外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對異莨菪亭體內(nèi)處置的調(diào)控機(jī)制研究

應(yīng)夢迪，謝雨珊，朱麗君，王立萍，區(qū)曉君，劉中秋

廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，國際中醫(yī)藥轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所，廣東 廣州 510006

異莨菪亭，又名6-羥基-7-甲氧基香豆素，主要分布于木犀科植物苦櫪白蠟樹Fraxinus rhynchophyllaHance、白蠟樹F.chinensisRoxb.、尖葉白蠟樹F.szaboanaLingelsh.的樹皮中，是中藥秦皮的主要活性成分之一[1-2]。異莨菪亭具有較好的抗氧化、抗炎、抗癌和抗病毒等活性[3-6]，易被葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（UDP-glucuronosyltransferases，UGTs）如UGT1A10、UGT1A9和UGT1A6等催化代謝生成異莨菪亭葡萄糖醛酸苷[7]，但異莨菪亭在體內(nèi)的暴露形式、處置特征及相關(guān)調(diào)控機(jī)制鮮有研究，其成藥性數(shù)據(jù)及特征尚不清晰。乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）和多藥耐藥相關(guān)蛋白2（multidrug resistance-associated protein 2，MRP2）是三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員，是影響藥物體內(nèi)處置以及藥理作用的關(guān)鍵因素[8-9]。目前BCRP和MRP2對異莨菪亭體內(nèi)處置的影響及調(diào)控機(jī)制尚不清楚。因此，本研究采用外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因敲除小鼠模型，探討B(tài)CRP和MRP2對異莨菪亭及其葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物體內(nèi)處置的影響及調(diào)控機(jī)制。

1 材料

1.1 動物

雄性FVB背景Bcrp1-/-小鼠和Mrp2-/-小鼠購自上海南方模式生物科技有限公司，動物合格證號分別為99612800000279、99612800000278。雄性野生型FVB小鼠來源于雜合Bcrp1-/-小鼠或Mrp2-/-小鼠親代的野生型子代，Bcrp1-/-/Mrp2-/-小鼠由純合Bcrp1-/-小鼠和Mrp2-/-小鼠雜交獲得，采用PCR-STR技術(shù)對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行基因分型。實(shí)驗(yàn)動物周齡為6～8周，飼養(yǎng)于溫度（25±2）℃、相對濕度50%～60%的SPF級動物房中。動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號2020R0005、2020R0006）。

1.2 藥品與試劑

異莨菪亭（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號3620）購自上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，其化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1；內(nèi)標(biāo)華法林（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號012801MT-AC）購自美國AccuStandard公司；尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（批號SLBW7477）、β-葡萄糖醛酸苷酶（批號069M4017V）、葡萄糖二酸單內(nèi)酯（批號0000028759）、丙甲菌素（批號118M4018V）、Hank’s平衡溶液（HBSS，批號SLBL7680V）、HEPES緩沖液（批號SLCF4739）購自美國Sigma-Aldrich公司；乙腈、甲醇、甲酸購自德國Merck公司。

圖1 異莨菪亭化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of isoscopoletin

1.3 儀器

6460超高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀（UHPLC-MS/MS）、6540超高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC-Q-TOF/MS）、1200高效液相色譜儀（美國Aglient公司）；5810R冷凍高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；電子分析天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；WS27-2型恒溫水浴搖床、真空干燥儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；XW-80A型渦旋混合儀（上海滬西分析儀器廠）；Benchmark Plus酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 異莨菪亭-6-O-β-葡萄糖醛酸苷（isoscopoletin-6-O-β-glucuronide，I-6-G）的制備與鑒定

由于無I-6-G商業(yè)化對照品，本研究采用酶催化法合成代謝物I-6-G，其化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖2[10]。葡萄糖醛酸化孵育體系含50 mmol/L磷酸鹽緩沖液、5 mmol/L尿苷二磷酸葡萄糖醛酸、5 mmol/L氯化鎂溶液、25 μg/mL丙甲菌素、10 mmol/L葡萄糖二酸單內(nèi)酯、1 mg/mL肝微粒體及80 mmol/L異莨菪亭，將以上試劑混合均勻，于37 ℃水浴中孵育18 h，加入100 μL乙腈溶液，渦旋3 min，14 000 r/min離心30 min，取上清，經(jīng)HPLC分離收集I-6-G。采用UHPLC-Q-TOF/MS鑒定I-6-G，并通過轉(zhuǎn)換因子確定I-6-G的濃度。

圖2 I-6-G的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.2 Structure of I-6-G

2.2 UHPLC-MS/MS分析方法

2.2.1 色譜條件 Aglient Zorbax SB-C18色譜柱（100 mm×3 mm，1.8 mm），流動相為0.1%甲酸水溶液（A）和乙腈（B），梯度洗脫：0～1.5 min，10%B；1.5～3.0 min，10%～50% B；3.0～4.0 min，50%～100% B；4.0～5.0 min，100%～10% B。柱溫為37 ℃；體積流量為0.4 mL/min；進(jìn)樣量為2 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源正離子模式（ESI＋）；多重反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式掃描；毛細(xì)管電壓為4.0 kV；干燥氣溫度為300 ℃；噴嘴電壓為500 V；鞘氣溫度為350 ℃；氮?dú)怏w積流量為5 mL/min；鞘氣體積流量為12 mL/min；用于定量分析的離子對和碰撞能分別為異莨菪亭（m/z193.0→133.0，20 eV）、I-6-G（m/z369.0→193.0，15 eV）、華法林（m/z309.0→163.2，20 eV）。

2.3 方法學(xué)考察

根據(jù)文獻(xiàn)方法[11]，對小鼠血漿中異莨菪亭和I-6-G的定量分析方法進(jìn)行專屬性、線性范圍、準(zhǔn)確度和精密度、提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)、穩(wěn)定性考察。

2.3.1 樣品處理 小鼠斷尾采血，收集于肝素鈉離心管中，6000 r/min離心8 min，取上層血漿，于-20 ℃保存?zhèn)溆?。?0 μL血漿樣品加入10 μL 50%乙腈，再加入180 μL含20 nmol/L華法林的乙腈溶液，渦旋3 min，14 000 r/min離心10 min，吸取上清于真空干燥儀干燥；加入80 μL 50%乙腈復(fù)溶，渦旋3 min，14 000 r/min離心30 min，取上清進(jìn)行UHPLC-MS/MS分析。

2.3.2 專屬性 異莨菪亭、I-6-G和華法林的總離子流圖見圖3，I-6-G、異莨菪亭和華法林的出峰時間分別為3.5、4.1、5.0 min。待測組分及內(nèi)標(biāo)之間的分離效果較好，峰形理想且不受內(nèi)源性物質(zhì)等其他成分的干擾。

圖3 空白血漿 (A)，空白血漿加入異莨菪亭、I-6-G和華法林 (B)，ig異莨菪亭后的血漿樣品 (C) 的總離子流圖Fig.3 Total ion chromatogram of blank plasma (A), blank plasma spiked with isoscopoletin, I-6-G and warfarin (B)and mouse plasma sample after ig isoscopoletin (C)

2.3.3 線性范圍 配制一系列濃度的異莨菪亭和I-6-G混合對照品溶液，取10 μL，加入10 μL空白血漿，按“2.3.1”項(xiàng)下方法處理。以各成分與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為橫坐標(biāo)（Y），各成分濃度為縱坐標(biāo)（X），進(jìn)行線性回歸分析，求得的回歸方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)信噪比為10計(jì)算各成分的定量限。異莨菪亭與I-6-G的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及定量限見表1。

表1 異莨菪亭和I-6-G在小鼠空白血漿中的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和定量限Table 1 Standard curves, correlation coefficients, linear ranges, and limit of quantitation of isoscopoletin and I-6-G in plasma of mice

2.3.4 精密度與準(zhǔn)確度 取10 μL空白血漿，分別制備濃度為5 000.00、625.00、39.06 nmol/L的異莨菪亭和濃度為2 000.000、250.000、15.625 nmol/L的I-6-G混合對照品溶液作為高、中、低濃度的質(zhì)控樣品，按“2.3.1”項(xiàng)下方法處理，各濃度樣品平行制備6份，樣品分別在1 d內(nèi)測定3次和連續(xù)測定3 d，考察日內(nèi)、日間精密度及準(zhǔn)確度。如表2所示，高、中、低濃度質(zhì)控樣品的日內(nèi)、日間精密度均小于7%，準(zhǔn)確度為88%～111%，符合生物樣品測定要求。

表2 異莨菪亭和I-6-G的日內(nèi)、日間精密度和準(zhǔn)確度 (±s , n=6)Table 2 Precision and accuracy of intra-day and inter-day of isoscopoletin and I-6-G (±s , n=6)

表2 異莨菪亭和I-6-G的日內(nèi)、日間精密度和準(zhǔn)確度 (±s , n=6)Table 2 Precision and accuracy of intra-day and inter-day of isoscopoletin and I-6-G (±s , n=6)

成分 濃度/(nmol·L-1) 日內(nèi) 日間實(shí)測濃度/(nmol·L-1) 精密度RSD/% 準(zhǔn)確度RE/% 實(shí)測濃度/(nmol·L-1) 精密度RSD/% 準(zhǔn)確度RE/%異莨菪亭 0039.060 38.33±1.52 6.98 106.58 36.08±2.42 7.01 111.33 0625.000 667.14±4.59 2.22 93.05 679.40±35.51 5.23 91.30 5 000.000 5 162.16±26.83 0.86 94.82 5 264.43±28.51 5.42 94.71 I-6-G 0015.625 16.29±0.54 3.31 95.76 17.04±0.85 4.97 90.92 0250.000 230.91±4.08 1.76 107.99 246.85±12.88 5.23 103.00 2 000.000 2 169.23±36.84 1.69 91.54 2 231.27±65.29 2.92 88.44

2.3.5 提取回收率與基質(zhì)效應(yīng) 取高、中、低濃度質(zhì)控樣品，按“2.3.1”項(xiàng)下方法處理，各濃度樣品平行制備6份，進(jìn)樣得到各成分與內(nèi)標(biāo)峰面積比值（P1）；取10 μL空白血漿，加入180 μL含20 nmol/L華法林的乙腈溶液，渦旋3 min，再加入10 μL高、中、低濃度混合對照品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣得到各成分與內(nèi)標(biāo)峰面積比值（P2）；取10 μL高、中、低濃度混合對照品溶液，加入10 μL 50%乙腈溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣得到各成分與內(nèi)標(biāo)峰面積比值（P3）。以P1與P2比值計(jì)算提取回收率，P1與P3比值計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。如表3所示，異莨菪亭和I-6-G的測定受生物基質(zhì)干擾較小，提取回收率穩(wěn)定，符合樣品測定要求。

表3 異莨菪亭和I-6-G在小鼠血漿中的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) (±s , n=6)Table 3 Recovery and matrix effect of isoscopoletin and I-6-G in plasma of mice (±s , n=6)

表3 異莨菪亭和I-6-G在小鼠血漿中的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) (±s , n=6)Table 3 Recovery and matrix effect of isoscopoletin and I-6-G in plasma of mice (±s , n=6)

成分 濃度/(nmol·L-1) 提取回收率 基質(zhì)效應(yīng)平均值/% RSD/% 平均值/% RSD/%異莨菪亭 39.06 82.67 6.02 111.58 1.40 625.00 82.31 10.21 107.09 1.89 5 000.00 94.38 6.25 107.49 2.13 I-6-G 15.625 81.36 5.74 105.76 4.44 250.000 87.56 6.40 103.61 3.65 2 000.000 102.41 3.22 109.76 2.57

2.3.6 穩(wěn)定性 取高、中、低濃度質(zhì)控樣品，分別按“2.3.1”項(xiàng)下方法處理，每份樣品平行制備6份，分別于室溫放置4 h后考察短期穩(wěn)定性，于-20 ℃冰箱放置14 d后考察長期穩(wěn)定性，從-20 ℃至室溫反復(fù)凍融3次考察凍融穩(wěn)定性。小鼠血漿中的異莨菪亭和I-6-G在不同處理?xiàng)l件下的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)見表4，表明本實(shí)驗(yàn)中的生物樣品短期穩(wěn)定性、長期穩(wěn)定性和凍融穩(wěn)定性良好，滿足生物樣品分析條件。

表4 小鼠血漿中異莨菪亭和I-6-G的穩(wěn)定性 ()Table 4 Stability of isoscopoletin and I-6-G in plasma of mice ()

表4 小鼠血漿中異莨菪亭和I-6-G的穩(wěn)定性 ()Table 4 Stability of isoscopoletin and I-6-G in plasma of mice ()

成分 濃度/(nmol·L-1) 室溫放置4 h -20 ℃放置14 d -20 ℃至室溫反復(fù)凍融3次RSD/% RE/% RSD/% RE/% RSD/% RE/%異莨菪亭 39.06 4.77 109.85 7.48 106.88 3.48 109.93 625.00 5.02 97.27 4.14 92.36 4.19 90.30 5 000.00 7.19 105.53 2.16 92.27 4.15 92.68 I-6-G 15.625 1.59 96.39 7.36 90.84 2.37 94.37 250.000 1.98 109.34 1.85 95.26 7.92 103.30 2 000.000 7.72 103.17 1.33 87.93 2.20 91.09

2.4 異莨菪亭在小鼠體內(nèi)的藥動學(xué)研究

野生型FVB小鼠、Bcrp1-/-小鼠、Mrp2-/-小鼠和Bcrp1-/-/Mrp2-/-小鼠分別ig異莨菪亭（2 mg/kg）或尾iv異莨菪亭（1 mg/kg），分別于給藥后0、3、5、10、15、20、30、60、120、240、360、480 min斷尾采血收集于肝素鈉離心管中，按“2.3.1”項(xiàng)下方法處理，取上清進(jìn)行UHPLC-MS/MS分析。藥動學(xué)參數(shù)采用WinNonlin?3.3非房室模型擬合。

2.5 異莨菪亭在體腸灌流研究

采用小鼠在體單向腸灌流模型，模擬異莨菪亭的腸道處置過程。小鼠在體單向腸灌流手術(shù)操作參照本課題組前期研究[12]。含40 μmol/L異莨菪亭的HBSS緩沖液以10 mL/h恒速灌流十二指腸和結(jié)腸，預(yù)灌流30 min后，每15分鐘于十二指腸和結(jié)腸出口處收集灌流液。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后測量每個腸段的長度，并收集血漿和膽汁。取50 μL灌流液樣品加入450 μL含20 nmol/L華法林的乙腈溶液，渦旋3 min后，14 000 r/min離心30 min，取上清進(jìn)樣UHPLCMS/MS分析。采用重量法計(jì)算異莨菪亭在小腸和結(jié)腸的表觀滲透系數(shù)（P*eff）。

P*eff＝(1－Cm/Co)/4Gz

其中Cm和Co分別代表腸腔入口和出口藥物濃度，Gz是與流量、腸道的長度和擴(kuò)散系數(shù)有關(guān)的轉(zhuǎn)換參數(shù)

2.6 異莨菪亭在小鼠肝微粒體和小腸微粒體中的酶動力學(xué)研究

小鼠肝微粒體和小腸微粒體的制備及濃度測定參照本課題組前期研究[13]。肝微粒體質(zhì)量濃度為0.025 mg/mL，小腸微粒體質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL，底物異莨菪亭濃度為0.1～5.2 μmol/L。底物分別與肝微粒體和小腸微粒體于37 ℃水浴鍋恒溫孵育10 min后，加入100 μL含20 nmol/L華法林的乙腈溶液，渦旋3 min，14 000 r/min離心30 min，取上清進(jìn)行UHPLC-MS/MS分析。使用GraphPad Prism 5軟件計(jì)算異莨菪亭的酶動力學(xué)參數(shù)，以代謝速率與底物濃度的比值（V/C）為橫坐標(biāo)，代謝速率（V）為縱坐標(biāo)，做Eaide-Hofstee圖，判斷異莨菪亭在小鼠肝微粒體和小腸微粒體中的代謝動力學(xué)模型。

3 結(jié)果

3.1 I-6-G的鑒定

異莨菪亭經(jīng)肝微粒體代謝后，可檢測到1個單葡萄糖醛酸化代謝物。如圖4所示，通過UHPLC-Q-TOF/MS負(fù)離子模式檢測，發(fā)現(xiàn)該代謝物的準(zhǔn)分子離子峰為m/z367.066 7[M－H]-，伴隨有特征碎片離子m/z191.034 5，即丟失1分子葡萄糖醛酸殘基（－176），與理論m/z367.067 1的誤差為1.09，推測該代謝物為I-6-G。

圖4 I-6-G的提取離子流質(zhì)譜圖Fig.4 Extracted ion chromatogram of I-6-G

3.2 異莨菪亭和I-6-G在小鼠體內(nèi)的藥動學(xué)

ig異莨菪亭（2 mg/kg）后，異莨菪亭和I-6-G在野生型FVB小鼠、Bcrp1-/-小鼠、Mrp2-/-小鼠和Bcrp1-/-/Mrp2-/-小鼠體內(nèi)的藥-時曲線見圖5，藥動學(xué)參數(shù)見表5。異莨菪亭在體內(nèi)吸收迅速，吸收后被快速代謝成I-6-G，在血漿中主要以I-6-G的形式暴露。異莨菪亭在野生型FVB小鼠、Bcrp1-/-小鼠、Mrp2-/-小鼠和Bcrp1-/-/Mrp2-/-小鼠的生物利用度分別為7.85%、3.54%、5.76%、10.27%。與野生型FVB小鼠相比，Bcrp1-/-小鼠體內(nèi)異莨菪亭的表觀分布容積（Vd）和清除率（CL/F）分別下降了67.02%、58.54%（P＜0.05）；Mrp2-/-小鼠體內(nèi)異莨菪亭的藥-時曲線下面積（AUC0～t）和達(dá)峰濃度（Cmax）分別增加了2.8、3.0倍，CL/F下降了78.8%（P＜0.05、0.001）；Bcrp1-/-/Mrp2-/-小鼠體內(nèi)異莨菪亭的AUC0～t增加了5.6倍，CL/F下降了86.8%（P＜0.05、0.01）。與野生型FVB小鼠相比，Bcrp1-/-小鼠體內(nèi)I-6-G的AUC0～t和半衰期（t1/2）分別增加了0.6、4.1倍（P＜0.05）；Mrp2-/-小鼠體內(nèi)I-6-G的AUC0～t和Cmax分別增加了1.0、1.2倍（P＜0.001）；Bcrp1-/-/Mrp2-/-小鼠體內(nèi)I-6-G的AUC0～t、Cmax和t1/2分別增加了8.2、3.5、1.6倍（P＜0.01、0.001）。

圖5 小鼠ig異莨菪亭后，異莨菪亭及I-6-G的血藥濃度-時間曲線 (±s , n=6)Fig.5 Plasma drug concentration-time curve of isoscopoletin and I-6-G in mice after ig isoscopoletin (±s , n=6)

表5 小鼠ig異莨菪亭后異莨菪亭及I-6-G的藥動學(xué)參數(shù) (±s , n=6)Table 5 Pharmacokinetic parameters of isoscopoletin and I-6-G in mice after ig isoscopoletin (±s , n=6)

表5 小鼠ig異莨菪亭后異莨菪亭及I-6-G的藥動學(xué)參數(shù) (±s , n=6)Table 5 Pharmacokinetic parameters of isoscopoletin and I-6-G in mice after ig isoscopoletin (±s , n=6)

與FVB野生型小鼠比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001*P ＜ 0.05 **P ＜ 0.01 ***P ＜ 0.001 vs FVB mice

參數(shù) 單位 異莨菪亭 I-6-G FVB Bcrp1-/- Mrp2-/- Bcrp1-/-/Mrp2-/- FVB Bcrp1-/- Mrp2-/- Bcrp1-/-/Mrp2-/-Cmax μmol·L-1 0.12±0.05 0.21±0.10 0.48±0.29* 0.32±0.09** 8.16±2.60 12.19±3.86 17.67±1.01*** 36.99±10.44**tmax min 8.33±5.53 7.60±4.36 8.00±5.00 16.00±8.60* 8.67±2.36 12.00±6.78 8.00±4.00 25.00±17.89**AUC0～t min·μmol·L-1 2.73±1.58 3.40±1.37 10.44±1.82*** 18.00±5.85** 340.92±112.05 565.08±103.43* 698.03±92.38*** 3 145.45±549.34***t1/2 min 21.00±11.08 17.16±9.92 44.72±17.01* 40.32±22.83 28.32±3.84 144.43±20.10* 48.51±34.51 74.09±17.35**MRT0～t min 19.00±6.29 17.66±6.80 37.54±6.86** 41.59±7.16** 33.13±3.50 44.87±17.65 35.05±5.80 76.95±20.51*Vd L·kg-1 10.34±4.25 3.41±1.53* 5.42±2.08* 2.97±1.78* — — — —CL/F mL·min-1·kg-1 0.41±0.23 0.17±0.11* 0.09±0.01* 0.05±0.01* — — — —

尾iv異莨菪亭（1 mg/kg）后，異莨菪亭和I-6-G在野生型FVB小鼠、Bcrp1-/-小鼠、Mrp2-/-小鼠和Bcrp1-/-/Mrp2-/-小鼠體內(nèi)的藥-時曲線見圖6，藥動學(xué)參數(shù)見表6。與野生型FVB小鼠相比，Bcrp1-/-小鼠體內(nèi)異莨菪亭的Vd下降了75%（P＜0.05）；Mrp2-/-小鼠體內(nèi)異莨菪亭的AUC0～t和CL/F分別增加了4.0、1.5倍（P＜0.01、0.001）；Bcrp1-/-/Mrp2-/-小鼠體內(nèi)異莨菪亭的AUC0～t和CL/F分別增加了3.8、2.5倍（P＜0.05、0.001）。與野生型FVB小鼠相比，Bcrp1-/-小鼠體內(nèi)I-6-G的AUC0～t增加了2.1倍（P＜0.01）；Mrp2-/-小鼠體內(nèi)I-6-G的t1/2增加了0.2倍（P＜0.001）；Bcrp1-/-/Mrp2-/-小鼠體內(nèi)I-6-G的AUC0～t增加了9.1倍（P＜0.01）。

表6 小鼠iv異莨菪亭后異莨菪亭及I-6-G的藥動學(xué)參數(shù) (±s , n=6)Table 6 Pharmacokinetic parameters of isoscopoletin and I-6-G in mice after iv isoscopoletin (±s , n=6)

表6 小鼠iv異莨菪亭后異莨菪亭及I-6-G的藥動學(xué)參數(shù) (±s , n=6)Table 6 Pharmacokinetic parameters of isoscopoletin and I-6-G in mice after iv isoscopoletin (±s , n=6)

與FVB野生型小鼠比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001*P ＜ 0.05 **P ＜ 0.01 ***P ＜ 0.001 vs FVB mice

參數(shù) 單位 異莨菪亭 I-6-G FVB Bcrp1-/- Mrp2-/- Bcrp1-/-/Mrp2-/- FVB Bcrp1-/- Mrp2-/- Bcrp1-/-/Mrp2-/-AUC0～t min·μmol·L-1 21.21±5.80 56.60±36.74 105.85±39.22** 103.06±74.10* 296.45±65.97 934.68±256.56** 326.83±59.37 3 006.22±944.97**t1/2 min 12.93±8.32 5.38±4.12 25.16±8.06* 12.76±5.01 25.27±0.87 32.28±5.41* 30.85±2.07*** 24.39±1.96 MRT0～t min 5.10±1.31 4.16±1.09 26.64±9.63* 12.74±5.52* 33.17±1.53 37.98±6.73 41.33±4.83** 49.30±10.36*Vd L·kg-1 0.44±0.25 0.11±0.11* 0.20±0.10 0.14±0.10* — — — —CL/F mL·min-1·kg-1 0.002±0.001 0.013±0.008 0.005±0.002*** 0.007±0.004*** — — — —

圖6 小鼠iv異莨菪亭，異莨菪亭及I-6-G的血藥濃度-時間曲線 (±s , n=6)Fig.6 Plasma drug concentration-time curve of isoscopoletin and I-6-G in mice after iv isoscopoletin (±s , n=6)

3.3 異莨菪亭在體腸灌流研究

異莨菪亭在小鼠十二指腸段和結(jié)腸段吸收和代謝特征如圖7所示，異莨菪亭在野生型FVB小鼠、Bcrp1-/-小鼠、Mrp2-/-小鼠和Bcrp1-/-/Mrp2-/-小鼠十二指腸段和結(jié)腸段的P*eff均高于1，表明異莨菪亭小鼠腸道內(nèi)的吸收較好。異莨菪亭在十二指腸段的P*eff高于結(jié)腸段，表明異莨菪亭在十二指腸段的吸收優(yōu)于結(jié)腸段。相比于野生型FVB小鼠，Bcrp1-/-小鼠、Mrp2-/-小鼠和Bcrp1-/-/Mrp2-/-小鼠體內(nèi)I-6-G外排入十二指腸腸腔的量下降了55.7%～58.4%（P＜0.05、0.01）；Bcrp1-/-/Mrp2-/-小鼠膽汁中異莨菪亭和I-6-G的累積量分別降低了90.3%、79.1%，Mrp2-/-小鼠膽汁中I-6-G的累積量下降了90.1%（P＜0.05）；Bcrp1-/-小鼠血漿中異莨菪亭的暴露量增加了3.5倍；Bcrp1-/-/Mrp2-/-小鼠血漿中異莨菪亭和I-6-G的暴露量分別增加了1.3、0.7倍（P＜0.05）。

圖7 異莨菪亭在小鼠腸灌流模型的吸收與代謝的特征 (±s , n=5)Fig.7 Absorption and metabolism of isoscopoletin in mouse intestinal perfusion model (±s , n=5)

3.4 異莨菪亭在小鼠肝微粒體和小腸微粒體中的葡萄糖醛酸化代謝特征

異莨菪亭經(jīng)野生型FVB小鼠、Bcrp1-/-小鼠、Mrp2-/-小鼠和Bcrp1-/-/Mrp2-/-小鼠肝微粒體和小腸微粒體孵育后，代謝生成I-6-G。如圖8所示，野生型FVB小鼠、Bcrp1-/-小鼠、Mrp2-/-小鼠和Bcrp1-/-/Mrp2-/-小鼠肝微粒體介導(dǎo)的異莨菪亭葡萄糖醛酸化反應(yīng)均符合米氏方程，由小腸微粒體介導(dǎo)的異莨菪亭葡萄糖醛酸化反應(yīng)均符合底物抑制方程。如表7所示，相比于野生型FVB小鼠，Bcrp1-/-小鼠、Mrp2-/-小鼠和Bcrp1-/-/Mrp2-/-小鼠肝微粒體中I-6-G的清除率（CLint）均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，小腸微粒體中I-6-G的CLint均增加了0.8倍（P＜0.05），表明外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BCRP和MRP2的缺失對異莨菪亭在小鼠體內(nèi)的葡萄糖醛酸化反應(yīng)速率影響較小。

圖8 異莨菪亭在小鼠肝微粒體 (A) 和小腸微粒體 (B) 中的酶動力學(xué)曲線 (±s , n=3)Fig.8 Enzyme kinetics of isoscopoletin in mouse liver microsomes (A) and intestinal microsomes (B) (±s , n=3)

表7 異莨菪亭在小鼠肝微粒體和小腸微粒體中的酶動力學(xué)參數(shù) (±s , n=3)Table 7 Enzyme kinetics parameters of isoscopoletin in mouse liver microsomes and intestine microsomes (±s , n=3)

表7 異莨菪亭在小鼠肝微粒體和小腸微粒體中的酶動力學(xué)參數(shù) (±s , n=3)Table 7 Enzyme kinetics parameters of isoscopoletin in mouse liver microsomes and intestine microsomes (±s , n=3)

與FVB野生型小鼠比較：*P＜0.05*P ＜ 0.05 vs FVB mice

組別 肝微粒體 小腸微粒體Vmax/(nmol·mg-1·min-1) Km/(μmol·L-1) CLint/(μL·mg-1·min-1) Vmax/(nmol·mg-1·min-1) Km/(μmol·L-1) CLint/(μL·mg-1·min-1)FVB 5.48±1.42 721.30±195.50 7.90±2.37 4.06±0.19 659.32±69.28 06.20±0.62 Bcrp1-/- 5.60±2.04 672.34±168.56 8.12±1.40 7.70±0.77 714.68±140.02 11.04±1.41*Mrp2-/- 3.86±1.39 521.03±95.32 8.05±3.74 3.83±0.37 346.19±74.10 11.44±2.17*Bcrp1-/-/Mrp2-/- 4.74±1.18 664.63±102.01 7.04±0.66 4.21±1.24 381.21±101.63 11.07±1.81*

4 討論

異莨菪亭是中藥秦皮的主要活性成分之一，具有多種藥理活性，目前關(guān)于異莨菪亭在體內(nèi)的處置特征及調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本研究開展了小鼠藥動學(xué)實(shí)驗(yàn)、在體腸灌流實(shí)驗(yàn)和酶動力學(xué)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)異莨菪亭在小鼠血漿中主要以葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物I-6-G的形式暴露，外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BCRP和MRP2對異莨菪亭及I-6-G的體內(nèi)處置具有調(diào)控作用。

ig異莨菪亭后在體內(nèi)吸收迅速，tmax且消除半衰期短，在野生型FVB小鼠、Bcrp1-/-小鼠、Mrp2-/-小鼠和Bcrp1-/-/Mrp2-/-小鼠血漿中I-6-G的AUC0～t顯著高于異莨菪亭的AUC0～t，表明異莨菪亭可以以原型形式透過細(xì)胞膜，進(jìn)而在體內(nèi)發(fā)生廣泛的葡萄糖醛酸化代謝。ig或尾iv異莨菪亭后，與野生型FVB小鼠相比，Mrp2-/-小鼠體內(nèi)異莨菪亭的AUC0～t顯著增加（P＜0.01、0.001），而Bcrp1-/-小鼠體內(nèi)異莨菪亭的AUC0～t無顯著性差異，表明異莨菪亭的體內(nèi)暴露主要由MRP2介導(dǎo)；Bcrp1-/-小鼠和Mrp2-/-小鼠體內(nèi)I-6-G的AUC0～t與野生型FVB小鼠相比均顯著增加（P＜0.05、0.01、0.001），表明I-6-G的外排受BCRP和MRP2調(diào)控，且BCRP和MRP2對I-6-G的外排作用相當(dāng)。在Bcrp1-/-/Mrp2-/-小鼠體內(nèi)，異莨菪亭和I-6-G的AUC0～t與野生型FVB小鼠相比均顯著增加（P＜0.05、0.01、0.001），且增加倍數(shù)遠(yuǎn)大于單敲除小鼠與野生型FVB小鼠的差異。以上結(jié)果表明，BCRP和MRP2對異莨菪亭及其代謝物I-6-G藥動學(xué)特征的影響呈協(xié)同互補(bǔ)的關(guān)系。外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BCRP和MRP2在腸和肝細(xì)胞的頂側(cè)面均有表達(dá)，對底物的外排呈相互協(xié)調(diào)和合作互補(bǔ)的作用[14-16]。當(dāng)BCRP和MRP2同時敲除后，他們之間的協(xié)同互補(bǔ)關(guān)系被打破，與Bcrp1-/-小鼠和Mrp2-/-小鼠相比，異莨菪亭和I-6-G受到的外排作用更小。

小鼠灌流異莨菪亭后，異莨菪亭在十二指腸段和結(jié)腸段的吸收程度較好（P*eff＞1），且不受外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BCRP或MRP2的影響，表明被動轉(zhuǎn)運(yùn)可能是異莨菪亭通過細(xì)胞膜的主要形式。小鼠腸上皮細(xì)胞中I-6-G外排入十二指腸腸腔的量高于外排入結(jié)腸腸腔的量，可能是由于十二指腸上皮細(xì)胞和結(jié)腸上皮細(xì)胞中UGT酶和外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（BCRP和MRP2）表達(dá)程度的不同引起的[17-18]。與野生型FVB小鼠相比，敲除外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BCRP和MRP2后，I-6-G外排入十二指腸腸腔和膽汁的量均顯著下降（P＜0.05、0.01），表明外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BCRP和MRP2參與I-6-G的外排。異莨菪亭酶動力學(xué)結(jié)果顯示，與野生型FVB小鼠相比，Bcrp1-/-小鼠、Mrp2-/-小鼠和Bcrp1-/-/Mrp2-/-小鼠肝微粒體中I-6-G的CLint無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，小腸微粒體中I-6-G的CLint均增加了0.8倍（P＜0.05），表明外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BCRP和MRP2的缺失對異莨菪亭在小鼠體內(nèi)的葡萄糖醛酸化反應(yīng)速率影響較小。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突