給藥不失為控制疾病最直接、簡(jiǎn)便的方法。

Rattanachaikunsopon 等[9]在飼料中添加穿心蓮干葉粉末和穿心蓮水提物有效降低了尼羅羅非魚(yú)感染無(wú)乳鏈球菌的死亡率。李一珊等[10]發(fā)現(xiàn)，黃連醇提物影響無(wú)乳鏈球菌調(diào)整期的某個(gè)過(guò)程，抑制了細(xì)菌DNA 的合成，阻止了病原菌大量增長(zhǎng)，可治療羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌病急癥和重癥。三黃散和黃芪多糖通過(guò)清除病魚(yú)機(jī)體內(nèi)積累的毒素，修復(fù)受損的肝臟等器官，提高機(jī)體的免疫力，降低了羅非魚(yú)鏈球菌病的死亡率[11]。黃芩苷可增強(qiáng)溶菌酶活性，提高殺滅金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus 的作用[12]。復(fù)方中草藥添加劑對(duì)黃鱔Monopterus albus和蝦等動(dòng)物具有一定的生長(zhǎng)促進(jìn)作用[13,14]。本實(shí)驗(yàn)中，感染無(wú)乳鏈球菌后，羅非魚(yú)死亡率達(dá)到66.67%，經(jīng)不同劑量三黃連中藥制劑治療病魚(yú)后，死亡率顯著降低，對(duì)疾病的保護(hù)率提高。

三黃連復(fù)方制劑能在一定程度上提高病魚(yú)的淀粉酶活性，增強(qiáng)病魚(yú)的食欲，促進(jìn)消化功能的恢復(fù)，這與王吉橋等[15]通過(guò)復(fù)方中草藥提高患有淋巴囊腫的牙鲆幼魚(yú)的淀粉酶活性的研究結(jié)果相類似。三黃連制劑處理病魚(yú)后，肝臟GSH-Px 和GSH 活性增強(qiáng)，抑制了XOD 活性，降低氧自由基對(duì)肝臟的損傷，達(dá)到保護(hù)與修復(fù)肝臟的作用，其原因可能是中藥制劑中含黃芩苷、黃芩素[16]、大黃素[17]和土連翹[18]等物質(zhì)具有清除氧自由基、烷過(guò)氧自由基，抑制XOD 與XOD 具有較強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制等作用有關(guān)。

AKP 通過(guò)改變細(xì)菌表面的結(jié)構(gòu)增強(qiáng)其異己性，利于動(dòng)物吞噬細(xì)胞吞噬和降解細(xì)菌[19,20]。本試驗(yàn)中，羅非魚(yú)受到鏈球菌的脅迫，病魚(yú)體內(nèi)AKP 的活性升高，飼喂三黃連復(fù)方制劑能進(jìn)一步提高羅非魚(yú)體內(nèi)的AKP 的活性，增強(qiáng)羅非魚(yú)清除病原體的能力。血漿中GPT 與GOT 水平是指示肝臟損傷的主要敏感指標(biāo)。在正常生理情況下，GPT 與GOT 在血清中含量很低，但是，當(dāng)細(xì)胞膜通透性增加或細(xì)胞壞死時(shí)會(huì)大量進(jìn)入血液。羅非魚(yú)鏈球菌爆發(fā)常伴隨著肝臟損傷，大量的GPT 釋放進(jìn)血液，肝臟受損無(wú)法恢復(fù)至正常水平，導(dǎo)致肝臟GPT 含量顯著下降[21,22]。

結(jié)論

羅非魚(yú)腹腔注射濃度為1.5×109CFU·mL-1的菌液0.2 mL 后，誘導(dǎo)發(fā)生鏈球菌病，顯著增加了羅非魚(yú)的死亡率。不同劑量的三黃連復(fù)方制劑處理后，羅非魚(yú)有效率均高于感染不給藥組；且促進(jìn)脾臟的發(fā)育，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，顯著升高病魚(yú)血清T-SOD 和AKP 的活性；三黃連復(fù)方制劑能在一定程度上提高病魚(yú)的淀粉酶活性，增強(qiáng)病魚(yú)的食欲，促進(jìn)消化功能的恢復(fù)；誘導(dǎo)肝臟增強(qiáng)GSH-Px和GSH 活性，降低XOD 活性，降低氧自由基對(duì)肝臟的損傷，保護(hù)與修復(fù)肝臟。