槐耳抗腫瘤活性部位篩選研究

黃 挺 楊 翀 徐志遠 程向東

槐耳是多孔菌科真菌槐栓菌Trametes robiniophila Murr.的干燥子實體，別名槐檽、槐菌、槐雞、槐蛾、赤雞等，主要分布于我國陜西、山東、河北等地[2]。臨床和基礎(chǔ)實驗證實，槐耳具有良好的抗腫瘤作用，對腫瘤的生長、增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移均具有抑制作用，能誘導(dǎo)惡性腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤血管生成，逆轉(zhuǎn)耐藥細胞株，增強化療藥物敏感性等療效明顯，且對正常細胞毒性小[1-8]。本研究主要探討槐耳不同提取物對不同腫瘤細胞的體外抑制作用，報道如下。

1 實驗材料

1.1 細胞株 人肝癌細胞HepG2、人肺癌細胞A549、人胰腺癌細胞PANC-1、人腸癌細胞HCT-116、人胃癌細胞MKN-45、人胃癌細胞BGC-823 細胞株，均來源于中國科學(xué)院生命科學(xué)研究院細胞庫。

1.2 藥品與試劑 槐耳藥材（浙江佐力百草中藥飲片有限公司，產(chǎn)于山東，批號20151001）經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與鑒定教研室陳孔榮教授鑒定，來源于山東，為多孔菌科真菌槐栓菌Trametes robiniophila Murr.的干燥子實體；槐耳顆粒（啟動蓋天力藥業(yè)有限公司，批號EJ14）；RPMI Medium Modified 1640（美國HyClone 公司，批號1676918）；胎牛血清FBS（Gibco，批號1616966）；胰蛋白酶-EDTA 消化液（美國Gibco 公司，批號21467 E16）；Cell Counting Kit-8（杭州諾揚生物有限公司，批號010417170406）；Phosphate Buffered Saline（美國HyCloneTM公司，批號NAH1449）；DMSO（Dimethyl Sulfoxide）（美 國Sigma-Aldrich 公司，批號WXBB8079V）。

1.3 主要儀器 十萬分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司，型號XS105）；千分之一電子天平（常州市幸運電子設(shè)備有限公司，型號JA203H）；百分之一天平（常州市幸運電子設(shè)備有限公司，型號XY2000C）；臺式冷凍多用離心機（Thermo Electron Corporation，型號CL31R）；超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司，型號KQ5200DE）；超低溫冰箱（Thermo Electron Corporation）；多 功 能 酶 標 儀（Thermo scientific，型號Varioskan Flash）；CO2細胞培養(yǎng)箱（Thermo Electron Corporation，型號3111）；倒置熒光顯微鏡（日本Nikon 公司，OLYMPUS CKX41SF）；生物安全柜（Thermo，型號1287）。

2 實驗方法

2.1 樣品制備 采用系統(tǒng)溶劑法依次、分段制樣，稱取干燥的槐耳子實體粉末10g，加入10 倍量石油醚加熱回流2 次，每次1h，提取液濃縮得到樣品A（槐耳石油醚浸膏）；提取后藥渣經(jīng)減壓濃縮，除去石油醚干燥后加入30 倍量90%乙醇，加熱回流2 次，每次2h，濃縮得到醇提液，濃縮得到樣品B（槐耳醇提浸膏）；醇提后藥渣經(jīng)干燥，除去乙醇，加入20 倍量蒸餾水回流3 次，每次2h，得到水提液，濃縮得到樣品C（槐耳水提浸膏）。

2.2 細胞培養(yǎng) 將冷凍保存的6 種人腫瘤細胞株復(fù)蘇后，HepG2、PANC-1 培養(yǎng)于含10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，A549、HCT-116、MKN-45、BGC-823 細胞株均培養(yǎng)于含10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中生長至80%細胞融合，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

2.3 體外抗腫瘤實驗及提取物再分離 采用CCK-8 法測定不同濃度梯度（16、8、4、2、1、0.5、0.25mg/mL）的槐耳各提取物（A、B、C、B+C、A+B+C）對各種人腫瘤細胞增殖抑制作用。根據(jù)細胞實驗結(jié)果，進而對槐耳乙醇提取物，依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶劑后，得到石油醚部位、三氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位。CCK-8 法觀察不同槐耳提取部位對人胃癌BGC-823 細胞增殖的影響。

2.4 腫瘤細胞處理 人胃癌BGC-823 細胞培養(yǎng)于含10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中生長至80%細胞融合，用0.1%胰酶溶液消化，制成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為5×104個/mL，均勻接種于96 孔微量培養(yǎng)板中，每組3 個復(fù)孔，100μL/孔，置37℃飽和濕度、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)24h 后，正常對照組加入含等量的培養(yǎng)液；加入濃度梯度的藥物，每100μL/孔，平行設(shè)5 個復(fù)孔，同時設(shè)置不添加細胞懸液為空白對照組，只加100μL 新鮮培養(yǎng)基，平行測定3 次。在同樣條件的培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24h，每孔加入10μL CCK-8 溶液，繼續(xù)孵育2h后停止培養(yǎng)，于多功能酶標儀上450nm 處測定各孔的光密度（OD）值，以正常對照組測得的OD 值為對照，按照抑制率公式計算槐耳各提取物組對于腫瘤細胞增殖的抑制效果，計算出IC50 值。抑制率=[1-（實驗組CCK-8 檢測OD 值-空白組OD）/（對照組CCK-8 檢測OD 值-空白組OD）]×100%。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，兩組間比較采用t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 槐耳不同提取物體外抗腫瘤結(jié)果 槐耳各提取物對6 種腫瘤細胞增殖抑制實驗均顯示48h 藥效較24h 藥效更佳。24h 細胞藥效實驗結(jié)果顯示，醇提和石油醚提取部位對胃癌細胞BGC-823 藥效最佳；水提、醇水雙提、石油醚+醇提+水提部位均表現(xiàn)出對腸癌細胞HCT-116 藥效最佳。48h 細胞藥效實驗結(jié)果顯示，水提和石油醚提取部位對胃癌細胞BGC-823藥效最佳；醇水雙提、石油醚+醇提+水提部位均表現(xiàn)出對腸癌細胞HCT-116 藥效最佳；醇提部位對肝癌HepG2 細胞藥效最佳。綜合分析得出槐耳各提取物均對胃癌細胞BGC-823 具有較好的抑制增殖作用，醇水雙提與石油醚+醇提+水提不存在顯著性差異。見表1。

表1 槐耳不同提取物對不同腫瘤細胞的增殖抑制作用（μg/mL，）

表1 槐耳不同提取物對不同腫瘤細胞的增殖抑制作用（μg/mL，）

注：A549 人非小細胞肺癌細胞系；HepG2 為人肝癌細胞；MKN-45 為人胃癌細胞；PANC-1 為人胰腺癌細胞；HCT-116 為人結(jié)腸癌細胞；BGC-823 為人胃腺癌細胞（低分化）；與24h 比較，aP＜0.05；與24h 水提、醇水雙提、石油醚+醇+水提比較，bP＜0.05；與24h 石油醚提、醇提比較，cP＜0.05；與48h 醇提、醇水雙提、石油醚+醇+水提比較，dP＜0.05；與48h 石油醚提、醇提、水提、石油醚+醇+水提比較，eP＜0.05；與48h 石油醚提、水提、醇水雙提、石油醚+醇+水提比較，fP＜0.05

3.2 槐耳醇提取物活性部位對BGC-823 細胞增殖抑制的結(jié)果 槐耳乙醇提取物對BGC-823 細胞的增殖抑制作用較石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取純化組藥效更佳（IC50 值最?。≒ 均<0.01）；作用時間48h 較24h 效果好（P 均<0.01）。見表2。

表2 槐耳醇提取物活性部位對BGC-823 細胞增殖抑制IC50 值（mg/mL，）

表2 槐耳醇提取物活性部位對BGC-823 細胞增殖抑制IC50 值（mg/mL，）

注：BGC-823 為人胃腺癌細胞（低分化）；與24、48h 石油醚萃取、氯仿萃取、乙酸乙酯萃取、正丁醇萃取比較，aP<0.01；與24h 比較，bP<0.01

4 討論

近年來，國內(nèi)外對中藥槐耳的研究集中在其水提取物上，即槐耳清膏與槐耳顆粒。2018 年《GUT》刊發(fā)了一項由我國39 家醫(yī)院共同開展的多中心隨機雙盲Ⅲ期肝癌臨床研究數(shù)據(jù)，結(jié)果提示槐耳可以降低腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)率、延長無復(fù)發(fā)生存期（RFS）[9]。另一項臨床研究表明，口服槐耳顆粒的乳腺癌患者可獲得更長的無病生存期，同時降低乳腺癌患者的血清腫瘤標志物水平，提高患者生存質(zhì)量[10]。

乙醇作為中藥的提取溶劑具有提取率高，回收簡便等特點，但乙醇對多糖等大極性化合物的提取能力較弱。因此，本實驗研究槐耳醇提物各部位的同時補充水提多糖部位的研究，以保證全面且充分的開展槐耳提取物抗腫瘤的研究?；倍煌崛∥飳Χ喾N腫瘤細胞具有增殖抑制作用，且對BGC-823 細胞具有最佳增殖抑制作用，BGC-823 細胞顯示作用時間48h 較24h 效果好，槐耳醇水雙提提取物IC50值最小，其次是醇提物，不同浸出部位之間有顯著差異。因此，選擇篩選出槐耳抗腫瘤活性最強的是醇水雙提提取物。而此前相關(guān)研究僅限于對槐耳水提物及其多糖成分，并未對槐耳的醇提部位進行成分分析，致使相關(guān)藥用部位被摒棄。

從槐耳各提取物對人胃癌BGC-823 細胞的增殖抑制試驗中，我們發(fā)現(xiàn)與醇提組作比較，萃取處理后的醇提物較醇提物抗腫瘤效果沒有增加，反而有下降趨勢，可能原因是萃取處理后雖然總黃酮、總?cè)萍兌仍黾樱嬲鹂鼓[瘤作用的不只總黃酮、總?cè)瞥煞?，或者萃取處理后藥材整體性遭到破壞，抗腫瘤成分之間的協(xié)同作用遭到破壞。目前槐耳醇提有效部位的具體成分還需進一步挖掘和鑒定，各成分之間是否存在協(xié)同作用需在后續(xù)實驗中得到證實。因此，后續(xù)實驗擬對槐耳醇提取物中的有效成分進一步分析，并為研究槐耳醇提取物有效單體成分抗腫瘤機制的研究奠定基礎(chǔ)。