氮磷營養(yǎng)鹽對銅綠微囊藻和斜生柵藻生長及競爭的影響

謝 靜，程 燕，查 燕，湯 婕*，束浩然，，

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，安徽 合肥 230036；2.安徽省合肥市環(huán)境監(jiān)測中心站，安徽 合肥 230001；3.杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310024）

【研究意義】富營養(yǎng)化是自然演變的過程，隨著人類活動的加劇使得湖泊富營養(yǎng)化成為自然演變過程的濃縮[1]。近些年來，我國各地湖泊、養(yǎng)殖池塘等淡水水體都處于富營養(yǎng)化狀態(tài)，其中洪澤湖、太湖、巢湖已達富營養(yǎng)程度，鄱陽湖和洞庭湖為中營養(yǎng)水平[2]。富營養(yǎng)化進一步導(dǎo)致湖泊藍藻暴發(fā)，并呈迅猛發(fā)展的趨勢。當藍藻暴發(fā)時，藍藻成為水體中的優(yōu)勢種，抑制其他藻類生長[3]，此外，藍藻水華還將導(dǎo)致水體中的溶解氧下降，導(dǎo)致大量水生生物死亡，破壞水體質(zhì)量[4]。藍藻還會釋放毒素，能夠直接危害人體健康[5]。因此，防控藍藻水華成為環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域研究的重點和難點問題?！厩叭搜芯窟M展】大量研究表明，藍藻暴發(fā)與pH、光照、溫度、營養(yǎng)鹽等多種因素有關(guān)[6]，其中氮（N）、磷（P）營養(yǎng)鹽是影響藍藻暴發(fā)的關(guān)鍵因子[7-9]。氮、磷營養(yǎng)鹽作為防控藍藻水華的可控手段，相關(guān)學(xué)者對其如何影響藍藻生長進行了報道。Liu等[10]研究發(fā)現(xiàn)，N、P 質(zhì)量比為200 時能夠控制藍藻生長，而N 質(zhì)量濃度為10 mg/L 且N、P 質(zhì)量比等于16時，藍藻得到最大細胞產(chǎn)量。孔欣等[11]研究發(fā)現(xiàn)N、P 質(zhì)量濃度分別為2.65，0.53 mg/L 時，銅綠微囊藻的密度達到最大值。Chen 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，總P 質(zhì)量濃度在0.1 mg/L 以上時，銅綠微囊藻的繁殖速度明顯加快。此外，有機污染物也是影響藻類生長的關(guān)鍵因素[13]，如低濃度PAHs 可以作為銅綠微囊藻（Mcirocystis aeruginosa）的生長促進因子[14]，其中低濃度芘脅迫下的銅綠微囊藻的生長受到明顯促進，且pH=9.0時，其生長率最高[15]。李尚等[16]研究發(fā)現(xiàn)再生水中含有氮磷營養(yǎng)物質(zhì)，景觀回用過程中可能會加劇藻類水華爆發(fā)風險。許海等[17]研究發(fā)現(xiàn)太湖中溶解態(tài)有機磷濃度占比較高，有利于藍藻形成優(yōu)勢。馬浩天等[18]研究發(fā)現(xiàn)與沉水植物共培養(yǎng)條件下，斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）的生長受到顯著的抑制作用?！颈狙芯壳腥朦c】由此可見，銅綠微囊藻和斜生柵藻作為湖泊中常見的藻類，由于極易繁殖，被認為是引起水華現(xiàn)象的主要藻種[19]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過配制不同氮磷比（質(zhì)量比）的培養(yǎng)液培養(yǎng)銅綠微囊藻和斜生柵藻，通過觀察藻細胞數(shù)及增長率，探究不同氮磷比對兩種藻類在純養(yǎng)和混養(yǎng)模式下生長的影響，以期為藍藻水華暴發(fā)防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種與培養(yǎng)基

試驗用銅綠微囊藻取自中國科學(xué)院水生生物研究所（武漢）淡水藻種庫，斜生柵藻取自中山大學(xué)污染與恢復(fù)生態(tài)學(xué)實驗室。實驗以BG-11 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，先配制成無磷、無氮的培養(yǎng)基，再用硝酸鈉和磷酸氫二鉀配制成實驗所需的氮磷比例。

1.2 試驗設(shè)置

在正式試驗前進行饑餓培養(yǎng)。將饑餓培養(yǎng)的銅綠微囊藻，斜生柵藻以5 000 r/min離心5 min，去掉上清液；再用15 mg/L 的NaHCO3。溶液洗滌2 次，去掉上清液，去除吸附性的營養(yǎng)，用無菌水將藻種稀釋至接種所需的藻細胞濃度。藻種的初始密度定為5.0×104個/mL。

1.3 試驗方法

將經(jīng)過饑餓培養(yǎng)的銅綠微囊藻細胞，斜生柵藻分別接種到含有0，0.5，1.0，5.0，10.0 mg/L 磷（即0，3.68，7.36，36.84，73.68 mg/L 的磷酸氫二鉀）和氮元素固定在25 mg/L 的BG-11 培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液處于以磷為標準的富營養(yǎng)狀態(tài)和超富營養(yǎng)狀態(tài)。在溫度為（25±5）℃，光照強度為2 000 lx，光暗比為12 h∶12 h的條件下培養(yǎng)22 d。觀察銅綠微囊藻和斜生柵藻細胞數(shù)的變化情況，用血球計數(shù)板進行計數(shù)。

1.4 比生長速率計算

藻細胞增長率（μ）指在某一時間間隔內(nèi)藻類生長的速率。

式中：X1為某一時間間隔開始時的銅綠微囊藻細胞現(xiàn)存量（個/mL）；X2為某一時間間隔終結(jié)時的銅綠微囊藻細胞現(xiàn)存量（個/mL）；t2-t1為某一時間間隔（d）。

1.5 生長曲線擬合

以邏輯斯諦方程擬合藻類的增長過程，先進行參數(shù)預(yù)估，以每組處理的最大生物量（Nmax）作為公式中K估計值，應(yīng)用邏輯斯諦方程的對數(shù)形式，采用最小二乘法進行回歸分析，獲得方程截距a和斜率r的估計值。

式中：N為藻類生物量；K為最大生物量；r為內(nèi)稟增長率；t為培養(yǎng)時間。

1.6 種間競爭參數(shù)

種間競爭優(yōu)勢用相對生長速率判別，其計算公式為[20]:

式中K為生長速率常數(shù)，Nt為培養(yǎng)t天后的藻密度（ind·L-1），No為藻初始密度（ind·L-1），K1為純養(yǎng)藻類時銅綠微囊藻對斜生柵藻的生長速率，KA、Kc分別為純養(yǎng)時銅綠微囊藻和斜生柵藻的生長速率常數(shù)，K2為混養(yǎng)時銅綠微囊藻對斜生柵藻的生長速率，K'A、K'c則為混養(yǎng)時二者的生長速率常數(shù)。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)以“平均值±標準差”表示，數(shù)據(jù)處理均采用SPSS21 統(tǒng)計軟件中one-way ANOVA 進行方差分析，LSD’s多重比較檢驗各試驗組間是否具有顯著差異（P＜0.05），圖用original 9.0繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 純養(yǎng)和混養(yǎng)模式對兩種藻類最大生物量的影響

如圖1、2所示，當N/P=（50∶1～2.5∶1）時，純養(yǎng)下銅綠微囊藻和斜生柵藻的最大生物量均顯著大于混養(yǎng)（P＜0.05）。N/P=5∶1 和N/P=25∶1 組，純養(yǎng)下銅綠微囊藻和斜生柵藻的最大生物量均顯著大于其他組。在5 組氮磷比下，純養(yǎng)銅綠微囊藻和斜生柵藻的最大生物量均顯著大于混養(yǎng)模式。由此可見，兩種藻類在混養(yǎng)時有明顯的競爭性抑制。

圖1 不同氮磷比對銅綠微囊藻最大生物量的影響Fig.1 Effects of different N/P ratios on the maximum biomass of Microcystis aeruginosa

在0 mg/L 磷濃度下，兩種藻類均不能生長。純養(yǎng)下，N/P=5∶1 組銅綠微囊藻的最大生物量達656×104g/mL；混養(yǎng)下，N/P=25∶1 組銅綠微囊藻的最大生物量達387×104g/mL。純養(yǎng)下，N/P=25∶1組斜生柵藻的最大生物量達462×104g/mL；混養(yǎng)下，N/P=25∶1 組斜生柵藻的最大生物量達208×104g/mL。由此可見，在氮質(zhì)量濃度相同，不同氮磷比對兩種藻類的最大生物量均具有顯著影響（P＜0.05）（圖3），并隨著磷濃度的升高，純養(yǎng)和混養(yǎng)下兩種藻類的最大生物量具有顯著性差異（P＜0.05）。且無論在純養(yǎng)或混養(yǎng)，銅綠微囊藻對斜生柵藻呈現(xiàn)出強烈的抑制作用，其最大生物量均顯著高于斜生柵藻，究其原因，一方面由于微囊藻細胞是圓形，比斜生柵藻具有更大的比表面積，有利于吸收較多的營養(yǎng)和光照，因此具有較高的生物量[21]。另一方面，銅綠微囊藻能夠適應(yīng)營養(yǎng)鹽缺乏的特殊機制，在高氮磷比濃度下能夠攝取過量磷儲存在細胞為后續(xù)生長繁殖提供能量，因此在與斜生柵藻的競爭中占有優(yōu)勢。此外，銅綠微囊藻分泌藻毒素，對斜生柵藻產(chǎn)生的他感作用也使得其在競爭中占有優(yōu)勢[22]。

圖2 不同氮磷比對斜生柵藻最大生物量的影響Fig.2 Effects of different N/P ratios on the maximum biomass of Scenedesmus obliquus

圖3 不同氮磷比對銅綠微囊藻和斜生柵藻最大生物量的影響Fig.3 Effects of different N/P ratios on the maximum biomass of Microcystis aeruginosa and Scenedesmus obliquus

2.2 純養(yǎng)和混養(yǎng)模式對兩種藻類比生長速率的影響

由圖4 可知，無論在純養(yǎng)或混養(yǎng)，N/P=1∶0 組銅綠微囊藻和斜生柵藻均難以生長，甚至出現(xiàn)負增長率。混養(yǎng)銅綠微囊藻在12～14 d 期間的比生長速率最大，后期呈現(xiàn)下降趨勢。N/P=2.5∶1 組兩種藻類的增長率僅保持在0.3 左右，在第7 天出現(xiàn)明顯的下降趨勢，在第9 天其增長率趨近于零。在前期階段，斜生柵藻增長率要低于銅綠微囊藻，后期增長率有所提高，說明斜生柵藻受制于水體中磷含量，與高玉榮等[23]研究結(jié)論一致。在培養(yǎng)第10天，混養(yǎng)兩種藻類的比生長率出現(xiàn)最大值。在培養(yǎng)22 d，純養(yǎng)或混養(yǎng)下兩種藻類的比生長率呈下降趨勢。從第2 天開始，N/P=5∶1 組兩種藻類的增長率處在較為平穩(wěn)狀態(tài)，從第6天開始銅綠微囊藻的增長率有所下降，而斜生柵藻在整個培養(yǎng)過程中均處在較低水平，可能與磷濃度的升高抑制其生長有關(guān)。N/P=25∶1組銅綠微囊藻的增長率一直保持在0.4左右，從第6天開始出現(xiàn)明顯的下降趨勢，而在第9天其增長率接近于零。在前期階段，斜生柵藻的增長率要低于銅綠微囊藻，后期增長率有所提高，說明斜生柵藻適合在較低的磷濃度中生長。在N/P=50∶1 組的接種初期，純養(yǎng)和混養(yǎng)培養(yǎng)下的銅綠微囊藻和斜生柵藻均表現(xiàn)出較高的增長率，但總體增長率較低。從第6 天開始，兩者增長率明顯下降，第7 天后增長率趨近于零，甚至出現(xiàn)負增長?？傮w上，混養(yǎng)培養(yǎng)下的斜生柵藻增長受到銅綠微囊藻的影響，其增長率低于純養(yǎng)模式。

圖4 不同氮磷比對銅綠微囊藻和斜生柵藻比生長速率的影響Fig.4 Effects of different N/P ratios on the specific growth rate of Microcystis aeruginosa and Scenedesmus obliquus

2.3 純養(yǎng)和混養(yǎng)模式對兩種藻類生長曲線的影響

不同氮磷比下銅綠微囊藻和斜生柵藻的生長曲線見圖5，N/P=1∶0組，隨著培養(yǎng)時間的增加，純養(yǎng)或混養(yǎng)兩種藻類的細胞密度均呈不同幅度的增長趨勢，但藻細胞數(shù)僅能維持在接種時的密度范圍內(nèi)。在培養(yǎng)第18 天，純養(yǎng)斜生柵藻的細胞密度最大，但隨后斜生柵藻逐漸死亡，細胞密度密度逐漸下降。在N/P=2.5∶1 組，在培養(yǎng)初期（2～6 d），兩種藻類的細胞密度增長緩慢，從培養(yǎng)第8 天后，兩種藻類的細胞密度呈現(xiàn)出不同幅度的增長趨勢。值得注意的是，純養(yǎng)銅綠微囊藻的細胞密度增幅最大，在培養(yǎng)第22天時其密度達到最大值。總體上，無論是純養(yǎng)或混養(yǎng)銅綠微囊藻的細胞密度大于斜生柵藻，且混養(yǎng)斜生柵藻的細胞密度增幅較為平緩。在N/P=5∶1和N/P=25∶1組，兩種藻類的細胞密度增長曲線一致。在培養(yǎng)6 d后，兩種藻類的細胞密度逐漸升高，以純養(yǎng)銅綠微囊藻的細胞密度增幅最大。在第20 天，純養(yǎng)斜生柵藻的細胞增幅出現(xiàn)最大值。在N/P=50∶1 組，從培養(yǎng)第14 天后，除純養(yǎng)斜生柵藻之外，純養(yǎng)和共養(yǎng)銅綠微囊藻、斜生柵藻的細胞密度增長平緩。在培養(yǎng)第20天，純養(yǎng)斜生柵藻的細胞密度值最大?？傮w上，在混養(yǎng)下銅綠微囊藻和斜生柵藻的細胞密度均小于純養(yǎng)，說明兩種藻類之間存在競爭關(guān)系。

圖5 不同氮磷比對銅綠微囊藻和斜生柵藻生長曲線的影響Fig.5 Effects of different N/P ratios on the growth curve of Microcystis aeruginosa and Scenedesmus obliquus

2.4 銅綠微囊藻和斜生柵藻的種間競爭關(guān)系

銅綠微囊藻和斜生柵藻的相對生長速率如圖6所示，除N/P=1∶0組之外，自培養(yǎng)第8天始其他4組的KR值在1～2，說明銅綠微囊藻具有競爭優(yōu)勢，但隨培養(yǎng)時間的延長高氮磷比（N/P=25∶1和N/P=50∶1）下KR值趨近于1，說明兩種藻類無競爭性。在培養(yǎng)16～18 d 期間，N/P=1∶0 組的KR值呈上升趨勢，說明此階段銅綠微囊藻表現(xiàn)出明顯的競爭優(yōu)勢。培養(yǎng)第14天時，在N/P=1∶0培養(yǎng)條件下，KR值低至-3.39，是由于斜生柵藻的生物量小于初始值，此時銅綠微囊藻仍具有競爭優(yōu)勢。

圖6 銅綠微囊藻對斜生柵藻的相對生長速率Fig.6 Relative growth ratio of Microcystis aeruginosa to Scenedesmus obliquus

3 討論

研究顯示，氮和磷是影響藻類生長的重要限制因素，且氮和磷的作用也是相互的[24]。代瑞華等[25]研究表明，在磷質(zhì)量濃度相同，不同氮磷比條件下，氮限制會對銅綠微囊藻生物量產(chǎn)生不利影響，在低氮濃度下銅綠微囊藻的生物量顯著降低。而本研究結(jié)果顯示，在氮質(zhì)量濃度相同，不同氮磷比的低磷濃度（N/P=50:1）下銅綠微囊藻和斜生柵藻的生長均受到抑制。Chen 等[12]發(fā)現(xiàn)低濃度的氮、磷可以控制銅綠微囊藻的生長，且間接產(chǎn)生二甲胂酸此類毒物有關(guān)?？仔赖萚11]研究發(fā)現(xiàn)低質(zhì)量濃度（氮磷分別為0.03，0.006 mg/L）下銅綠微囊藻的生長速率最低，與本研究結(jié)論一致。當N/P=25:1 和N/P=5:1 時，兩種藻類均能正常生長。但在N/P=2.5:1 時，兩種藻類的生長再次受到抑制。因此，氮、磷質(zhì)量濃度過高反而抑制兩種藻類的生長。這是由于氮、磷質(zhì)量濃度具有一定的閾值范圍，兩者濃度過高使得藻密度達到飽和，導(dǎo)致其生長速率降低。同時，在高密度下藻類易產(chǎn)生有毒代謝物，不利于藻類生長[26]。

此外，孔欣等[11]研究得出，氮磷比越高，銅綠微囊藻的生長速度越快。孫凱峰等[27]研究得出，在氮、磷其中1 種豐富充足情況致使不同氮磷比的情況下，會改變銅綠微囊藻的生物量，使其成為優(yōu)勢種，降低了生物群落的多樣性。N/P=5:1 時，銅綠微囊藻的生長受到明顯的抑制。究其原因，是由于培養(yǎng)中的氮含量不能充分滿足藻類生長繁殖的需求，因此銅綠微囊藻的生長受到抑制。本研究選取的低濃度N/P=50:1下斜生柵藻所達到的峰值與磷適宜濃度達到的峰值差距較小，說明斜生柵藻比微囊藻更適宜在低磷濃度條件下生長。由此可見，斜生柵藻生長比銅綠微囊藻需要更多的氮源以維持細胞增殖，與許海等[17]結(jié)論一致。王敏等[28]研究發(fā)現(xiàn)，氨氮濃度的降低使得藻占比逐漸下降，而藍藻逐漸成為優(yōu)勢種，也與本研究結(jié)論一致。研究發(fā)現(xiàn)，斜生柵藻比銅綠微囊藻需要更多的氮源來維持細胞增殖[17]。從銅綠微囊藻對斜生柵藻的相對生長速率KR值來看，本試驗中除N/P=1:0 組之外，自培養(yǎng)第8 天始其他四組的KR值在1～2，說明銅綠微囊藻具有競爭優(yōu)勢。因此，高氮磷比有利于銅綠微囊藻生長。有研究發(fā)現(xiàn)湖泊氮磷質(zhì)量比低于13[29-30]，那么藍藻將會占優(yōu)勢，高于這一比值，藍藻在整個藻類的生物量占比就會下降[30]。從本研究得出的KR值可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，高氮磷比（N/P=25:1 和N/P=50:1）下KR值趨近于1，說明銅綠微囊藻生物量占比下降，其對斜生柵藻的抑制減弱。因此，在低磷濃度環(huán)境中易暴發(fā)斜生柵藻，而高磷濃度環(huán)境中更易暴發(fā)銅綠微囊藻，且兩種藻類的競爭優(yōu)勢明顯，這與Smith[29]提出的理論基本一致。許海等[31]研究顯示當湖泊水體中存在較高濃度的生物可利用磷時，銅綠微囊藻具備獨特的生理生態(tài)特征，在藻類競爭中具有優(yōu)勢，且能保持較長時間的指數(shù)增長及生物量的增加，從而為水華創(chuàng)造有利條件。

4 結(jié)論

（1）在氮磷濃度較低范圍內(nèi)，隨著營養(yǎng)鹽濃度增加會促進銅綠微囊藻和斜生柵藻的生長，但在高濃度范圍內(nèi)，兩者生長反而受營養(yǎng)鹽濃度增加的限制。

（2）氮磷元素對銅綠微囊藻和斜生柵藻的生長和競爭均有顯著影響，兩種藻類在純養(yǎng)培養(yǎng)下的最大生物量顯著大于混養(yǎng)培養(yǎng)，說明混養(yǎng)培養(yǎng)下兩種藻類有競爭性抑制。

（3）銅綠微囊藻對斜生柵藻具有較強的抑制性，尤其是在磷濃度較高的環(huán)境中其抑制性表現(xiàn)的更加強烈。

（4）除N/P=1:0 組之外，自培養(yǎng)第8 天始其他4 組的KR值在1～2，說明銅綠微囊藻具有競爭優(yōu)勢。隨培養(yǎng)時間的延長，高氮磷比（N/P=25:1和N/P=50:1）下KR值趨近于1。