流式細胞術在貝類血細胞研究中的應用進展

張秀霞，王冬梅，李軍濤，張澤龍，冼健安,2

（1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術研究所，海南省海洋生物資源功能性成分研究與利用重點實驗室，海南 ?？?571101；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院海南熱帶農(nóng)業(yè)資源研究院，海南 ?？?571101）

流式細胞術（Flow Cytometry,FCM）是20 世紀70 年代發(fā)展起來的快速測定細胞物理和化學性質的技術。它以單個細胞為檢測單位，具有快速、靈敏、客觀、檢測量大并可同時檢測多個指標等優(yōu)點，在臨床醫(yī)學領域應用十分普遍。貝類是重要的水產(chǎn)經(jīng)濟動物和環(huán)境監(jiān)測的重要指示生物，F(xiàn)CM較早地引入到貝類研究中。血細胞在貝類的細胞免疫、體液免疫以及生理代謝中發(fā)揮重要作用，但一直以來，血細胞的研究主要依賴顯微觀察和生化方法，技術手段的缺乏和落后制約了研究的深度。引入FCM為貝類血細胞學研究提供了很好的檢測平臺，推動了貝類血細胞學研究的發(fā)展。本文綜述近年來FCM在貝類血細胞研究中的應用，可為FCM在貝類及其他水產(chǎn)動物中的進一步應用提供參考。

1 FCM在貝類血細胞分類中的應用

血細胞在貝類免疫中起至關重要的作用[1]，而血細胞的準確分類是進一步研究其功能的前提。前向角散射光（FSC）反映細胞大小，側向角散射光（SSC）反映細胞內(nèi)顆粒復雜程度，是流式細胞術區(qū)分不同類群細胞的主要參數(shù)。傳統(tǒng)貝類血細胞分類方法主要是顯微觀察細胞的大小和內(nèi)含顆粒的狀況，因此，F(xiàn)CM 十分適用于貝類血細胞的分類研究。

早在1988 年就開始嘗試用FCM 進行貝類血細胞分類，但研究結果的差異較大[2,3]。2001 年開始陸續(xù)有進一步的應用研究[4]，而我國則在2005 年才有文獻報道[5]，其應用情況見表1。貝類血細胞的分類一直分歧很大，至今仍沒有統(tǒng)一。應用FCM研究的結果也有一定差異，但總體看來，大部分雙殼貝類的血細胞可分為三類，部分研究結果只是命名不同；關于鮑類的研究較少，均認為只區(qū)分為漿樣細胞和透明細胞兩類[6,7]，與顯微觀察的研究[8]以及對雜色鮑Haliotis diversicolor 血細胞的研究結果[9]差異較大，其原因可能是技術操作的把握程度以及數(shù)據(jù)分析的準確性存在差異。

表1 流式細胞術在貝類血細胞分類中的應用Tab.1 Application of flow cytometry in shellfish haemocyte classification

2 FCM 在貝類血細胞基礎功能研究中的應用

不同類型的血細胞在貝類生理和免疫過程中的作用不同。FCM是細胞水平上的分析技術，應用這項技術為研究不同類型血細胞的功能提供了方便。

2.1 血細胞組成比例與血細胞總數(shù)（Total haemocyte count,THC）

不同類型血細胞的功能不同，血細胞的組成比例可在一定程度上反映機體的生理和免疫狀態(tài)。許秀芹等[17]研究了酵母聚糖和甘氨酸鋅兩種飼料免疫添加劑對櫛孔扇貝Chlamys farreri 血細胞組成比例的影響。結果顯示，注射刺激后其透明細胞的比例增加，顆粒細胞的比例減少。櫛孔扇貝注射球狀病毒感染后，血細胞中透明細胞比例顯著上升，大顆粒細胞比例顯著下降[31]。

THC 是常用的免疫指標，一般認為THC 的下降反映了機體免疫力的下降。Lambert 等[32]比較了不同地域及不同家系太平洋牡蠣Crassostrea gigas的細胞免疫狀態(tài)。結果發(fā)現(xiàn)，夏季耐受力較強的牡蠣家系具有更高的THC，生長地域也影響牡蠣的THC。本文認為食物源和繁殖條件可能是主要影響因素。

2.2 活性氧含量與呼吸爆發(fā)活力

細胞在吞噬過程中，伴隨產(chǎn)生大量活性氧（Reactive oxygen species,ROS）的過程稱為呼吸爆發(fā)。這些活性氧是細胞毒氧化劑，包括超氧陰離子（O2-）、過氧化氫（H2O2）和羥自由基[·OH]等，在殺滅和消化病原微生物的免疫防御中起十分重要的作用[33]。2',7'-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉（DCFH-DA）是最為常用的一種熒光探針，但對于它的檢測對象，還具有一定的爭議。有的研究認為，它主要被H2O2所氧化[11,14,34]，有的研究認為所有種類的ROS 與之都有反應。有的則認為它反映的是ROS 和活性氮（Reactive nitrogen species，RNS）的總量[7,32]。

Lambert 等[14]建立了應用DCFH-DA 作為熒光探針測定太平洋牡蠣血細胞呼吸爆發(fā)活力的FCM方法，并發(fā)現(xiàn)佛波酯（PMA）不影響血細胞的呼吸爆發(fā)活力；酵母聚糖可顯著誘導產(chǎn)生ROS，主要體現(xiàn)于顆粒細胞上；而抗凝劑會抑制ROS 的產(chǎn)生。Lambert 等研究發(fā)現(xiàn)，不同家系和地域的太平洋牡蠣的血細胞ROS 水平不同，夏季耐受力較強的牡蠣家系ROS 水平較低[32]。Goedken 等[1]發(fā)現(xiàn)：PMA 刺激可顯著提高美洲牡蠣C.virginica 顆粒細胞和中間型細胞的ROS 含量，而對透明細胞沒有顯著影響，即前兩種細胞具有較強的呼吸爆發(fā)活力。Wang等[24]以DCFH-DA 探針分析了翡翠貽貝Perna viridis的ROS 含量，發(fā)現(xiàn)顆粒細胞的ROS 含量顯著高于透明細胞；應用DHR123 作為O2-特異性探針的測定顯示：顆粒細胞的O2-含量也顯著高于透明細胞。Donaghy 等[15]對近江牡蠣C.ariakensis 的研究結果顯示：顆粒細胞中非誘導性ROS 含量最高，透明細胞次之，漿樣細胞最少。

2.3 吞噬活性

應用流式細胞術測定細胞的吞噬活性時，一般用表面結合了羧酸基團的聚苯乙烯熒光微球（Carboxylate-modified fluorescent microspheres）作為被吞噬物，最常用的是直徑為1 μm 和2 μm 的黃綠色微球[7,35]。石芳芳等[36]篩選和比較了各種緩沖體系對扇貝血細胞吞噬活性的影響，結果顯示以過濾海水作為緩沖液時血細胞的吞噬活性最高。海灣扇貝Argopecten irradians[37]血細胞的吞噬率顯著高于櫛孔扇貝[36]。李進壽等研究了不同含量熒光微球對雜色鮑H.diversicolor 血細胞的吞噬率的影響，認為當熒光微球含量為血細胞含量的6.82 倍時較為合適。研究還發(fā)現(xiàn)，雜色鮑經(jīng)低鹽度脅迫后，血細胞的吞噬率顯著下降。翡翠貽貝顆粒細胞吞噬率為40.84%，顯著高于透明細胞的4.50%[24]。近江牡蠣Crassostrea ariakensis 顆粒細胞的吞噬率為41.2%，顯著高于透明細胞的22.6%[15]。美洲牡蠣C.virginica 血細胞中，顆粒細胞的吞噬活力最強，中間型細胞次之，透明細胞吞噬活力最低[11]。

2.4 溶酶體數(shù)量與非特異性酯酶活性

溶酶體是胞內(nèi)含有眾多水解酶的重要細胞器，為細胞內(nèi)的溶解或消化消化器官，可以殺死和降解病原體，起到免疫防御作用。翡翠貽貝顆粒細胞中溶酶體的數(shù)量多于透明細胞[24]。皺紋盤鮑Haliotis discus discus 血細胞的溶酶體數(shù)量較為均一；根據(jù)血細胞中溶酶體數(shù)量，角蠑螺Turbo cornutus 可區(qū)分三個亞群[7]。

酯酶是溶酶體酶類之一，是機體清除病原體、異物和壞死細胞的重要工具之一。以二乙酸熒光素（FDA）為探針測定酯酶活性。翡翠貽貝顆粒細胞的酯酶活性顯著高于透明細胞，這與溶酶體數(shù)量的結果相吻合[24]。除酯酶以外，通過相應的試劑盒還可用FCM 測定胞內(nèi)的氨肽酶（aminopeptidase）和過氧化物酶（peroxidase）等的活性[35,38]。

3 FCM在貝類病理學研究中的應用

血細胞免疫功能研究主要通過注射和離體刺激兩種方式進行處理，再分析血細胞各項參數(shù)的變化，以探討血細胞在病原體防御過程中的作用。給太平洋牡蠣注射感染弧菌Vibrio aestuarianus 后，THC 先升高后恢復至對照組水平，這是機體對抗病原體感染的首要細胞響應。新的血細胞可能有兩種來源：一是組織中血細胞被調動進入血淋巴中；二是造血組織的造血作用。感染的牡蠣血細胞的吞噬活性和粘合能力顯著下降，表明該病原體通過抑制血細胞的吞噬活性和粘合能力來躲避宿主的細胞免疫；弧菌感染還使顆粒細胞和透明細胞的ROS 含量均顯著升高，氧化代謝過程的失衡使機體產(chǎn)生氧化脅迫，這可能是發(fā)病機理之一[39]。櫛孔扇貝經(jīng)球狀病毒注射感染后，大顆粒細胞比例顯著下降，可能與組織損傷和炎癥反應過程中大顆粒細胞的脫顆粒作用有關；注射病毒也導致血細胞死亡率顯著上升，對免疫功能有一定的抑制作用[31]。胞內(nèi)的原生動物寄生蟲Bonamia ostreae 與其宿主歐洲扁牡蠣O.edulis 的血細胞進行體外孵育，導致血細胞的非特異性酯酶活性和ROS 含量顯著下降，但對血細胞的死亡率和吞噬活力沒有顯著影響[40]。

4 FCM 在貝類生態(tài)毒理學研究中的應用

4.1 重金屬

流式細胞術在貝類生態(tài)毒理學研究中應用廣泛，現(xiàn)已研究了對重金屬、有機污染物、殺蟲劑、有害藻類等的細胞毒性，以及其他水體環(huán)境脅迫因子的脅迫機制。Brousseau 等[41]分析了幾種重金屬離子對砂海螂Mya arenaria 離體血細胞吞噬活性的影響。結果顯示：對吞噬活性的抑制程度由強至弱依次為：ZnCl2＜CdCl2＜AgNO3＜HgCl2＜CH3HgCl；除Ag-NO3外，其他重金屬離子在10-9mol/L 和10-8mol/L的低濃度時可刺激血細胞的吞噬活性。Sauve 等[42]研究了重金屬對多種海洋和淡水貝類的毒性，結果顯示：不同物種對不同的重金屬具有敏感性，評估環(huán)境生態(tài)風險時應充分考慮物種間的差異。Gagnaire 等[38]研究了Cd 和Hg 對太平洋牡蠣血細胞活性和免疫功能的影響，發(fā)現(xiàn)在實驗條件下Cd 對血細胞的影響不顯著，Hg 顯著抑制血細胞活性，提高氨基肽酶陽性細胞的比例，抑制酚氧化酶活性，Hg對雙殼類的免疫功能更具威脅。Mottin 等[43]研究表明：高濃度Zn（1 000 μmol/L）抑制了鮑Haliotis tuberculata 離體血細胞的免疫功能和ROS 的產(chǎn)生，但提高了非特異性酯酶活性。Foster 等[44]比較研究了離體和活體狀態(tài)下，Cu 對美洲牡蠣血細胞凋亡的影響，結果發(fā)現(xiàn)：離體狀態(tài)下，Cu 誘導血細胞發(fā)生凋亡，但活體實驗中Cu 反而抑制了血細胞凋亡，這可能是兩種脅迫方式的生物利用度不同。Cd 和苯并芘脅迫7 d 后，文蛤M.meretrix 血細胞的死亡率和活性氧水平上升，吞噬功能下降，顯著降低了文蛤血細胞的功能和免疫力[45]。

4.2 其他污染物

持久性有機污染物具有持久性和高毒性而受到高度重視。Gagnaire 等[46]將太平洋牡蠣血細胞分別暴露于23 種環(huán)境污染物中，包括多環(huán)芳烴（PAH）、多氯聯(lián)苯（PCB）和殺蟲劑，結果PAH 導致血細胞的溶酶體數(shù)量和酯酶活性下降，顆粒細胞的比例上升，但細胞死亡率下降；PCB77 抑制溶酶體數(shù)量，對其他指標沒有影響；殺蟲劑中對氧磷抑制溶酶體數(shù)量和酯酶活性，誘導產(chǎn)生ROS。Bouilly 等[47]研究發(fā)現(xiàn)，太平洋牡蠣暴露于除草劑敵草隆中11周后，血細胞的死亡率、顆粒細胞比例、吞噬活性、活性氧含量和溶酶體數(shù)量均上升。納米材料作為新型的環(huán)境污染物已引起高度關注，其對生物體的毒性也不容忽視。Canesi 等[48]研究了納米碳對貽貝Mytilus galloprovincialis 的免疫毒性，結果顯示：經(jīng)45 min 孵育脅迫后，10 μg/mL 納米碳導致血細胞的線粒體數(shù)量減少，而5 μg/mL 納米碳導致線粒體膜電位下降。

4.3 有毒藻類

水體中，尤其是發(fā)生水華時，有害藻類產(chǎn)生的毒素影響貝類的免疫功能，甚至導致死亡。近年來，用FCM 研究有害藻類對貝類血細胞毒性的報道很多[49]。Hégaret 等[50]發(fā)現(xiàn)，微小原甲藻Prorocentrum minimum 對血細胞有免疫刺激作用，而用的其他藻則抑制血細胞免疫功能，包括降低其吞噬活性、活性氧含量和粘附能力，以及導致死亡率上升。

4.4 其他環(huán)境因子

水溫、鹽度、溶氧和pH 等環(huán)境條件也影響貝類生存和免疫功能。Chen 等[51]分別將櫛孔扇貝從17℃轉移至11℃，從23℃轉移至28℃72 h。結果顯示，28℃升溫脅迫導致扇貝血細胞吞噬活性下降，ROS含量上升，而11℃降溫脅迫對細胞活性無顯著的影響，表明櫛孔扇貝對低溫的耐受性更強。Donaghy 和Volety[25]研究了溫度脅迫對翡翠貽貝離體血細胞的影響。結果顯示，10℃對血細胞造成脅迫影響，抑制了其吞噬活性，提高了ROS 含量。Wang 等研究低氧和高溫[52]、低氧和低鹽[53]聯(lián)合作用對翡翠貽貝血細胞死亡率、吞噬活性、非特異性酯酶活性、ROS 含量以及溶酶體數(shù)量的影響。曲凌云等[54]建立了應用FCM測定櫛孔扇貝血細胞HSP70（熱休克蛋白70）表達量變化的方法，測定了高溫刺激下櫛孔扇貝血細胞HSP70 表達量變化。結果顯示：高溫誘導了血細胞HSP70 表達量的上升，在誘導7 h 時最高[55]。杜俊鵬等[56]采用碘化丙啶（PI）/羅丹明123 雙染的方法，研究了不同鹽度脅迫對葡萄牙牡蠣Crassostrea angulata 精子質膜完整性和線粒體活性的影響。結果顯示，鹽度脅迫先損傷精子質膜，后傷害線粒體活性；10 和15 低鹽脅迫對精子損傷嚴重，精子受精率和卵裂率顯著降低。Jauzein 等[57]將光芒長文蛤Macrocallista nimbosa 從鹽度30 轉移至18 的水體中7 d 后，血細胞吞噬活力顯著下降，死亡率升高。Andreyeva 等[28]研究顯示：24 h 的缺氧脅迫導致紫貽貝M.galloprovincialis 的無顆粒細胞數(shù)量下降，而顆粒細胞數(shù)量升高，但對血細胞死亡率沒有顯著影響；ROS 含量在無顆粒細胞中升高，而在顆粒細胞中下降。Parrino 等[58]比較了西西里島兩個棲息區(qū)紫貽貝種群的血細胞免疫與結構特征，發(fā)現(xiàn)兩個種群的血細胞免疫特性存在一定的差異，可能是兩個棲息地的水環(huán)境參數(shù)的差異所導。Barjhoux 等[59]用Hoechst33342、PI 和黃綠色熒光微球熒光探針建立了斑馬紋貽貝Dreissena polymorpha 細胞毒性和血細胞吞噬活性的分析方法，用于評估化學或環(huán)境毒性。

5 FCM 在貝類DNA 含量和倍性分析中的應用

貝類多倍體育種具有十分重要的經(jīng)濟價值，用FCM 分析貝類的倍性起步較早[60,61]，技術已較為成熟，在此不再詳細敘述。國外學者對該方法有了新的應用——用于診斷貝類血瘤細胞的形成，認為散播性血瘤細胞的形成與多種貝類的大量死亡有關[62,63]。測定DNA 含量還可分析細胞周期和細胞凋亡。

6 展望

隨著新型多功能流式細胞儀以及新型特異探針的開發(fā)，F(xiàn)CM的功能將更為強大、數(shù)據(jù)更為精確、檢測指標也將不斷地擴充。FCM為貝類血細胞的研究提供了一條準確、快速的途徑，可望將進一步成為貝類血細胞研究中不可或缺的重要技術手段。