高原鰍屬魚類線粒體DNA 和微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)研究進展

劉云國，張艷珍,2，隋智海，張海光，全先慶，張如華

（1.臨沂大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 臨沂 276000;2.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046）

高原鰍屬Triplophysa 隸屬于鯉形目Cyprinidformes、鰍科Cobitidae、條鰍亞科Nemacheilinae，是條鰍亞科中最大的類群，也是條鰍亞科魚類中適應(yīng)于高原高寒環(huán)境的一個特殊類群[1,2]。近十幾年來，在我國相繼發(fā)現(xiàn)了許多高原鰍屬魚類[3-12]，目前全世界約有140 個種，主要分布于青藏高原及其周邊地區(qū)，我國有100 多個種，其中一些種的遺傳多樣性正遭受威脅[7,13-15]。DNA 分子標(biāo)記是評價遺傳多樣性以及資源保護的有力工具。在眾多DNA 分子標(biāo)記中，目前較常用的兩種是線粒體DNA（mtDNA）測序技術(shù)和微衛(wèi)星標(biāo)記。線粒體DNA 是細胞核外能自主復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及翻譯的遺傳因子。魚類線粒體DNA 結(jié)構(gòu)簡單、分子量小、拷貝數(shù)高、進化速度快且存在種群差異多樣性、易于擴增測序，為研究系統(tǒng)發(fā)育、分子進化和物種起源的重要分子標(biāo)記。微衛(wèi)星標(biāo)記是均勻分布于真核生物基因組中的簡單重復(fù)序列，由2～6 個核苷酸的串聯(lián)重復(fù)片段構(gòu)成。重復(fù)單位的重復(fù)次數(shù)在個體間呈高度變異性且數(shù)量豐富，因此微衛(wèi)星標(biāo)記應(yīng)用非常廣泛[16]。

1 高原鰍屬魚類線粒體基因測序及其應(yīng)用

高原鰍屬魚類的線粒體基因組全長16～17 kb，包括13 個蛋白質(zhì)編碼基因，22 個tRNA，2 個rRNA，1 個非編碼區(qū)域，即控制區(qū)（D-loop 區(qū)），高原鰍屬魚類的控制區(qū)長度范圍在917～930 bp 之間。斯氏高原鰍T.stoliczkae[17,18]、細尾高原鰍T.stenura[19]、葉爾羌高原鰍T.yarkandensis[20,21]、玫瑰高原鰍T.rosa[22]和理縣高原鰍T.lixianensis[23]等的線粒體基因組的測序已經(jīng)完成。李太平等[24,25]對小眼高原鰍T.microps線粒體DNA 進行了酶切分析，并克隆了其細胞色素b（cytb）基因序列的全長，研究了其遺傳多樣性。何德奎等[2]通過cytb 基因研究了高原鰍屬魚類的分子系統(tǒng)發(fā)育，探討了青藏高原水系高原鰍產(chǎn)生遺傳分歧的生物地理學(xué)過程。賀剛等[26]采用7 種同工酶凝膠電泳研究了沅江水系湘西盲高原鰍T.xiangxiensis 群體的遺傳多樣性，結(jié)果表明，湘西盲高原鰍遺傳多樣性較低，這可能與湘西盲高原鰍長期生存在較為封閉的洞穴環(huán)境中，群體的遺傳結(jié)構(gòu)單一化相關(guān)。陶聰[27]分析了六個不同地區(qū)的74 尾貝氏高原鰍T.bleekeri 樣本的線粒體cytb 基因和控制區(qū)DNA 序列，系統(tǒng)聚類分析表明，貝氏高原鰍分為兩個進化枝：一是長江流域的種群，另一是黃河流域的種群，并推測我國現(xiàn)行地勢的形成以及長江黃河框架的形成對貝氏高原鰍各群體間的遺傳差異性產(chǎn)生了重要影響。楊成等[28]基于線粒體cytb 基因序列測序探究了擬硬刺高原鰍T.pseudosderoptera 種群的遺傳多樣性和分化程度，發(fā)現(xiàn)擬硬刺高原鰍寶庫河種群遺傳多樣性低于黃河種群。擬硬刺高原鰍黃河種群和寶庫河種群間存在顯著的分化，建議在實踐中將兩個種群分開管理和保護，以達到保護種群遺傳多樣性的目的。晁燕等[29]利用線粒體cytb 基因全序列分析了擬鯰高原鰍T.siluroides 黃河種群與大通河種群的遺傳多樣性和分化水平。擬鯰高原鰍黃河種群遺傳多樣性低于大通河種群，人類活動的影響和外來種引入可能引起了擬鯰高原鰍黃河種群遺傳多樣性的下降；擬鯰高原鰍黃河種群和大通河種群間存在顯著的分化，建議在實踐中將兩個種群分開管理和保護。Hou 等[30]基于線粒體控制區(qū)測序利用5 個野生群體共98 個個體分析了東方高原鰍T.orientalis 種內(nèi)和種間的遺傳多樣性差異，并檢測其遺傳結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進化關(guān)系，發(fā)現(xiàn)河流群體間的遺傳距離比湖泊群體間的遺傳距離要大，說明高原湖泊群體的歷史基因流較大，三個湖泊創(chuàng)始群體可能產(chǎn)生了瓶頸效應(yīng)。

等位基因數(shù)、觀測雜合度、期望雜合度和多態(tài)信息含量等都是反映群體遺傳基礎(chǔ)多樣性水平的指標(biāo)，是基因豐富度的體現(xiàn)，其數(shù)值越大，說明基因豐富度越高，遺傳潛力越大。姚雁鴻[31]同時運用線粒體cytb 基因和控制區(qū)DNA 序列分析了3 個不同湘西盲高原鰍遺傳多樣性及遺傳分化，為保護湘西盲高原鰍提供了依據(jù)。張艷萍等[32]用線粒體DNA控制區(qū)序列分析了黃河上游瑪曲段似鲇高原鰍3個地理種群的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，共簽定了10個單倍型。遺傳分化指數(shù)（Fst）統(tǒng)計檢驗和系統(tǒng)發(fā)育樹表明，3 個地理群體之間尚未有顯著的遺傳分化，建議將黃河上游瑪曲段似鲇高原鰍群體作為一個整體進行保護。Niu 等[33]分析了玫瑰高原鰍的核型和基因組大小，發(fā)現(xiàn)其為二倍體，共48 條染色體，估計的平均基因組大小為（0.88±0.05）pg。高原鰍屬魚類主要分布在青藏高原及其周邊地區(qū)，迄今為止共發(fā)現(xiàn)140 個種，為適應(yīng)特殊的高原環(huán)境，其外部形態(tài)變化較大，給形態(tài)學(xué)鑒定帶來了一定的困難。為解決這個難題，Li 等[15]利用DNA 條形碼技術(shù)鑒定了其中的33 個種共244 個個體，發(fā)現(xiàn)大部分種都能形成單獨的群組，具有較高的bootstrap 值支持，說明DNA 條形碼技術(shù)是一種鑒定高原鰍屬魚類的分子標(biāo)記方法。Feng 等[34]基于形態(tài)學(xué)和遺傳學(xué)分化，研究了青藏高原湖泊和河流中短尾高原鰍T.brevicauda 和異尾高原鰍T.stewarti 的進化動力學(xué)，發(fā)現(xiàn)兩種高原鰍在湖泊和河流中的數(shù)量比以及形態(tài)學(xué)和遺傳學(xué)等都顯示了較大的差異。Zhang等[35]利用線粒體DNA 測序方法研究了祁連山區(qū)梭形高原鰍T.leptosoma 的地理發(fā)生系統(tǒng)學(xué)，發(fā)現(xiàn)一些梭形高原鰍的分支對地理條件產(chǎn)生了適應(yīng)性變化。以上研究都為當(dāng)?shù)馗咴q屬魚類資源的保護提供了重要的遺傳參考數(shù)據(jù)，能夠根據(jù)遺傳多樣性水平和地理群體遺傳分化情況制定合理的保護管理策略。

2 高原鰍屬魚類微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)及其應(yīng)用

微衛(wèi)星標(biāo)記是一種共顯性遺傳標(biāo)記，可鑒別純合子和雜合子；具有豐富的多態(tài)性和良好的重復(fù)性，比其他顯性分子遺傳標(biāo)記如AFLP、RAPD、ISSR等具有更強的遺傳檢測能力。近十幾年來，開發(fā)水產(chǎn)生物微衛(wèi)星標(biāo)記一直是研究的熱點，本實驗室也已經(jīng)開發(fā)了多種水產(chǎn)生物的微衛(wèi)星標(biāo)記[36-38]。在高原鰍屬魚類的微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)上，Yao 等[39]利用FIASCO 方法（AFLP 擴增產(chǎn)物中包含的重復(fù)序列）在湘西盲高原鰍中開發(fā)了16 條微衛(wèi)星標(biāo)記，等位基因數(shù)在2～9 之間，遺傳學(xué)數(shù)據(jù)表明，它們是進行種質(zhì)多樣性和連鎖分析的潛在分子標(biāo)記。Li 等[18]利用FIASCO 方法通過構(gòu)建部分基因組文庫在前鰭高原鰍T.anterodorsalis 中新開發(fā)了10 條微衛(wèi)星標(biāo)記，等位基因2～13，顯示了較高的遺傳多樣性。當(dāng)前，獲取微衛(wèi)星的方法主要有基因組富集文庫法、近緣種雜交擴增法、基因組和cDNA 數(shù)據(jù)庫篩選法、基于RAPD、AFLP、ISSR 等擴增序列的篩選法和基于第二代測序技術(shù)的全基因組篩選法等。其中，基于第二代測序技術(shù)的全基因組篩選法是新近發(fā)展起來的一種高通量微衛(wèi)星標(biāo)記篩選方法，具有速度快、效率高、成本低的特點。與之前開發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記較常用的基因組富集文庫法相比，因為不需要針對特定微衛(wèi)星序列的篩選富集步驟，分離的微衛(wèi)星重復(fù)序列類型更加豐富，是一種直接從序列到微衛(wèi)星（Seq-to-SSR）的篩選方法[40]。Castoe 等[40]利用第二代測序技術(shù)，從兩種鳥類和一種蛇類上分別測序并篩選到了上萬條微衛(wèi)星序列，通過比較454 測序和Illumina 測序方法，證明了Illumina 雙向測序技術(shù)是一種經(jīng)濟、高效的微衛(wèi)星標(biāo)記篩選方法。Lance 等[41]分別建立了32 種生物的Illumina 雙向測序文庫，篩選到了大量微衛(wèi)星標(biāo)記，進一步驗證了該技術(shù)在不同物種中應(yīng)用的可行性。隨后，Norrell 等[42]利用Illumina 雙向測序技術(shù)從紅鯛Lutjanus campechanus中開發(fā)了84 條微衛(wèi)星標(biāo)記，證明了該方法的優(yōu)勢。

近年來，第二代測序技術(shù)在高原鰍屬魚類的微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)上也得到了應(yīng)用，如Zhao 等[43]利用454 高通量測序技術(shù)在玫瑰高原鰍中開發(fā)了11 條微衛(wèi)星標(biāo)記，并發(fā)現(xiàn)部分位點在近緣種墨曲高原鰍T.moquensis 中能夠跨種擴增。Wang 等[44]通過第二代測序?qū)_里湖高原鰍T.dalaica 進行了轉(zhuǎn)錄組分析，研究了其適應(yīng)高原缺氧的分子機理，并篩選到了上萬個微衛(wèi)星序列和SNP 位點。Liu 等[45]利用Illumina Hiseq 2500 測序平臺通過轉(zhuǎn)錄組測序在玫瑰高原鰍中新開發(fā)了9 條微衛(wèi)星標(biāo)記，以補充原有微衛(wèi)星標(biāo)記的不足。因而，獲得的微衛(wèi)星標(biāo)記數(shù)據(jù)，不僅為群遺傳多樣性評價、遺傳結(jié)構(gòu)分析、個體識別、遺傳圖譜構(gòu)建等奠定基礎(chǔ)，同時也對野生資源的合理開發(fā)利用以及今后的遺傳育種提供可利用的遺傳資料。姚雁鴻[31]利用篩選的16 對微衛(wèi)星標(biāo)記分析了湖南湘西龍山縣烏龍山的3 個不同洞穴湘西盲高原鰍群體的遺傳多樣性及遺傳分化。16 個微衛(wèi)星標(biāo)記在3 個群體中共檢測出83 個等位基因，每個基因座檢測到3～8 個等位基因。分子變異方差分析（AMOVA）結(jié)果表明，遺傳變異大部分（92.84%）來自群體內(nèi)，僅有7.16%來自于群體間，表明3 個群體處于未分化狀態(tài)，具有較大的遺傳一致性。趙金鳳等[46]首先測定了高原鰍屬13 個物種22 個個體的cytb 基因序列，基于貝葉斯和最大似然法構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，高原鰍屬魚類形成一個單系，玫瑰高原鰍所在的分支位于高原鰍屬魚類的基部。隨后采用微衛(wèi)星標(biāo)記及cytb 基因測序評估了玫瑰高原鰍的遺傳多樣性，結(jié)果顯示：玫瑰高原鰍的遺傳多樣性處于較低水平。

3 研究展望

目前，線粒體DNA 測序技術(shù)和微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用到高原鰍屬魚類的遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)分析、系統(tǒng)發(fā)育進化及保護遺傳學(xué)研究中。然而由于線粒體DNA 存在結(jié)構(gòu)多樣性，且有近緣物種線粒體遺傳物質(zhì)之間發(fā)生交流及核DNA 插入的風(fēng)險，單獨使用線粒體DNA 測序技術(shù)作為分子標(biāo)記存在一定的缺陷。微衛(wèi)星標(biāo)記自發(fā)突變率較高，且無規(guī)律可循，在一些種群中突變率很高，而在另一些種群中發(fā)生率可能很低，甚至是單態(tài)。不同微衛(wèi)星標(biāo)記間的突變率不同，也會增加遺傳距離和遺傳雜合度的估計誤差。建議在今后的遺傳分析時，線粒體DNA 測序技術(shù)應(yīng)結(jié)合微衛(wèi)星標(biāo)記聯(lián)合使用，發(fā)揮各自的優(yōu)點，降低單一DNA 分子標(biāo)記分析的風(fēng)險。