2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷可減輕脂多糖誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷

陳加寶，劉 華

廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，廣東 廣州510030

急性肺損傷（ALI）是由于各種肺內(nèi)外非心源性致病因素引起的進(jìn)行性缺氧性呼吸衰竭，其病理表現(xiàn)為肺泡炎癥性滲出、肺血管通透性增加引起肺水腫，進(jìn)而導(dǎo)致氣體交換障礙且急性惡化，是臨床上致死率極高的難治性危急重癥，其發(fā)病率和死亡率一直居高不下［1,2］。目前，臨床上主要治療手段包括藥物治療和機械通氣等綜合措施［3］。單純使用保護(hù)性機械通氣治療雖能起到一定的肺保護(hù)作用，但未能有效降低患者的死亡率［4,5］。藥物治療作為對ALI患者采用的一種綜合性治療手段目前已經(jīng)取得了良好的理論支持和前期研究基礎(chǔ)［6,7］，早期進(jìn)行有效的藥物治療性干預(yù)，減少呼吸機的依賴是優(yōu)化生存的關(guān)鍵和挑戰(zhàn)。因此，迫切需要進(jìn)一步研究探求治療ALI的新藥物，以為臨床綜合性治療提供多樣化的藥物選擇，進(jìn)而減少呼吸機依賴。

炎癥反應(yīng)在ALI的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活炎性細(xì)胞并大量釋放炎性細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β和IL-6等［8］，引起肺組織出血、水腫及大量中性粒細(xì)胞浸潤。因此，抑制ALI所致炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生與發(fā)展可能是ALI治療研究的關(guān)鍵點。二苯乙烯苷（TSG），化學(xué)名2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，是中藥何首烏的主要活性成分，該化合物具有多種生物活性和藥用價值，已被證實在腸道炎癥、肝炎、心肌纖維化、血管性癡呆等防治中顯出良好的抗炎、抗氧化效果［9,10］。除此之外，還具有抗骨質(zhì)疏松、降血脂、抗腫瘤等作用［11,12］。因此，TSG在ALI治療上或許也能發(fā)揮出意想不到的抗炎效果。另外，NF-κB信號通路在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的ALI炎癥級聯(lián)反應(yīng)過程中被激活，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并參與肺組織炎癥的過程，阻礙NF-κB信號通路有助于減輕ALI［13］。例如，特異性干擾劑siRNA通過抑制NF-κB 通路降低NF-κB p65蛋白的表達(dá)從而抑制膿毒癥早期炎癥反應(yīng)，有效減輕ALI［14］。NF-κB抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸酯（PDTC）也被證明可逆轉(zhuǎn)NF-κB通路，從而改善ALI的炎癥損害［15］。而據(jù)研究，TSG可通過阻礙核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 的表達(dá)抑制多種組織細(xì)胞炎癥反應(yīng)的發(fā)生［16,17］。目前在ALI治療中，尚未有TSG與NF-κB信號通路的提及,或許TSG亦可通過阻礙NF-κB信號通路從而起到治療ALI的作用。研究TSG對ALI的治療效果有望為臨床綜合性治療提供多樣化的藥物選擇，減少呼吸機依賴。因此，本研究通過尾靜脈注射LPS建立大鼠ALI模型，觀察TSG抗炎及抗氧化療效，探討其相關(guān)可能機制，為臨床有效治療ALI提供一種新的藥物備選方法。

1 材料和方法

1.1 動物

雄性SD 大鼠，體質(zhì)量180～220 g，購于南方醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，合格證號SCXK（粵）2016-0041。飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～25 ℃，相對濕度40%～70%，自由飲水，食物充足供應(yīng)，12 h 晝夜交替照明。本實驗符合動物倫理委員會要求。

1.2 藥物與試劑

TSG（春秋生物，純度98%），脂多糖（LPS，Sigma），大鼠TNF-α、IL-6ELISA試劑盒（博士德生物），超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）測試盒（建成生物），GAPDH抗體（Abcam），NF-KB p65兔單克隆抗體、辣根標(biāo)記羊抗兔IgG抗體（Bioworld）。

1.3 儀器

AB204-N 萬分之一精密分析天平（Mettler Toledo），3K15高速冷凍離心機（Sigma），Varioskan全波長酶標(biāo)儀（Thermo Fisher scientific），PowerPAC200電泳儀（Bio-Rad）。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物造模及分組 將36只健康雄性SD大鼠隨機分為正常對照組、LPS組、TSG低劑量組、TSG高劑量組，每組9只。TSG低劑量組及高劑量組分別予TSG 50 mg/（kg·d）和100 mg/（kg·d）連續(xù)灌胃1周，給藥容量為每100 g大鼠1 mL，正常組、LPS組予同等劑量的蒸餾水。末次給藥0.5 h后，LPS組、TSG低劑量組和TSG高劑量組尾靜脈注射LPS（5 mg/kg），正常組注射等量的生理鹽水，6 h后處死大鼠。

1.4.2 肺組織病理形態(tài)學(xué) 取右上肺組織，4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片（5μm），HE染色。顯微鏡下觀察肺組織形態(tài)學(xué)改變并進(jìn)行病理損傷評分［18］。

1.4.3 肺組織濕/干質(zhì)量比（W/D）測定 麻醉處死大鼠，取右肺副葉、下葉，用濾紙吸干表面水分后稱其質(zhì)量，即為濕質(zhì)量（W）；將上述肺組織置于60 ℃恒溫烤箱中，干燥48 h，再次稱其質(zhì)量得干質(zhì)量（D）。計算肺濕/干質(zhì)量的比值（W/D）。

1.4.4 肺組織SOD活性和MDA含量的測定 另取大鼠右中肺組織，4 ℃下用電動勻漿器制成10%肺組織勻漿，離心（3000 r/min）10 min后取上清，檢測肺組織SOD活性和MDA含量。按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4.5 血清中炎癥因子TNF-α、IL-6濃度的檢測 經(jīng)腹主動脈采血5 mL，離心（4 ℃，3000 r/min）10 min后取上清。采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA法）測定血清中TNF-α、IL-6的濃度變化。按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4.6 Western blot檢測肺組織中NF-κB p65蛋白表達(dá)于研磨后的肺組織加入RIPA 裂解液，提取總蛋白。BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度后，加入上樣緩沖液loading buffer，10%SDS-PAGE凝膠電泳分離，半干轉(zhuǎn)膜法將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。牛奶室溫封閉2 h，用NF-KB p65兔單克隆抗體（稀釋比例為1∶2000）孵育，4 ℃過夜；用辣根標(biāo)記羊抗兔IgG抗體（稀釋比例為1∶40 000）37 ℃孵育2 h，曝光顯色，以GAPDH為內(nèi)參照。

1.4.7 統(tǒng)計學(xué)方法 所有實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件對資料進(jìn)行統(tǒng)計分析，組間比較采用單因素方差分析，方差齊則采用LSD 檢驗，方差不齊則采用Games-Howell檢驗。當(dāng)P＜0.05 時認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)變化及評分

正常組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯病理性變化。LPS組可見肺泡間隔增厚，間質(zhì)充血水腫，炎性細(xì)胞浸潤。而TSG組肺損傷表現(xiàn)明顯減輕（圖1）。與對照組相比，LPS組病理評分升高（P＜0.001），而TSG組病理評分顯著低于LPS組（P＜0.001，圖2）。

2.2 各組大鼠肺組織濕/干質(zhì)量比值（W/D）

與正常對照組相比，LPS組大鼠肺濕/干質(zhì)量比值顯著升高（P＜0.001），TSG低、高劑量組可顯著降低肺濕/干質(zhì)量比值（P＜0.001，圖3）。

圖3 各組大鼠肺組織濕/干質(zhì)量比值比較Fig.3 Wet-to-dry ratio of the lung tissue in each group.*P＜0.001 vs control,#P＜0.001 vs LPS group.

2.3 TSG對ALI大鼠肺組織SOD活性和MDA含量的影響

與正常對照組比較，LPS組肺組織中SOD活性明顯降低（P＜0.001）；與LPS組比較，TSG低劑量組與TSG高劑量組SOD活性均明顯升高（P＜0.001），但仍低于正常對照組（P＜0.001，圖4）。與正常對照組比較，LPS組肺組織中MDA含量明顯升高（P＜0.001）；與LPS組比較，TSG低劑量組與TSG高劑量組MDA含量均明顯降低（P＜0.001），但仍高于正常對照組（P＜0.001，圖4）。

圖4 各組大鼠肺組織MDA、SOD水平比較Fig.4 MDAand SOD levels in the lung tissue in each group.*P＜0.001 vs control,#P＜0.001 vs LPS group.

2.4 TSG對ALI大鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-6的影響

與正常對照組比較，LPS組大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-6的濃度顯著升高（P＜0.001，圖5）。與LPS組比較，TSG低劑量組和TSG高劑量組TNF-α、IL-6的濃度均顯著降低（P＜0.001，圖5）。

圖5 各組大鼠血清炎癥因子水平比較Fig.5 Serum levels of inflammatory factors in each group.*P＜0.001 vs control,#P＜0.001 vs LPS group.

2.5 TSG對ALI大鼠肺組織中NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響

與正常對照組比較，LPS組大鼠肺組織中NF-κB p65蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.001，圖6）。與LPS組比較，TSG低劑量組和TSG高劑量組中NF-κB p65蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.001，圖6）。

圖6 各組大鼠肺組織NF-κB p65蛋白的表達(dá)差異Fig.6 Expression level of NF-κB p65 protein in the lung tissue in each group.A:Western blots of NF-κB p65.B:Quantitative analysis of the gray value of NF-κB p65 protein.*P＜0.001 vs control,#P＜0.001 vs LPS group.

3 討論

ALI在臨床上病死率一直居高不下，很大一部分原因是缺乏根本有效的治療手段，對于尋找ALI新的治療手段問題仍然很嚴(yán)峻。各學(xué)者經(jīng)過多年的研究針對該病也制作了不同的動物模型，目前常用的方法是通過LPS誘導(dǎo)建立大鼠急性肺損傷模型，LPS是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，通過產(chǎn)生大量促炎性細(xì)胞因子、趨化因子，使炎癥細(xì)胞浸潤，引起肺泡毛細(xì)血管損傷，導(dǎo)致急性肺水腫的形成［19］。TSG具有抗細(xì)胞凋亡及纖維化作用，它可減低血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化程度及心肌組織Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白、纖維連接蛋白和PAI-1的表達(dá)，且能抵抗多柔比星所致的心肌細(xì)胞凋亡［20,21］。本實驗通過LPS復(fù)制大鼠急性肺損傷模型可看出大鼠肺組織出現(xiàn)了明顯肺水腫，而從各組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)變化及評分可看出TSG組肺病理損傷表現(xiàn)明顯減輕，其通過抑制肺組織細(xì)胞凋亡、水腫及間質(zhì)纖維化緩解了ALI所致的病理損傷。這說明TSG可有效減輕LPS引起的肺組織充血、水腫及細(xì)胞凋亡，抑制肺間質(zhì)纖維化形成。

在對OVA致敏的哮喘氣道炎癥上TSG表現(xiàn)出明顯的抗炎作用，可有效減少肺內(nèi)炎性細(xì)胞聚集和黏液高分泌［22］。此外，TSG顯著減弱了LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞的激活和促炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的分泌［23］。促炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6可刺激肺巨噬細(xì)胞和呼吸道上皮細(xì)胞釋放趨化因子，誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞表達(dá)黏附因子，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)［24］。TNF-α和IL-6還可誘導(dǎo)其他細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)并激活NF-κB信號通路，使炎癥反應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)展［25］。NF-κB是一種廣泛表達(dá)的核轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)炎癥、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和腫瘤增殖及轉(zhuǎn)移等多種生理病理過程起著重要作用。NF-κB信號通路在ALI的炎癥過程中起關(guān)鍵作用，抑制NF-κB信號通路可大大降低ALI炎癥的嚴(yán)重程度［13］。如特異性干擾劑siRNA、NF-κB抑制劑PDTC均被證實通過抑制NFκB 通路降低NF-κB p65蛋白的表達(dá)從而抑制炎癥反應(yīng)，有效減輕ALI［14,15］。TSG可阻礙NF-κB信號通路的激活，抑制多種炎癥反應(yīng)的發(fā)生。在非酒精性脂肪肝中，TSG可通過阻礙NF-κB信號通路逆轉(zhuǎn)高脂飲食引起的非酒精性脂肪肝，減輕慢性低度炎癥反應(yīng)［16］。在牙齦卟啉單胞菌刺激誘導(dǎo)的人牙齦成纖維細(xì)胞炎癥反應(yīng)中，TSG通過抑制牙齦細(xì)胞NF-κB信號通路激活，改善牙周炎的發(fā)展過程［17］。此外，也有研究證明TSG可通過抑制LPS刺激下顯著激活增加的NF-κB從而減輕小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，降低炎癥因子TNF-α、IL-6的表達(dá)［26］。本研究結(jié)果顯示通過TSG治療干預(yù)可顯效抑制ALI大鼠肺組織中NF-κB p65蛋白水平的表達(dá)，其炎癥因子TNF-α和IL-6水平也明顯降低，說明TSG能夠通過抑制NF-κB信號通路從而改善LPS所致的急性肺損害，降低炎癥因子，抑制炎癥反應(yīng)。

氧化應(yīng)激在ALI的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，可增強促炎因子的表達(dá)，且炎癥細(xì)胞可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧過度生成，形成惡性循環(huán)，促進(jìn)ALI的發(fā)生和發(fā)展［27］。因此，抗氧化應(yīng)激或許可以緩解ALI所造成的肺損傷。據(jù)報道，TSG可保護(hù)小鼠耳蝸UB/OC-2細(xì)胞，減輕氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡［28］。同時，TSG可通過抑制氧化損傷對MC3T3-E1成骨細(xì)胞進(jìn)行有效保護(hù)，從而改善骨質(zhì)疏松［29］。另外，TSG還可通過增強糖尿病大鼠SOD活性、引發(fā)MDA水平降低的抗氧化應(yīng)激作用使糖尿病腎病程度明顯降低［30］。MDA是生物膜上不飽和脂肪酸受自由基攻擊發(fā)生脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，它與體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度和自由基損傷水平呈正相關(guān)［31］。而過度氧化會降低SOD活性，SOD為體內(nèi)抗氧化物質(zhì)，是清除氧自由基的重要酶系，可阻止氧化應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)一步擴大，其活性降低使過氧化反應(yīng)增強，氧化損傷不斷惡化［32］。通過本次研究顯示，TSG可使MDA水平顯著降低，并改善了SOD活性，以此說明TSG能夠減輕由LPS引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)所致的肺組織損傷。

綜上所述，本次研究證明，TSG可減輕LPS引起的肺組織充血、水腫及細(xì)胞凋亡，抑制肺組織纖維化。同時，TSG可以改善由LPS引起的氧化應(yīng)激所致的肺組織損傷。此外，TSG可通過抑制ALI大鼠肺組織中NF-κB信號通路的表達(dá)，降低其炎癥因子TNF-α和IL-6的產(chǎn)生，以此減輕LPS所致的肺損傷。由此證實TSG可減輕脂多糖誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷，其保護(hù)作用可能與抑制NF-κB通路的激活，降低NF-κB p65蛋白的表達(dá)，提高抗氧化能力，減少炎癥因子的釋放有關(guān)。然而，本實驗低劑量TSG和高劑量TSG并未對炎癥反應(yīng)的緩解能力表現(xiàn)出明顯差異性，其治療的最佳劑量仍有待進(jìn)一步研究。