KLF9和KDM1A在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及意義

陳義 何堒 張偉 田曉金 李丹丹

神經(jīng)膠質(zhì)瘤約占所有原發(fā)性腦腫瘤的40%，起源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，美國每年約有13 000人死于該疾病[1,2]。探究神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制及其發(fā)生發(fā)展中的重要生物分子，對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的診斷和治療具有重要意義[3]。Krüppel樣因子9(Krüppel-like factor 9，KLF9)是KLF家族成員，含鋅指結(jié)構(gòu)，與真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控密切相關(guān)。研究證明，KLF9在體外抑制胚胎和RGC中的神經(jīng)突觸出生長(zhǎng)，且能夠促進(jìn)體內(nèi)軸突再生[4]。賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1(lysine-specific histone demethylase-1，KDM1A)能特異性的對(duì)單甲基化和二甲基化的H3K4脫甲基，在多種腫瘤中呈高表達(dá)，其高表達(dá)能促進(jìn)腫瘤發(fā)生[5]。研究表明，KDM1A過表達(dá)可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[6]。KLF9對(duì)神經(jīng)元生長(zhǎng)具有調(diào)節(jié)作用，KDM1A在多種腫瘤中發(fā)揮致癌作用，但二者在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的作用少見報(bào)道[7,8]。本研究將探討KLF9和KDM1A在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及意義，以期為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療提供幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年6月至2017年1月本院進(jìn)行手術(shù)切除63例神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者，術(shù)中取癌組織作為試驗(yàn)組，取其癌旁組織(距腫瘤邊緣>2 cm)作為對(duì)照組。其中男35例，女28例；年齡23～69歲，平均年齡(46.51±11.32)歲；腫瘤大小≤3 cm 30例，>3 cm 33例；Karnofsky(KPS)評(píng)分[9]>80分16例，≤80分47例。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)中樞系統(tǒng)腫瘤病理分型標(biāo)準(zhǔn)[10]分為：Ⅰ型21例，Ⅱ型17例，Ⅲ型10例，Ⅳ型15例。對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者進(jìn)行為期3年隨訪，通過電話或郵件方式定期記錄患者生存狀況，隨訪開始時(shí)間為術(shù)后第1天，截至2020年2月1日，存活24例，死亡39例，無失訪病例。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①病理確診為神經(jīng)膠質(zhì)瘤者；②術(shù)前未進(jìn)行放、化療者；③臨床資料完整者；④患者或家屬同意參加研究，簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤者；②合并心、肝、腎等疾病者；③非正常死亡者；④術(shù)后復(fù)發(fā)，再次手術(shù)者。

1.3 主要儀器與試劑 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)儀(型號(hào)：Step One Plus )購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；光學(xué)顯微鏡(型號(hào)：DM1000)購自德國徠卡公司；TRIzol Reagent總RNA提取試劑(批號(hào)：15596026)購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；通用RT-PCR試劑盒(M-mlV)(批號(hào)：RP1100)購自北京索萊寶科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime Script RT reagent Kit)(批號(hào)：RR037A)購自日本TaKaRa公司；EDTA修復(fù)液(批號(hào)108-367)購自北京百奧萊博科技有限公司；兔抗人KLF9多克隆抗體(批號(hào)：NBP1-88507)購自美國Novus Biologicals公司；兔抗人KDM1A/LSD1多克隆抗體(批號(hào)：ALS12973)購自上海煊翎生物科技有限公司；免疫組化試劑盒(通用型，批號(hào)：AAPR389-A100)購自廣州沛瑜生物制品有限公司。

1.4 研究方法

1.4.1 樣品采集:取患者術(shù)中癌組織作為試驗(yàn)組，取其癌旁組織作為對(duì)照組。將所有樣本分為兩份：一份用于制作石蠟切片，另一份用于提取RNA，-80℃冰箱保存。

1.4.2 qRT-PCR法測(cè)定神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中KLF9和KDM1A mRNA的表達(dá):-80℃取出樣本，提取總RNA：向樣本中加入1 ml TRIzol進(jìn)行裂解，按照TRIzol RNA提取步驟進(jìn)行操作，所得RNA溶于RNase Free H2O，檢測(cè)其純度及濃度，存于-80℃?zhèn)溆?；按照Prime Script RT reagent Kit說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，所得cDNA置于-20℃保存。qRT-PCR反應(yīng)(20 μl體系)：cDNA模板2 μl，2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，上下游引物各0.5 μl，dH2O 7 μl，每個(gè)樣品做3個(gè)平行。根據(jù)目的基因設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的引物，內(nèi)參為GAPDH。反應(yīng)條件：94℃ 30 s，95℃ 10 s、59℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)，在qRT-PCR儀上反應(yīng)。根據(jù)各樣本的平均Ct值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算 KLF9和KDM1A mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物由日本TaKaRa公司合成。見表1。

表1 KLF9和KDM1A及內(nèi)參基因GAPDH引物序列

1.4.3 免疫組化檢測(cè)神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中KLF9和KDM1A蛋白表達(dá)情況:石蠟切片脫蠟水化。微波抗原熱修復(fù)，室溫冷卻后，加3% H2O2孵育10 min，加EDTA修復(fù)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗5 min×3次，滴加一抗工作液，4℃過夜。PBS沖洗5 min×3次，加入二抗37℃孵育30 min，PBS沖洗5 min×3次。DBA顯色，顯色成功后，蒸餾水沖洗，蘇木素復(fù)染，乙醇脫水，透明處理，封片鏡檢。結(jié)果判定：細(xì)胞中存在棕色或棕黃色顆粒即為陽性細(xì)胞。隨機(jī)選取5個(gè)視野(×400)，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)率：1分為陽性細(xì)胞數(shù)≤10%，2分為11%～50%，3分為51%～80%，4分為81%～100%；根據(jù)著色強(qiáng)度：1分為淡黃色，2分為中棕黃色，3分為棕褐色；總分=陽性細(xì)胞率×著色強(qiáng)度，總分1～3分記為陰性，4～12分記為陽性。

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR 法測(cè)定組織中KLF9和KDM1A mRNA的表達(dá) 試驗(yàn)組KLF9 mRNA的表達(dá)量明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，KDM1A mRNA表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。見表2。

表2 2組KLF9和KDM1A mRNA表達(dá)情況比較

2.2 2組KLF9和KDM1A蛋白表達(dá)情況 試驗(yàn)組KLF9蛋白的陽性表達(dá)率明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，KDM1A蛋白陽性表達(dá)率明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。見表3。

表3 2組KLF9和KDM1A蛋白陽性表達(dá)率 n=63,例(%)

2.3 神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者癌組織中KLF9和KDM1A表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者癌組織中KLF9和KDM1A蛋白陽性率均與患者年齡、性別、腫瘤大小和KPS評(píng)分無關(guān)(P>0.05)，與病理分型有關(guān)(P<0.05)。見表4。

表4 神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者癌組織中KLF9和KDM1A表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 例(%)

2.4 神經(jīng)膠質(zhì)瘤癌組織中KLF9和KDM1A表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者隨訪36個(gè)月，生存24例，死亡39例。繪制神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者術(shù)后1～36個(gè)月KLF9陽性、陰性患者及KDM1A陽性、陰性患者生存曲線。KLF9陽性患者及陰性患者3年總生存率分別為85.71%(6/7)、32.14%(18/56)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。KDM1A陽性患者及陰性患者3年總生存率分別為27.08%(13/48)、73.33%(11/15)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、2。

圖1 神經(jīng)膠質(zhì)瘤癌組織中KLF9表達(dá)3年生存曲線

圖2 神經(jīng)膠質(zhì)瘤癌組織中KDM1A表達(dá)3年生存曲線

2.5 影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的因素分析 單因素分析顯示，KLF9表達(dá)是影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的保護(hù)因素，KDM1A表達(dá)和病理分型均是影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。多因素分析顯示，KLF9表達(dá)是影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素(HR=0.75，95%CI為0.64～0.87，P<0.05)，而KDM1A表達(dá)是影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(HR=2.56，95%CI為1.84～3.56，P<0.05)。見表5。

表5 影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的因素分析

3 討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見原發(fā)性腦腫瘤，根據(jù)膠質(zhì)細(xì)胞分為星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤和星形細(xì)胞加少突細(xì)胞混合膠質(zhì)瘤[11]。神經(jīng)膠質(zhì)瘤又可根據(jù)WHO分類標(biāo)準(zhǔn)分為：低度惡性組(WHO Ⅰ/Ⅱ)和高度惡性組(WHO Ⅲ/Ⅳ)，其中高度惡性膠質(zhì)瘤(Ⅲ/Ⅳ級(jí))5年病死率在腫瘤中位于第3位，僅次于胰腺癌和肺癌[12]。目前神經(jīng)膠質(zhì)瘤最有效的治療方式為手術(shù)切除和放療，但對(duì)于延長(zhǎng)患者生存期效果并不明顯[13,14]。因此，尋找有效生物靶點(diǎn)對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療至關(guān)重要。

KLF家族蛋白在哺乳動(dòng)物中高度保守，共17個(gè)成員，按照結(jié)構(gòu)同源性可分為：KLF Ⅰ家族、KLF Ⅱ家族和KLF Ⅲ家族[15]。KLF家族成員在分化、發(fā)育及惡性腫瘤發(fā)展的關(guān)鍵生物學(xué)過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[16]。KLF9屬于KLF Ⅲ家族，此家族成員與轉(zhuǎn)錄抑制物SIN3A相互作用，從而發(fā)揮抑制功能。Brown等[17]研究證明，在結(jié)直腸癌中KLF9 mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平下降，KLF9全部或部分喪失可促進(jìn)結(jié)腸腫瘤發(fā)生。Zhang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，KLF9在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中呈低表達(dá)，其低表達(dá)可促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，KLF9與miR-21啟動(dòng)子相互作用，能夠抑制miR-21表達(dá)并導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯。KDM1A是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的脫甲基酶，通過改變基因啟動(dòng)子上組蛋白表觀遺傳進(jìn)而調(diào)節(jié)基因表達(dá)程序。KDM1A對(duì)于維持人類胚胎干細(xì)胞未分化和調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化至關(guān)重要[19]。研究發(fā)現(xiàn)，KDM1A在結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)[20]。Sareddy等[21]研究表明，KDM1A在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中高表達(dá)，抑制其表達(dá)可降低膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的干性并誘導(dǎo)其分化和凋亡。

本研究檢測(cè)KLF9和KDM1A在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組KLF9 mRNA表達(dá)及蛋白陽性率均明顯低于對(duì)照組，試驗(yàn)組KDM1A mRNA表達(dá)及蛋白陽性率明顯高于對(duì)照組，此結(jié)果與Zhang等[18,21]研究結(jié)果類似，提示KLF9和KDM1A可能參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展；神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者癌組織中KLF9和KDM1A蛋白陽性率均與患者年齡、性別、腫瘤大小和KPS評(píng)分無關(guān)，與病理分型有關(guān)，提示KLF9和KDM1A表達(dá)可能會(huì)影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤的部分病程進(jìn)展；繪制神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者術(shù)后1-36個(gè)月生存曲線，發(fā)現(xiàn)KLF9陽性患者3年總生存率明顯高于KLF9陰性患者，KDM1A陽性患者3年總生存率明顯低于KDM1A陰性患者，提示KLF9陰性及KDM1A陽性表達(dá)均對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤起預(yù)后不良效果有關(guān)；Cox回歸分析顯示，KLF9表達(dá)是影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素，KDM1A表達(dá)是影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示上調(diào)KLF9表達(dá)或抑制KDM1A表達(dá)可能會(huì)提高神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后效果。

綜上所述，神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者癌組織中KLF9呈低表達(dá)，KDM1A呈高表達(dá)，二者的表達(dá)均與腫瘤病理分型有關(guān)，KLF9表達(dá)是影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素，KDM1A表達(dá)是影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，均與患者預(yù)后密切相關(guān)，有望成為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的潛在治療靶點(diǎn)。但本研究樣本量較少，或存在一定的局限性，日后將繼續(xù)擴(kuò)大樣本量，并探究KLF9和KDM1A成為神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療靶點(diǎn)的可行性。