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    人參皂苷Rh2調(diào)控盤狀結(jié)構(gòu)域受體1對糖尿病大鼠腎纖維化和細胞凋亡的影響

    2021-07-22 11:30:14沈炳香王法財何春遠趙為陳
    關(guān)鍵詞:批號纖維化試劑盒

    沈炳香,王法財,周 藝,李 婷,何春遠,趙為陳

    1安徽醫(yī)科大學(xué)附屬六安醫(yī)院藥學(xué)部,安徽 六安 237005;2中南大學(xué)湘雅藥學(xué)院藥理學(xué)系,湖南 長沙410078

    糖尿病腎病(DN)是糖尿病嚴重的微血管并發(fā)癥之一,占終末期腎?。‥SRD)約30%~47%[1],其10年死亡率是健康人群的6倍[2]。腎小管間質(zhì)纖維化以及高血糖引起的腎組織細胞凋亡是DN重要的病理基礎(chǔ)[3,4]。研究證實,高糖能夠誘導(dǎo)腎小管上皮細胞凋亡,導(dǎo)致尿蛋白產(chǎn)生、細胞外基質(zhì)的沉積以及腎小球硬化[5]。因此,探究DN 腎間質(zhì)纖維化以及細胞凋亡的發(fā)生機制及其藥物治療,對于防治DN具有重要意義。人參皂苷Rh2(G-Rh2)是從紅參中分離Rg3并經(jīng)人腸道菌轉(zhuǎn)化而得到的主要代謝產(chǎn)物,其具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤以及抑制纖維化等作用[6-7]。研究表明,在糖尿病大鼠心肌纖維化模型中,G-Rh2能夠通過調(diào)控PPARδ-STAT3信號,降低心肌膠原沉積,改善糖尿病心肌纖維化[8]。本實驗前期研究發(fā)現(xiàn),在DN大鼠模型中,G-Rh2能夠通過抑制Caspase-1介導(dǎo)的細胞焦亡,改善DN腎損傷[9]。以上研究表明G-Rh2在糖尿病血管病變中發(fā)揮重要作用,但是有關(guān)其對DN腎纖維化和細胞凋亡的影響及作用機制尚不清楚。

    盤狀結(jié)構(gòu)域受體1(DDR1)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型酪氨酸蛋白激酶受體,參與包括細胞凋亡,增殖,遷移以及組織炎癥和纖維化等[10]。以往文獻顯示,DDR1在多種組織和器官中廣泛表達,尤其是肺、脾、腎和小腸組織[11]。DDR1能夠通過膠原基質(zhì)調(diào)節(jié)人肺成纖維細胞遷移,促進成纖維細胞穿越基底膜屏障[12]。在博來霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化模型中,組織學(xué)檢測DDR1表達上調(diào)[13]。另外,在腎小管上皮細胞中敲除DDR1基因可以延緩遺傳性Ⅳ膠原疾病腎纖維化[10]。在高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞凋亡中DDR1表達上調(diào),抑制DDR1能夠降低高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞凋亡[14]。以上研究表明DDR1在纖維化和細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。但是有關(guān)DDR1在糖尿病腎病腎纖維化和細胞凋亡中作用尚不清楚。因此,本研究擬通過構(gòu)建DN大鼠模型,探究G-Rh2能否通過調(diào)控DDR1抑制腎纖維化和細胞凋亡,以期為DN治療提供新的思路。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 實驗動物 雄性,SPF級,6~8周齡,體質(zhì)量180~200 g的SD大鼠,購買自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院實驗動物學(xué)部(許可證:SCXK(湘)2017-0006)。

    1.1.2 實驗藥物與主要試劑 人參皂苷Rh2(上海順勃生物工程技術(shù)有限公司,純度≥98,批號:112246-15-8);鏈脲佐菌素(STZ)(Sigma-Aldrich,批號:V900890);胰島素測定試劑盒(上海酶聯(lián)科技生物有限公司,批號:ml064302);蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(碧云天生物技術(shù),批號:C0105S);過碘酸-雪夫(PAS)染色試劑盒(碧云天生物技術(shù),批號:C0142S);馬松(Masson)染色試劑盒(Sigma-Aldrich,批號:1.00485);TUNEL染色試劑盒(碧云天生物技術(shù),批號:C1098);兔SP免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)公司,批號:SP-9001);CollagenI 兔單克隆抗體(Abcam,批號:ab260043);CollagenIII 兔多克隆抗體(Abcam,批號:ab7778);Caspase-3兔單克隆抗體(Abcam,批號:ab32351);Bcl-2兔多克隆抗體(碧云天生物技術(shù),批號:AF0060);DDR1兔單克隆抗體(Cell Signaling Technology,批號:3917);β-actin 小鼠單克隆抗體(碧云天生物技術(shù),批號:AF5001);辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔(碧云天生物技術(shù),批號:A0208);辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠(碧云天生物技術(shù),批號:A0216)。

    1.1.3 儀器 血糖儀器(長沙三諾生物傳感技術(shù)有限公司);熒光倒置顯微鏡(日本尼康);組織勻漿儀(武漢微塞爾生物科技有限公司);酶標(biāo)儀(北京普朗醫(yī)療公司);高速冷凍離心機(Beckman-Coulter);ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)(Bio-Rad)。

    1.2 方法

    1.2.1 動物建模與給藥 實驗SD大鼠隨機分為對照組、糖尿病腎病組(DN)、人參皂苷Rh2 藥物干預(yù)組(GRh2),每組各10只,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。DN和G-Rh2藥物干預(yù)組大鼠腹腔注射STZ(60 mg/kg)構(gòu)建糖尿病模型,連續(xù)3 d血糖值≥16.7 mmol/L視為造模成功,成功造模7 d后進行尿蛋白定性檢測,尿蛋白為陽性為DN模型構(gòu)建成功[9]。對照組大鼠給予注射等量的檸檬酸緩沖溶液。在DN大鼠造模成功的第2 d,G-Rh2組大鼠灌胃G-Rh2(20 mg·kg-1·d-1),連續(xù)用藥12周,DN組和對照組灌胃等量的生理鹽水。

    1.2.2 大鼠相關(guān)指標(biāo)檢測(1)血糖:大鼠尾靜脈取血,血糖儀檢測血糖值;(2)胰島素:大鼠心臟取血,4 ℃,3000 r/min,離心10 min分離血漿,胰島素試劑盒檢測其含量;(3)肌酐、尿素氮、尿蛋白:采用全自動生化分析儀,并按照南京建成生物公司試劑盒說明書進行檢測。

    1.2.3 腎臟組織病理取材 G-Rh2藥物灌胃處理12 周,大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉,仰臥位固定大鼠,打開胸腔,待心臟取血完成后剪開左心耳,4%的多聚甲醛持續(xù)灌流直至心臟、肺呈現(xiàn)乳白色,利用手術(shù)鑷和手術(shù)剪刀剝離周圍結(jié)締組織摘取大鼠左腎并采用生理鹽水清洗血漬,最后放置于液氮罐內(nèi)保存留存。

    1.2.4 大鼠腎組織形態(tài)學(xué)觀察 4%的多聚甲醛固定大鼠腎組織,石蠟切片厚度約5 μm,行HE、PAS和Masson染色,于200倍顯微鏡下觀察各組大鼠腎組織形態(tài)學(xué)。Masson染色觀察膠原顯示藍色。

    1.2.5 TUNEL染色 大鼠腎組織經(jīng)石蠟切片、常規(guī)脫水,按照試劑盒說明書行TUNEL組織熒光染色。光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織細胞凋亡情況,凋亡細胞呈熒光綠色。于400倍顯微鏡下隨機性選取6個視野(視野下需包含腎小球結(jié)構(gòu))。細胞凋亡指數(shù)(%)=熒光綠色細胞凋亡數(shù)目/藍色細胞核細胞總數(shù)目×100%。

    1.2.6 免疫組織化學(xué) 大鼠腎組織經(jīng)石蠟切片、常規(guī)脫水,按照兔SP免疫組化試劑盒行免疫組化染色,DAB顯色。于200倍顯微鏡下觀察DDR1表達與分布,組織中DDR1著色呈棕褐色。

    1.2.7 蛋白質(zhì)免疫印跡 提取腎組織總蛋白并測定其濃度,取40 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳,將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上,5%的脫脂牛奶封閉非特異性位點2 h;4 ℃條件下,孵育CollagenI兔單克隆抗體(1∶1000),CollagenIII兔多克隆抗體(1∶1000),Caspase-3兔單克隆抗體(1:1000),Bcl-2兔多克隆抗體(1∶1000),DDR1兔單克隆抗體(1∶1000)和β-actin小鼠單克隆抗體(1∶5000)16 h;TBST清洗3次,5 min/次;室溫條件下,孵育辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔(1∶5000)或者辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠(1∶5000)1 h;TBST清洗3次,5 min/次;發(fā)光試劑顯影,ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)拍照并進行目的蛋白表達分析。目的蛋白表達水平以目的條帶灰度值比β-actin條帶灰度值表示。

    1.2.8 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進行分析,定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組均數(shù)比較采用方差齊性檢驗和單因素方差分析,以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 G-Rh2對DN大鼠生化指標(biāo)的影響

    與對照組相比,DN組大鼠血糖、尿蛋白、肌酐和尿素氮水平明顯升高(P<0.01),胰島素水平明顯降低(P<0.01)。與DN組相比,G-Rh2組大鼠血糖、尿蛋白、肌酐和尿素氮水平降低(P<0.01),胰島素水平升高(P<0.01,表1)。

    表1 各組大鼠血糖、胰島素、肌酐、尿素氮和尿蛋白水平比較Tab.1 Blood glucose,insulin,creatinine,urea nitrogen and urinary proteins levels in each group(n=6,Mean±SD)

    2.2 G-Rh2對DN大鼠腎纖維化的影響

    HE染色和PAS染色顯示,對照組大鼠腎組織腎小球結(jié)構(gòu)完整,清晰、腎小管上皮細胞排列規(guī)則;DN組大鼠腎組織腎小球體積增大且基底膜增厚,腎小管結(jié)構(gòu)紊亂,且部分空泡變性,有典型的病理學(xué)改變;G-Rh2組大鼠腎組織上述病變減輕。Masson染色顯示,與對照組相比,DN組和G-Rh2組膠原沉積增多;與DN組相比,G-Rh2組膠原沉積減少(圖1)。Western blot顯示,與對照組相比,DN 組CollagenI、CollagenIII 表達上調(diào)(P<0.01);與DN組相比,G-Rh2組CollagenI、CollagenIII表達下調(diào)(P<0.05或P<0.01,圖2)。

    圖1 各組大鼠腎組織形態(tài)學(xué)變化和纖維化程度Fig.1 Hisotological changes and degree of fibrosis in the kidney tissue of the rats in each group.

    圖2 各組大鼠腎組織Collagen I和Collagen III表達Fig.2 Expression of collagen I and collagen III in the kidney tissue of the rats in each group.**P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs DN group.A:Western blotting of collagen I and collagen III expressions;B:Quantitative analysis of the results.

    2.3 G-Rh2對DN大鼠細胞凋亡的影響

    TUNEL染色顯示,與對照組相比,DN組細胞凋亡指數(shù)增加(P<0.01);與DN組相比,G-Rh2組細胞凋亡指數(shù)顯著降低(P<0.01,圖3)。Western blot檢測顯示,與對照組相比,DN組Cleaved-caspase-3表達上調(diào),Bcl-2表達下調(diào)(P<0.01);與DN 組相比,人參皂苷Rh2 組Cleaved-caspase-3表達降低(P<0.05),Bcl-2表達升高(P<0.05,圖4)。

    圖3 TUNEL染色觀察大鼠腎組織凋亡情況Fig.3 TUNEL staining for observing renal cell apoptosis of the rats.**P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs DN group.A:TUNEL staining of the renal tissue.B:Quantitative analysis of the results.

    圖4 各組大鼠腎組織Cleaved-caspase-3和Bcl-2表達Fig.4 Expression of cleaved caspase-3 and Bcl-2 in the kidney tissue of the rats in each group.**P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs DN group.A:Western blotting of the expressions of cleaved caspase-3 and Bcl-2 proteins.B:Quantitative analysis of the results.

    2.4 G-Rh2對DN大鼠DDR1表達的影響

    Western blot檢測顯示,與對照組相比,DN組腎組織DDR1表達明顯上調(diào)(P<0.01);與DN組相比,G-Rh2組DDR1 表達顯著降低(P<0.01)。免疫組化檢測,DDR1在腎小管細胞中呈現(xiàn)高表達,與對照組相比,DN組和G-Rh2 組腎組織DDR1 表達增加,但G-Rh2 組DDR1表達低于DN組(圖5)。

    圖5 各組大鼠腎組織DDR1表達Fig.5 DDR1 expression in the kidney tissue of the rats in each group.**P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs DN group.A:Western blotting for detecting DDR1 expression.B:Quantitative analysis of the results.C:Representative results of immunohistochemical staining for detecting DDR1 expression in the 3 groups.

    3 討論

    血糖異常升高被認為是DN發(fā)病的基礎(chǔ),高血糖可以通過多種基質(zhì)損傷腎小管上皮細胞,主要包括炎癥風(fēng)暴,氧化應(yīng)激,細胞凋亡以及纖維化等。其中腎細胞凋亡以及腎間質(zhì)纖維化已經(jīng)成為DN的主要病理特征[15,16]。研究表明,細胞凋亡能夠?qū)е履I細胞外基質(zhì)沉積、腎小管上皮細胞肥大以及腎小球膜擴張,進而導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維化和腎小球硬化[17,18]。另外,腎纖維化作為糖尿病腎損傷的重要環(huán)節(jié),其可以引起ESRD[19,20]。臨床研究證實,通過有效控制血糖以及血壓能夠改善DN患者的病癥[21-23]。然而,目前臨床上主要以血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑和血管緊張素受體阻斷劑藥物治療DN,但是單一藥物治療只能針對DN某個特定病因,長期服用具有一定的毒副作用[9]。因此,探尋中藥活性單體對于治療DN尤為重要。

    G-Rh2 在腫瘤,心血管,神經(jīng)系統(tǒng)中均被廣泛研究。研究表明G-Rh2能夠調(diào)控氧化應(yīng)激,細胞凋亡以及纖維化等途徑發(fā)揮心血管疾病的治療作用[7-9]。本研究首先探究G-Rh2對DN大鼠的治療作用。結(jié)果顯示,與DN組相比,G-Rh2能夠有效降低DN大鼠血糖、尿蛋白、肌酐和尿素氮。初步表明G-Rh2對DN具有治療作用。既往研究證實,在DN大鼠模型中,G-Rh2能夠通過調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶表達,緩解DN腎損傷[24]。另外,在70%胰腺部分切除型成年C57BL/6J小鼠中,G-Rh2能夠通過調(diào)控Akt/Foxo1/PDX-1信號,抑制胰島β細胞凋亡,促進細胞增殖,進而降低血糖,改善小鼠葡萄糖耐受量[25]。以上研究均表明G-Rh2在糖尿病中具有一定的治療潛力。本研究通過DN大鼠給予G-Rh2灌胃處理12周,探究G-Rh2能否通過抑制DN腎纖維化和細胞凋亡,改善DN 腎損傷。結(jié)果顯示,與DN 組相比,GRh2組大鼠腎病理損傷減輕,膠原沉積減少,腎組織細胞凋亡降低。進一步Western blot檢測顯示,與DN腎病組相比,G-Rh2組大鼠腎組織CollagenI、CollagenIII以及Cleaved-caspase-3均表達下調(diào),Bcl-2表達上調(diào)。以上研究結(jié)果表明G-Rh2能夠通過抑制腎組織細胞凋亡和纖維化進而改善DN腎損傷。那么有關(guān)G-Rh2對DN 腎纖維化和細胞凋亡的調(diào)控機制又是如何呢?DDR1是與細胞凋亡和纖維化密切相關(guān)的受體酪氨酸蛋白激酶家族蛋白成員之一[26]。既往研究發(fā)現(xiàn)在單側(cè)輸尿管梗阻的大鼠腎纖維化模型中,抑制DDR1能夠降低炎癥細胞遷移進而阻止纖維化進程[27]。另外,DDR1基因缺失小鼠能夠免受血管緊張素II介導(dǎo)的蛋白尿和腎小球纖維化[28]。新近研究也證實抑制DDR1能夠降低高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞凋亡[14]。以往研究表明抑制DDR1可能成為防治纖維化和細胞凋亡的重要途徑[10,11]。因此,本研究進一步檢測G-Rh2對DN腎組織DDR1表達的影響。結(jié)果顯示,與對照組相比,DN組DDR1表達上調(diào);與DN組相比,G-Rh2組DDR1表達下調(diào)。本研究結(jié)果表明G-Rh2抗DN腎纖維化和細胞凋亡可能與下調(diào)DDR1表達相關(guān)。以往文獻研究證實DDR1可以通過PI3K、Rac1和c-Jun等信號促進膠原蛋白合成,誘導(dǎo)纖維化[28]。另外,DDR1亦可以通過Notch1、Hes、Jak2信號調(diào)控細胞凋亡和增殖[29-30]。但是本研究僅僅從動物實驗上初步揭示G-Rh2可能通過下調(diào)DDR1,抑制DN腎纖維化和細胞凋亡,緩解DN腎損傷。因此,在后續(xù)的實驗研究中擬從細胞水平探究G-Rh2調(diào)控DDR1抑制腎纖維化和細胞凋亡的分子機制。既往研究顯示在低氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞損傷模型中,HMGB1能夠通過調(diào)控DDR1,抑制mTOR磷酸化,促進Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ,降低p62的表達,誘導(dǎo)自噬[31]。另外,體內(nèi)外實驗也證實抑制DDR1表達能夠增強自噬水平進而減輕骨關(guān)節(jié)炎[32]。而自噬是細胞將自身受損的細胞器或錯誤折疊的蛋白質(zhì)包裹、吞噬、并運輸?shù)饺苊阁w進行降解,實現(xiàn)自身物質(zhì)代謝更新,能量再循環(huán)利用的生物學(xué)過程。因此,在激活自噬的同時也會增強溶酶體功能,這與本課題組前期研究證實G-Rh2 可以通過增強cathepsin B 和cathepsin L活性,改善溶酶體功能,從而發(fā)揮DN保護作用一致[9]。上述研究提示:G-Rh2極有可能通過調(diào)控DDR1,改善溶酶體功能,并最終抑制DN腎纖維化和細胞凋亡。

    綜上所述,本研究通過構(gòu)建DN模型探究G-Rh2對腎纖維化和細胞凋亡的影響。結(jié)果顯示G-Rh2能夠通過下調(diào)DDR1,抑制腎纖維化和細胞凋亡,緩解DN腎損傷。以上研究結(jié)果初步證實了G-Rh2在DN中的治療作用,為后期臨床應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。

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