抑制線粒體活性氧自由基可減輕高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞焦亡和鐵死亡

王佳慧，梁 歡，方 典，黃毓慧，苗雅瓊，于 影，高 琴

蚌埠醫(yī)學(xué)院1生理學(xué)教研室，2心腦血管疾病基礎(chǔ)與臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 蚌埠233000

糖尿病心肌病（DCM）是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，其主要特征是心臟結(jié)構(gòu)和功能受損，可能導(dǎo)致心力衰竭，細(xì)胞死亡被認(rèn)為是DCM期間心肌細(xì)胞的終末途徑。線粒體來源的活性氧自由基（ROS）在調(diào)節(jié)細(xì)胞生理功能中發(fā)揮重要作用，但在糖尿病狀態(tài)下，高血糖、胰島素抵抗、游離脂肪酸水平升高等代謝改變導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)線粒體ROS累積，細(xì)胞線粒體功能障礙，炎癥反應(yīng)增多，糖基化終末產(chǎn)物形成，引起成纖維細(xì)胞的纖維化［1］或心肌細(xì)胞焦亡、鐵死亡等，最終導(dǎo)致心臟功能障礙，參與DCM的發(fā)病機(jī)制［2,3］。Nod樣受體蛋白3（NLRP3）炎癥小體是機(jī)體固有免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分，可以通過產(chǎn)生炎癥因子引起炎癥反應(yīng)，與許多炎癥性疾病密切相關(guān)［4］，其在DCM等心血管疾病中也發(fā)揮重要作用［5,6］。NLRP3 可被線粒體ROS 激活，形成NLRP3-ASC-pro-caspase-1炎癥小體復(fù)合物，活化的caspase-1切割焦亡效應(yīng)物Gasdermin D（GSDMD）蛋白，誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡發(fā)生［7］，因此抑制線粒體ROS和NLRP3炎癥小體生成，減少心肌細(xì)胞焦亡，可能對(duì)DCM心肌損傷具有重要的保護(hù)意義。鐵死亡是另一種與氧化應(yīng)激密切相關(guān)并以ROS的產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化為特征的程序性細(xì)胞死亡方式。線粒體通過調(diào)控鐵、氧化應(yīng)激、脂質(zhì)和能量代謝等過程參與調(diào)控鐵死亡的發(fā)生［8］，鐵死亡抑制劑減輕棕櫚酸誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞和原代新生大鼠心肌細(xì)胞損傷［9］，抑制鐵死亡可能是減輕心肌細(xì)胞損傷的重要靶點(diǎn)。

高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激直接參與細(xì)胞焦亡、鐵死亡等，針對(duì)線粒體的抗氧化干預(yù)成為減輕糖尿病心肌死亡的重要環(huán)節(jié)之一。但線粒體內(nèi)膜高度不透水，并具有很強(qiáng)的負(fù)電位，傳統(tǒng)抗氧化劑由于對(duì)線粒體內(nèi)部的低滲透性，其對(duì)抗線粒體氧化應(yīng)激的效果不理想。米托醌（MitoQ）是一種泛醌與親脂性陽離子三苯基磷（TPP）共價(jià)結(jié)合后的衍生物，特異性靶向線粒體對(duì)抗氧化反應(yīng)［10］。MitoQ因具備特異性、脂溶性、滲透性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，阻斷線粒體活性氧的生成和防止線粒體氧化損傷作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于其他抗氧化劑。有文獻(xiàn)報(bào)道，MitoQ可以通過減少過氧化氫形成，改善線粒體的呼吸和通透性轉(zhuǎn)化孔功能，抑制TGF-β1-NOX4-ROS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等改善壓力超負(fù)荷所致的心力衰竭和心臟纖維化［11,12］；通過促進(jìn)線粒體吞噬和抗氧化酶的表達(dá)降低氧化應(yīng)激水平、抑制凋亡，減少肝臟炎癥和纖維化［13］。以上報(bào)道提示，MitoQ作為衍生的線粒體抗氧化劑對(duì)線粒體功能損傷相關(guān)疾病，具有保護(hù)作用。線粒體來源的ROS是激活NLRP3炎癥小體和鐵死亡通路的重要介質(zhì)，雖然MitoQ可改善線粒體功能，但其是否抑制NLRP3炎癥小體的表達(dá)？在焦亡和鐵死亡中作用如何，目前尚未見報(bào)道。故我們提出假設(shè)，MitoQ是否可以通過減少線粒體ROS釋放從而抑制NLRP3，減輕焦亡及鐵死亡的發(fā)生。

MCC950特異性靶向NLRP3，阻斷炎癥小體復(fù)合物的組裝［14］，抑制細(xì)胞焦亡，參與多種心血管疾病的保護(hù)作用［15,16］，我們擬進(jìn)一步觀察其是否調(diào)控鐵死亡的發(fā)生。

ROS增多通過激活炎癥小體的生成引起細(xì)胞損傷，提示ROS位于炎癥小體的上游，但MCC950阻斷炎癥小體后，對(duì)線粒體ROS是否有影響？阻斷炎癥小體同時(shí)再激活線粒體ROS生成是否會(huì)繼續(xù)發(fā)揮損傷作用？魚藤酮（ROT）是線粒體復(fù)合體I 電子傳輸鏈的抑制劑，可使線粒體膜電位降低，促進(jìn)線粒體ROS產(chǎn)生增加，發(fā)揮神經(jīng)毒性作用，在帕金森等神經(jīng)性疾病中研究廣泛［17,18］，ROT作為線粒體ROS激動(dòng)劑亦誘導(dǎo)心血管損傷［19,20］。采用ROT促進(jìn)線粒體ROS生成是否可以取消或減弱抑制NLRP3炎癥小體從而抑制焦亡的作用？是否影響鐵死亡的發(fā)生？這激發(fā)了我們的研究興趣。

故本研究分別采用MitoQ和MCC950抑制線粒體ROS和NLRP3炎癥小體的產(chǎn)生，觀察兩者對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞焦亡和鐵死亡的作用，并在MCC950阻斷NLRP3炎癥小體的基礎(chǔ)上采用ROT促進(jìn)線粒體ROS產(chǎn)生，深入探究線粒體ROS和NLRP3 炎癥小體之間的關(guān)系，為臨床通過抑制氧化應(yīng)激、減輕線粒體損傷、減少細(xì)胞死亡從而預(yù)防和治療糖尿病心肌損傷等提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

H9C2 大鼠胚胎心肌細(xì)胞系（中國復(fù)百澳生物公司）；高糖DMEM 和胎牛血清（Hyclone）；MCC950（sigma）；MitoQ（MedChemExpress）；Rotenone（APExBIO）；CCK-8試劑盒（Biosharp）；CellRox、MitoSox（Thermo Fisher）；兔抗大鼠NLRP3、兔抗大鼠GSDMD 和GSDMD-NT（Cell Signaling Technology）；兔抗大鼠GPX4（Abcam）；兔抗大鼠GAPDH 抗體（Absin）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（Biosharp）；免疫熒光兔抗大鼠NLRP3購于（Novus）；DAPI（碧云天）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 大鼠H9C2心肌細(xì)胞用含10%胎牛血清的4500 g/L的DMEM培養(yǎng)基接種于無菌培養(yǎng)瓶中于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。取生長良好且處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。用35 mmol/L濃度的高糖干預(yù)H9C2心肌細(xì)胞24 h建立高糖損傷模型。

實(shí)驗(yàn)分組：MitoQ和ROT均設(shè)置0.1、0.5、1 μmol/mL的濃度梯度，篩選并確定最適藥物濃度后，按照隨機(jī)數(shù)字表法將H9C2心肌細(xì)胞分為5組。①正常對(duì)照組（CON）：H9C2心肌細(xì)胞培養(yǎng)于含25 mmol/L濃度葡萄糖的DMEM完全培養(yǎng)基；②高糖損傷組（HG）：H9C2心肌細(xì)胞培養(yǎng)于含35 mmol/L的高糖培養(yǎng)基；③高糖+線粒體靶向抗氧化劑MitoQ 組（HG+MitoQ）：H9C2 心肌細(xì)胞培養(yǎng)于含終濃度為0.5 μmol/mL 的MitoQ的35 mmol/L高糖培養(yǎng)基中［21,22］；④高糖+NLRP3炎癥小體抑制劑MCC950組（HG+MCC950）：H9C2心肌細(xì)胞培養(yǎng)于含終濃度為1 μmol/mL 的MCC950 的35 mmol/L高糖培養(yǎng)基中［15,23］；⑤高糖組+MCC950+線粒體電子傳遞抑制劑Rotenone（ROT）（HG+MCC950+ROT）：心肌細(xì)胞培養(yǎng)于含終濃度為1 μmol/mL 的MCC950和0.5 μmol/mL的ROT的35 mmol/L高糖培養(yǎng)基中［24,26］。各種藥物干預(yù)心肌細(xì)胞24 h后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。

1.2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞活性 將H9C2心肌細(xì)胞計(jì)數(shù)后以2×103/孔接種于96孔板，細(xì)胞鋪至60%～70%時(shí)給予無血清處理16～18 h，分組處理24 h 后，每孔加入CCK-8培養(yǎng)液10 μL，并設(shè)置空白對(duì)照孔，37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育2 h，酶標(biāo)儀測定吸光度A450nm值。計(jì)算細(xì)胞活力%=（干預(yù)細(xì)胞A450nm-空白A450nm）/（對(duì)照細(xì)胞A450nm-空白A450nm）×100%。

1.2.3 CellRox和MitoSox探針分別檢測心肌細(xì)胞內(nèi)和線粒體內(nèi)ROS水平 H9C2心肌細(xì)胞以5×104/皿接種于共聚焦小皿，分組處理后按照使用說明每孔加入5 μmol/mL的CellRox或MitoSox探針，37 ℃避光孵育探針30 min或10 min，4%多聚甲醛37 ℃固定15 min，37 ℃避光孵育DAPI（1 μg/mL）15 min后加入防熒光淬滅劑?；罴?xì)胞工作站或共聚焦顯微鏡下觀察、拍照，Image J軟件進(jìn)行熒光平均強(qiáng)度分析。

1.2.4 免疫熒光法檢測細(xì)胞內(nèi)NLRP3水平 H9C2心肌細(xì)胞計(jì)數(shù)，以2×104/孔接種于12孔板，分組處理24 h后，4%多聚甲醛37 ℃固定30 min；0.5%Triton X-100 37 ℃滲透細(xì)胞30 min；5%BSA 37 ℃封閉30 min；BSA稀釋兔抗大鼠NLRP3抗體（1∶10～1∶50）4 ℃孵育過夜；Cy3-山羊抗兔IgG(1∶400～1∶800)37 ℃孵育30 min；37 ℃避光孵育DAPI（1 μg/mL）15 min，加入防熒光淬滅劑?；罴?xì)胞工作站觀察、拍照，Image J軟件進(jìn)行平均熒光強(qiáng)度分析。

基于灰靶理論的“一帶一路”沿線省份科技創(chuàng)新能力評(píng)價(jià)…………………………………………馮俊華 張慶妮 徐青青（3.25）

1.2.5 Western blot檢測心肌細(xì)胞內(nèi)焦亡相關(guān)因子的蛋白表達(dá) 分組干預(yù)24 h后，收集各組心肌細(xì)胞加入適量RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定各組細(xì)胞蛋白濃度，加入5×蛋白上樣緩沖液后，定量30 μg上樣電泳后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉PVDF膜2 h，兔抗大鼠NLRP3（1∶600）、GSDMD（1∶2000）、GSDMD-NT（1∶2000）、GPX4（1∶3000）和GADPH（1∶3000）4 ℃孵育過夜、TBST洗膜3次，山羊抗兔二抗（1∶10 000）孵育1 h、TBST洗膜4次，ECL顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光、顯影。Image J軟件分析各組蛋白表達(dá)水平。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，并用Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞活性變化

2.1.1 藥物濃度確定 CCK-8結(jié)果顯示，H9C2心肌細(xì)胞干預(yù)24 h 后，與CON 組相比，HG 組細(xì)胞活性明顯下降（P=0.003）。與HG組相比，MitoQ終濃度為0.1、0.5、1 μmol/mL的HG+MitoQ組活性均明顯升高（P=0.002;P＜0.001;P=0.001），其中0.5 μmol/mL組活性最高（圖1A）。與CON組相比，隨著ROT濃度升高，細(xì)胞活性逐漸下降（P＜0.001）；1 μmol/mL時(shí)細(xì)胞狀態(tài)不佳，故選取0.5 μmol/mL的MitoQ和ROT進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（圖1B）。

2.1.2 各組細(xì)胞活性變化 CCK-8結(jié)果顯示，與CON組相比，HG組細(xì)胞活性明顯下降（P=0.005）。與HG組相比，HG+MitoQ和HG+MCC950組活性明顯升高（P=0.008;P＜0.001）。HG+MCC50+ROT 組細(xì)胞活性與HG組相比無明顯變化（P=0.976），與HG+MCC950組相比明顯降低（P=0.001，圖1C）。

圖1 各組H9C2心肌細(xì)胞活性Fig.1 Viability of H9C2 cardiac muscle cells treated with different concentrations of mitoquinone (A),rotenone(ROT;B)or both(C).Data are presented as Mean±SD(n=5 or 4).**P＜0.01,***P＜0.001 vs CON;##P＜0.01,###P＜0.001 vs HG;&&P＜0.01 vs HG+MCC950.

2.2 各組細(xì)胞和線粒體內(nèi)ROS水平的變化

如圖2所示，與CON組相比，HG組反映胞漿氧自由基變化的CellRox（綠色，圖2A）和反映線粒體氧自由基變化的MitoSox（紅色，圖2B）平均熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)（P＜0.001）。與HG 組相比，HG+MitoQ（P=0.004;P＜0.001）和HG+MCC950（P＜0.001）組熒光強(qiáng)度均明顯下降；同時(shí)與HG+MCC950組相比，HG+MCC50+ROT組CellRox和MitoSox熒光強(qiáng)度也明顯增強(qiáng)（P=0.008;P=0.016）。

圖2 各組H9C2心肌細(xì)胞CellRox和MitoSox染色Fig.2 Fluorescence staining of H9C2 cells with CellRox and MitoSox.A,B:Images of CellRox(green;scale bar=100 μm)and MitoSox(red;scale bar=20 μm)and DAPI(blue)fluorescence staining.C,D:Quantitative analysis of fluorescence intensity of CellRox and MitoSox staining(Mean±SD,n=5).***P＜0.001 vs CON;##P＜0.01,###P＜0.001 vs HG;&P＜0.05,&&P＜0.01 vs HG+MCC950.

2.3 各組心肌細(xì)胞NLRP3免疫熒光變化

與CON 組相比，HG 組紅色熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)（P＜0.001）。與HG組相比，HG+MitoQ、HG+MCC950組紅色熒光強(qiáng)度明顯下降（P＜0.001;P=0.003）。與HG+MCC950組相比，HG+MCC50+ROT組NLRP3熒光強(qiáng)度也明顯增強(qiáng)（P=0.034，圖3）。

圖3 各組H9C2心肌細(xì)胞NLRP3免疫熒光染色Fig.3 Immunofluorescence staining of NLRP3 in H9C2 cells.A:Images of NLRP3(red)and DAPI(blue)immunofluorescence staining (×200,scale bar=50 μm).B:Quantitative analysis of NLRP3 fluorescence intensity (Mean±SD, n=5).***P＜0.001 vs CON;##P＜0.01,###P＜0.001 vs HG;&P＜0.05 vs HG+MCC950.

2.4 各組心肌細(xì)胞內(nèi)NLRP3、GSDMD、GSDMD-NT和GPX4蛋白表達(dá)變化

Western blot 結(jié)果顯示，與CON 組相比，HG 組NLRP3及焦亡相關(guān)因子GSDMD和GSDMD-NT蛋白表達(dá)均明顯升高（P=0.010;P=0.003;P＜0.001），GPX4蛋白明顯降低（P＜0.001）。與HG組相比，HG+MitoQ和HG+MCC950 組NLRP3（P=0.020;P=0.018）、GSDMD（P=0.001;P=0.002）和GSDMD-NT（P＜0.001;P=0.001）蛋白表達(dá)均明顯下降，GPX4蛋白表達(dá)明顯上升（P=0.002;P=0.003）。與HG組相比，HG+MCC950+ROT組NLRP3（P=0.873）和GSDMD-NT（P=0.202）蛋白表達(dá)無明顯變化，GSDMD降低（P=0.001）；與HG+MCC950組相比，HG+MCC950+ROT 組NLRP3 和GSDMD-NT蛋白表達(dá)明顯上升（P=0.024;P=0.033），GPX4蛋白表達(dá)下降（P=0.032，圖4）。

圖4 各組H9C2心肌細(xì)胞相關(guān)蛋白水平變化Fig.4 Changes of protein levels in each group.A,B:Western blots of NLRP3,GSDMD,GSDMD-NT,GPX4 and GAPDH in H9C2 cells.C-F:NLRP3,GSDMD,GSDMD-NT and GPX4 protein levels normalized by GAPDH levels(Mean±SD,n=5).*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs CON;#P＜0.05,##P＜0.01,###P＜0.001 vs HG;&P＜0.05 vs HG+MCC950.

3 討論

DCM是引起糖尿病患者死亡的重要原因之一，除肥胖、胰島素抵抗、心臟結(jié)構(gòu)異常等危險(xiǎn)因素外，線粒體功能和ROS的釋放也與DCM的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。高糖引起線粒體功能障礙，氧化磷酸化受損，膜電位改變，Ca2+超負(fù)荷，ROS生成增多，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。細(xì)胞焦亡和鐵死亡是均可被ROS誘導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡方式。

糖尿病狀態(tài)下，線粒體作為活性氧的主要來源，其產(chǎn)生的ROS是機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要組成。線粒體靶向抗氧化劑MitoQ的親脂陽離子具有脂溶性，因此可以很容易和迅速地通過磷脂雙分子層進(jìn)入線粒體，迅速而廣泛地占據(jù)著線粒體，轉(zhuǎn)化為具有抗氧化活性的泛醇發(fā)揮抗氧化作用。糖尿病狀態(tài)下，線粒體抗氧化劑MitoQ可以減輕線粒體損傷和胰腺內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、免疫細(xì)胞以及肝臟中的氧化應(yīng)激水平［22,33,34］，在高糖環(huán)境下也能減輕腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷［35］。在心血管疾病中，MitoQ可以改善壓力超負(fù)荷引起的心臟纖維化和心功能不全［12］，發(fā)揮保護(hù)作用。但其在糖尿病或高糖環(huán)境下對(duì)心肌細(xì)胞焦亡的作用及是否調(diào)控鐵死亡的發(fā)生報(bào)道缺乏明確結(jié)論。

本課題前期研究觀察到，運(yùn)用35 mmol/L高糖干預(yù)心肌細(xì)胞24 h，可誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞發(fā)生焦亡［36］。本研究繼續(xù)采用35 mmol/L高糖培養(yǎng)基干預(yù)H9C2心肌細(xì)胞復(fù)制糖尿病模型，探討細(xì)胞焦亡和鐵死亡及相關(guān)機(jī)制。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，高糖組心肌細(xì)胞發(fā)生損傷，氧化應(yīng)激加重，并誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡，具體表現(xiàn)為細(xì)胞活性下降，細(xì)胞內(nèi)和線粒體內(nèi)ROS水平增強(qiáng)、NLRP3免疫熒光水平、NLRP3、GSDMD和GSDMD-NT蛋白表達(dá)均明顯增強(qiáng)，同時(shí)GPX4蛋白水平顯著降低，提示高糖促進(jìn)焦亡和鐵死亡發(fā)生。

在高糖干預(yù)的基礎(chǔ)上給予線粒體靶向抗氧化劑0.5 μmol/mL MitoQ，與高糖組相比，細(xì)胞活性明顯增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)和線粒體內(nèi)ROS水平、NLRP3免疫熒光水平均下降，GSDMD蛋白的裂解也明顯減弱，GPX4水平明顯升高，提示直接抑制線粒體氧化應(yīng)激可引起細(xì)胞胞漿和線粒體氧自由基的釋放減少，減輕NLRP3炎癥小體的生成，不僅抑制焦亡的發(fā)生，同時(shí)抑制鐵死亡的發(fā)生。氧化應(yīng)激能夠誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體的生成，促進(jìn)焦亡發(fā)生，那么改變炎癥小體是否會(huì)調(diào)控氧化應(yīng)激損傷？改變炎癥小體是否調(diào)控鐵死亡的發(fā)生？目前鮮有報(bào)道。Luo等［37］報(bào)道，NLRP3炎癥小體的活化導(dǎo)致炎癥因子分泌增多，促進(jìn)線粒體ROS 的生成增多，進(jìn)一步誘導(dǎo)NLRP3的活化，提示線粒體ROS和NLRP3之間存在相互影響?，F(xiàn)有報(bào)道盡管對(duì)于ROS激活炎癥小體已較明確，但是對(duì)于炎癥小體激活能否促進(jìn)更多的ROS的釋放尚不明了［38］。

為了進(jìn)一步觀察高糖環(huán)境下NLRP3 炎癥小體、ROS的產(chǎn)生和釋放的先后順序，本研究采用NLRP3炎癥小體特異性抑制劑1 μmol/mL MCC950進(jìn)行藥物干預(yù)，抑制NLRP3 的表達(dá)。結(jié)果顯示，與高糖組相比，HG+MCC950組心肌細(xì)胞活性增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)和線粒體內(nèi)ROS水平均降低，提示NLRP3被抑制后，可通過反向調(diào)控胞漿及線粒體ROS的釋放減輕對(duì)細(xì)胞的損傷；同時(shí)NLRP3免疫熒光和NLRP3、GSDMD-NT蛋白表達(dá)均降低，提示NLRP3被抑制后，一方面氧化應(yīng)激水平降低，另一方面NLRP3的降低使得細(xì)胞在高糖環(huán)境下不易形成NLRP3炎癥小體復(fù)合物，從而不易激活焦亡關(guān)鍵因子GSDMD 的裂解，炎癥因子釋放減少，損傷減輕。同時(shí)觀察到鐵死亡相關(guān)蛋白GPX4蛋白水平明顯升高，提示減輕了鐵死亡的發(fā)生。結(jié)合上述結(jié)果，我們推測抑制NLRP3 炎癥小體的生成減輕高糖誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞焦亡和炎癥反應(yīng)可能與其能夠抑制胞質(zhì)和線粒體氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)；同時(shí)抑制NLRP3炎癥小體亦能抑制另一種與氧化應(yīng)激密切相關(guān)的細(xì)胞死亡方式——鐵死亡的發(fā)生，但NLRP3下調(diào)本身直接抑制鐵死亡的發(fā)生，還是其通過減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)抑制鐵死亡的發(fā)生，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。

為了進(jìn)一步確定氧化應(yīng)激和炎癥小體之間相互調(diào)控的上下游反饋關(guān)系，本研究進(jìn)一步在MCC950阻斷NLRP3炎癥小體作用的基礎(chǔ)上采用ROT促進(jìn)線粒體ROS產(chǎn)生。Bavkar等［39］報(bào)道ROT在高糖引起的心、肝、肺、腎多臟器損傷的基礎(chǔ)上可繼續(xù)促進(jìn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，加重?fù)p傷。本研究結(jié)果顯示，與HG 組相比，HG+MCC950+ROT組心肌細(xì)胞活性、NLRP3和GSDMDNT蛋白表達(dá)無明顯差別，仍然引起細(xì)胞損傷；與HG+MCC950組相比，HG+MCC950+ROT組細(xì)胞和線粒體內(nèi)ROS水平、NLRP3炎癥小體和GSDMD-NT表達(dá)均升高，GPX4表達(dá)下降，提示ROT促進(jìn)線粒體ROS釋放后，取消了NLRP3抑制劑MCC950的保護(hù)作用，繼續(xù)促進(jìn)NLRP3 炎癥小體生成引起細(xì)胞焦亡和鐵死亡，但MCC950抑制炎癥小體的前提下，再次被激活的氧化應(yīng)激損傷和炎癥小體數(shù)量有限。

以上結(jié)果提示線粒體ROS和NLRP3之間可能存在相互聯(lián)系，高糖等損傷誘導(dǎo)線粒體ROS的增加促進(jìn)NLRP3炎癥小體的產(chǎn)生；NLRP3炎癥小體亦可能反饋加重線粒體ROS的釋放，阻斷NLRP3炎癥小體可以減少線粒體氧化應(yīng)激反應(yīng)；即使抑制了NLRP3炎癥小體，額外增加線粒體ROS 的釋放亦能繼續(xù)誘導(dǎo)NLRP3 炎癥小體生成，形成級(jí)聯(lián)效應(yīng)，共同促進(jìn)焦亡和鐵死亡的發(fā)生。

綜上所述，高糖引起H9C2心肌細(xì)胞胞漿和線粒體ROS釋放增多，誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體并促進(jìn)GSDMD裂解增強(qiáng)，GPX4蛋白表達(dá)下降，導(dǎo)致焦亡和鐵死亡發(fā)生。減少線粒體ROS的釋放、抑制NLRP3炎癥小體均可對(duì)抗高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞焦亡和鐵死亡發(fā)揮保護(hù)作用。線粒體ROS和NLRP3炎癥小體之間可能存在相互調(diào)控的作用，其相關(guān)機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。