MTHFR基因C677T多態(tài)性與冠狀動(dòng)脈支架植入術(shù)后再狹窄的相關(guān)性研究

陳寧，孫婷，陳明

經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（PCI）是臨床治療冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病（冠心?。┑挠行侄危Ъ苤踩牒竽軌蛴行г黾庸跔顒?dòng)脈（冠脈）血流、減輕心肌缺血癥狀。術(shù)后發(fā)生支架內(nèi)再狹窄是影響PCI效果的重要因素，傳統(tǒng)金屬裸支架植入后6個(gè)月內(nèi)再狹窄的發(fā)生率約20%～30%，使用藥物涂層支架后再狹窄的發(fā)生率雖有所下降、但仍會(huì)對(duì)患者的遠(yuǎn)期預(yù)后造成不利影響。PCI后再狹窄的發(fā)生與支架植入對(duì)冠脈局部血管壁、內(nèi)膜等結(jié)構(gòu)的損害有關(guān)，結(jié)構(gòu)損害局部再內(nèi)皮化不足、血管平滑肌細(xì)胞過度增殖會(huì)逐步引起管腔再狹窄[1,2]。炎癥反應(yīng)是目前已知參與心血管疾病各個(gè)環(huán)節(jié)的病理因素，同時(shí)也被證實(shí)與內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血管平滑肌細(xì)胞增殖有關(guān)，多項(xiàng)研究報(bào)道：血清炎癥指標(biāo)超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）、血清淀粉樣蛋白AA（SAA）、高遷移率族蛋白B1（HMBG1）、白介素-33（IL-33）的升高與PCI后支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生有關(guān)的[3-5]，但調(diào)控再狹窄過程中炎癥反應(yīng)的機(jī)制仍未明確。

高同型半胱氨酸（Hcy）血癥是近年來新發(fā)現(xiàn)的心血管疾病危險(xiǎn)因素，Hcy是甲硫氨酸代謝過程的副產(chǎn)物，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有損害作用、對(duì)炎癥反應(yīng)具有刺激作用。亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）是參與甲硫氨酸循環(huán)調(diào)節(jié)的催化酶，MTHFR催化活性的改變會(huì)造成Hcy水平升高。MTHFR基因在多個(gè)位點(diǎn)存在多態(tài)性，其中C677T位點(diǎn)多態(tài)性會(huì)使編碼產(chǎn)物中的丙氨酸被纈氨酸取代并改變編碼產(chǎn)物的催化活性[6]，該多態(tài)性已被證實(shí)是冠心病發(fā)生的危險(xiǎn)因素，但與支架植入后再狹窄的關(guān)系尚未明確。本研究具體分析了MTHFR基因C677T多態(tài)性與冠脈支架植入術(shù)后再狹窄的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象選擇2018年1月～2019年6月于解放軍第九六〇醫(yī)院心內(nèi)科接受PCI的160例冠心病患者為研究對(duì)象，入組標(biāo)準(zhǔn)：①冠脈前降支、回旋支、右冠中至少1支狹窄70%以上；②PCI后靶血管管腔擴(kuò)大、殘余狹窄＜30%；③隨訪時(shí)間6個(gè)月以上。排除標(biāo)準(zhǔn)：①服用葉酸、維生素B12等影響Hcy代謝藥物的患者；②合并結(jié)締組織病、惡性腫瘤的患者。根據(jù)PCI后6個(gè)月時(shí)冠脈CTA的結(jié)果進(jìn)行分組，支架內(nèi)狹窄≥50%的患者為再狹窄組、＜50%的患者為無再狹窄組。再狹窄組64例，其中男性36例，女性28例，年齡42～62歲、平均55.51±7.84歲，吸煙33例，合并高血壓35例、糖尿病25例；無再狹窄組96例，其中男性54例，女性42例，年齡40～63歲、平均54.57±8.12歲，吸煙37例，合并高血壓34例、糖尿病27例。兩組間一般資料比較無顯著性差異（P＞0.05）。

1.2 MTHFR基因C677T多態(tài)性檢測(cè)方法PCI前采集肘靜脈血2 ml，枸椽酸鈉抗凝后采用基因組DNA提取試劑盒提取肘靜脈血中的基因組DNA，設(shè)計(jì)MTHFR基因C677T位點(diǎn)的引物后配置PCR反應(yīng)體系，模板DNA 2 μl、2XMaster Mix 25 μl、引物各2 μl 、去離子水補(bǔ)足至50 μl。按照94 ℃變性45 s，60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸45 s的PCR程序反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，取PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果判斷多態(tài)性。

1.3 再狹窄特征的觀察PCI后6個(gè)月時(shí)，采用64排雙源CT儀進(jìn)行冠脈CTA檢查，掃描范圍為主動(dòng)脈弓肺動(dòng)脈節(jié)段起始、至膈肌下1 cm為止；將感興趣區(qū)設(shè)置在升主動(dòng)脈、當(dāng)CT值達(dá)到100 HU時(shí)觸發(fā)

2 結(jié)果

2.1 再狹窄組、無再狹窄組患者M(jìn)THFR基因C677T多態(tài)性的比較再狹窄組患者M(jìn)THFR基因C677T位點(diǎn)CT+TT基因型的比例及T等位基因的比例明顯高于無再狹窄組，CC基因型的比例及C等位基因的比例明顯低于無再狹窄組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表1。

表1 再狹窄組、無再狹窄組患者M(jìn)THFR基因C677T多態(tài)性的比較

2.2 再狹窄組中不同MTHFR基因C677T多態(tài)性患者再狹窄特征的比較再狹窄組中MTHFR基因C677T位點(diǎn)CT+TT基因型患者的支架內(nèi)膜覆蓋面積、支架內(nèi)膜覆蓋面積百分比、最大內(nèi)膜組織覆蓋厚度均明顯高于CC基因型患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表2。

表2 再狹窄組中不同MTHFR基因C677T多態(tài)性患者再狹窄特征的比較

2.3 再狹窄組中不同MTHFR基因C677T多態(tài)性患者血清實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的比較再狹窄組中MTHFR基因C677T位點(diǎn)CT+TT基因型患者的血清Hcy、hs-CRP、SAA、HMGB1、IL-37含量明顯高于CC基因型患者，F(xiàn)A、VitB12含量明顯低于CC基因型患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表3。

表3 再狹窄組中不同MTHFR基因C677T多態(tài)性患者實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的比較

3 討論

掃描，掃描參數(shù)為電壓120 kV、電流280 mA、層厚0.75 mm、機(jī)架旋轉(zhuǎn)時(shí)間0.28 s、球管旋轉(zhuǎn)時(shí)間0.33 s/r。將圖像信息錄入影像工作站后，計(jì)算支架內(nèi)膜覆蓋面積、支架內(nèi)膜覆蓋面積百分比、最大內(nèi)膜組織覆蓋厚度。

1.4 血清指標(biāo)檢測(cè)PCI前采集肘靜脈血3～5 ml后離心分離血清，采用酶循環(huán)法試劑盒測(cè)定葉酸（FA）、維生素B12（VitB12）的含量，酶聯(lián)免疫吸附試劑盒測(cè)定超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）、血清淀粉樣蛋白A（SAA）、高遷移率族蛋白B1（HMGB1）、白介素-37（IL-37）的含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0軟件統(tǒng)計(jì)及分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差不表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用百分比表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

支架內(nèi)再狹窄直接影響冠心病患者PCI的療效，支架局部再內(nèi)皮化不足、血管平滑肌細(xì)胞過度增殖是與再狹窄發(fā)生密切相關(guān)的因素[7,8]。支架植入后能夠有效擴(kuò)張冠脈管腔、恢復(fù)心肌血供，但會(huì)造成局部血管內(nèi)膜損傷，內(nèi)皮細(xì)胞在內(nèi)膜損傷部位浸潤能夠完成再內(nèi)皮化、保證局部內(nèi)膜結(jié)構(gòu)完整；而當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞在炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等作用下發(fā)生損傷時(shí)，再內(nèi)皮化過程無法正常完成，再內(nèi)皮化不足會(huì)增加血小板在局部黏附、活化并形成血栓的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)而逐步形成支架內(nèi)再狹窄。支架局部再內(nèi)皮化不足有利于血管平滑肌細(xì)胞的黏附，在炎癥細(xì)胞因子的刺激下血管平滑肌細(xì)胞不斷增殖，進(jìn)而加重支架內(nèi)狹窄的程度。炎癥反應(yīng)在再內(nèi)皮化障礙及血管平滑肌細(xì)胞增殖中均起到重要作用，因而hs-CRP、SAA、HMGB1、IL-37等炎癥指標(biāo)的升高也被用于預(yù)測(cè)PCI后支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)大[9,10]，但再狹窄過程中炎癥反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制并未完全闡明。

高Hcy血癥是近年來新發(fā)現(xiàn)的心腦血管疾病危險(xiǎn)因素，Hcy能夠通過促炎、增加自由基生成、促凋亡等多個(gè)途徑參與粥樣斑塊形成[11,12]。Hcy是甲硫氨酸代謝循環(huán)中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，在輔因子FA、VitB12存在的條件下被甲硫氨酸合成酶轉(zhuǎn)化為甲硫氨酸，當(dāng)以上代謝途徑發(fā)生異常時(shí)，Hcy發(fā)生蓄積、含量升高。MTHFR是參與甲硫氨酸代謝循環(huán)的催化酶，能夠?qū)?, 10-二甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)化為有生物學(xué)活性的5-甲基四氫葉酸并在Hcy合成為甲硫氨酸的過程中提供甲基。MTHFR的編碼基因在C677T位點(diǎn)具有多態(tài)性，容易出現(xiàn)C向T的突變，發(fā)生突變后編碼產(chǎn)物的丙氨酸被纈氨酸取代、催化活性明顯下降[13,14]。MTHFR具有C677T多態(tài)性已經(jīng)被證實(shí)與冠心病的發(fā)生有關(guān)，本研究分析了該多態(tài)性與支架內(nèi)再狹窄的關(guān)系，結(jié)果顯示：再狹窄組患者M(jìn)THFR基因C677T位點(diǎn)CT+TT基因型的比例及T等位基因的比例明顯高于無再狹窄組，CC基因型的比例及C等位基因的比例明顯低于無再狹窄組。進(jìn)一步分析支架內(nèi)再狹窄患者M(jìn)THFR基因C677T多態(tài)性與再狹窄特征的關(guān)系可知：發(fā)生C向T突變的CT+TT基因型患者具有更大的支架內(nèi)膜覆蓋面積、支架內(nèi)膜覆蓋面積百分比、最大內(nèi)膜組織覆蓋厚度。這一結(jié)果提示MTHFR基因C677T位點(diǎn)C向T突變?cè)龆嗯c支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生密切相關(guān)且會(huì)加重狹窄的嚴(yán)重程度。

MTHFR基因C677T多態(tài)性直接影響編碼產(chǎn)物的催化活性，進(jìn)而使Hcy代謝過程受到影響。Hcy代謝過程中Hcy升高及VitB12、FA減少已被證實(shí)與PCI后的支架內(nèi)再狹窄有關(guān)，本研究進(jìn)一步分析了支架內(nèi)再狹窄患者M(jìn)THFR基因C677T多態(tài)性與Hcy代謝的關(guān)系后發(fā)現(xiàn)：發(fā)生C向T突變的CT+TT基因型患者的血清Hcy含量明顯升高，F(xiàn)A、VitB12含量明顯降低，提示支架內(nèi)再狹窄患者M(jìn)THFR基因C677T位點(diǎn)C向T的突變能夠影響Hcy代謝，引起Hcy增多。Hcy具有較強(qiáng)的促炎活性，通過刺激hs-CRP、SAA、HMGB1、IL-37等炎癥指標(biāo)的升高來影響再狹窄過程中的再內(nèi)皮化、血管平滑肌細(xì)胞增殖。hs-CRP、SAA是由肝臟合成并分泌的炎癥標(biāo)志物，HMGB1和IL-37是單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞分泌的具有促炎活性的細(xì)胞因子[15,16]，本研究對(duì)支架內(nèi)再狹窄患者M(jìn)THFR基因C677T多態(tài)性與炎癥指標(biāo)的關(guān)系進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示：發(fā)生C向T突變的CT+TT基因型患者的血清hs-CRP、SAA、HMGB1、IL-37含量明顯升高，提示支架內(nèi)再狹窄患者M(jìn)THFR基因C677T位點(diǎn)C向T的突變能夠在增加Hcy含量的基礎(chǔ)上激活炎癥反應(yīng)、刺激多種炎癥自指標(biāo)大量釋放。

綜上所述，MTHFR基因C677T位點(diǎn)C向T的突變與冠狀動(dòng)脈支架植入術(shù)后再狹窄的發(fā)生密切相關(guān)，該突變能夠影響Hcy代謝、增加Hcy含量并激活炎癥反應(yīng)。本研究的局限之處在于未對(duì)冠脈支架植入術(shù)的預(yù)后進(jìn)行長期隨訪，未能闡明MTHFR基因C677T位點(diǎn)多態(tài)性與長期預(yù)后的關(guān)系。