微小RNA-124-3p對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠心肌線粒體功能和PI3K/AKT信號(hào)通路的調(diào)控作用

吳哲，鄒彩霞，廖鋒

高血壓導(dǎo)致的心肌細(xì)胞超負(fù)荷工作會(huì)引起心室重塑、心臟肥大等影響射血功能，甚至發(fā)展為心力衰竭。目前關(guān)于高血壓引起的心肌細(xì)胞損傷的機(jī)制仍不清楚[1]。ATP是心肌細(xì)胞的主要能量來源，由線粒體產(chǎn)生。當(dāng)心肌細(xì)胞超負(fù)荷工作時(shí)會(huì)導(dǎo)致活性氧自由基的累積激活線粒體凋亡途徑，導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷和凋亡[2]。PI3K/AKT對(duì)高血壓造成的器官損傷具有保護(hù)作用，研究顯示PI3K/AKT通路過表達(dá)可抑制緩解血管緊張素誘導(dǎo)的H9c2心肌母細(xì)胞凋亡[3]。研究顯示PI3K/AKT通路通過緩解線粒體損傷抑制心肌細(xì)胞凋亡[4]。微小RNA（miRNA）是一種長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的、高度保守的單鏈RNA，可在轉(zhuǎn)錄后的水平上導(dǎo)致信使RNA（mRNA）的降解或者翻譯抑制[5]。最新研究顯示miR-124-3p通過抑制PI3K/AKT通路誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞的凋亡[6]。研究顯示抑制miR-124-3p可通過抑制心肌細(xì)胞的凋亡來緩解急性心肌梗塞[7]。本文分析miR-124-3p在自發(fā)性高血壓（SHR）大鼠心肌線粒體凋亡中的作用及其對(duì)PI3KAKT信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制。

1 主要材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料SHR大鼠（45只）和健康的同源性WKY大鼠（15只）雄性SPF級(jí)，190～210 g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，中國。miR-124-3p激動(dòng)劑（agomir）和抑制劑（antagomir），廣州瑞博生物技術(shù)有限公司。HE染色試劑盒（C0105S）、ELISA和TUNEL染色試劑盒來自（碧云天公司，中國）。Hoechst 33258（Sigma，美國）。RNAspin Mini和miRNeasy Mini試劑盒（GE Healthcare，美國）。Bestar qPCR RT和Bestar?qPCR試劑盒（DBI Bioscience公司，德國）。TaqMan miRNA試劑盒（Thermo Fisher公司，美國）?？贵w、一抗和山羊抗免疫球蛋白G（IgG）二抗（1：1000稀釋，#ab6721）購于（Abcam公司，美國）。硝酸纖維素膜（EMD Millipore，美國）。ECL 顯色試劑盒（Thermo Fisher公司，美國）。顯微鏡（Carl Zeiss公司，德國）。心肌細(xì)胞H2c9（ATCC，美國）。DMEM培養(yǎng)基和抗體（Gibco公司，美國）。Lipofectamine?3000（Invitrogen公司，USA）。pGL4熒光素酶載體（Promega公司，美國）。miR-124-3p類似物（mimic）、相應(yīng)的陰性對(duì)照（NC）、快速定點(diǎn)誘變?cè)噭┖泻蚏enilla熒光素酶質(zhì)粒（Thermo Fisher公司，美國）。熒光素酶報(bào)告試劑盒和檢測(cè)儀1000 System（Promega公司，美國）。

1.2 分組45只大鼠分為SHR組、SHR+miR-124-3p agomir和SHR+miR-124-3p antagomir組（eachn=15），另選15只健康大鼠作為對(duì)照組。SHR+miR-124-3p agomir和SHR+miR-124-3p antagomir分別尾靜脈注射miR-124-3p agomir和miR-124-3p antagomir，以提高和抑制心肌細(xì)胞中miR-124-5p的水平[8]，300 μg/次，連續(xù)4周。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)和方法

1.3.1 RT-qPCR對(duì)于PI3K和AKT mRNA，使用RNeasy Mini試劑盒取心肌組織中的總RNA，Bestar qPCR RT試劑盒將其逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄為cDNA，條件如下：37℃/15 min；98℃/5 min，使用Bestar?qPCR預(yù)混液進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)，條件如下：95℃/2 min，94℃/20 s，58℃/20 s，72℃/20 s，40個(gè)循環(huán)，在72℃下延伸4 min。使用Agilent Stratagene Mx3000P序列檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行RT-qPCR分析。通過比較循環(huán)閾值并以GAPDH作為內(nèi)參計(jì)算PI3K和AKT mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

對(duì)于miR-124-3p，使用miRNeasy Mini試劑盒提取總miRNA，通過TaqMan miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒形成cDNA。然后使用TaqMan miRNA分析試劑盒測(cè)量miRNA的表達(dá)水平。比較循環(huán)閾值并以U6作為內(nèi)參計(jì)算miR-124-3p相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.2 ELISA檢測(cè)血清指標(biāo)應(yīng)用ELISA檢測(cè)心肌酶指標(biāo)。大鼠安樂死前采集尾靜脈血液樣本，離心（2000 rpm，20 min）后收集上層血清。根據(jù)說明書加入抗體和顯色劑，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）濃度。

1.3.3 HE染色評(píng)估心肌細(xì)胞損傷大鼠安樂死后去除心肌組織，在10%福爾馬林中固定48 h，經(jīng)過脫蠟、包埋、切片，切片水化后制成玻片標(biāo)本，加入蘇木精孵育5 min，0.5%伊紅染色5 min，洗滌后透化，固定，在顯微鏡下觀察。

1.3.4 TUNEL檢測(cè)凋亡將1.3.2中切片脫蠟并與蛋白酶K孵育。按TUNEL試劑盒說明書進(jìn)行染色，Hoechst 33258對(duì)細(xì)胞核復(fù)染。復(fù)染后熒光顯微鏡下觀察拍照，凋亡細(xì)胞呈熒光綠色，200倍放大，隨機(jī)選擇10個(gè)視野計(jì)數(shù)。

1.3.5 Western blot檢測(cè)線粒體凋亡相關(guān)蛋白將心肌組織裂解后收集總蛋白。通過8%的SDSPAGE分離每個(gè)樣品中等量（50 μg）的蛋白質(zhì)，將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。將5%脫脂牛奶完全浸沒硝酸纖維素膜來封閉非特異性抗原（室溫下2 h），將膜與分別與一抗（1:800稀釋）4℃孵育過夜，將山羊抗免IgG二抗按照1:2000比例稀釋在室溫下孵育1 h進(jìn)行反應(yīng)?；瘜W(xué)發(fā)光試劑顯示，使用Quantum One軟件分析灰度計(jì)算細(xì)胞色素C（Cyt C）、caspase9、cleaved-caspase3、PI3K和AKT蛋白相對(duì)于GAPDH的表達(dá)量。

1.4 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-124-3p和PI3K的靶向關(guān)系

1.4.1 雙熒光素酶報(bào)告miR-124-3p和PI3K的堿基結(jié)合位點(diǎn)通過工具網(wǎng)站得到（http://www.targetscan.org/vert_72/）。對(duì)于PI3K與miR-124-3p靶向的驗(yàn)證，將野生型（wt-）的PI3K mRNA的3’-UTR序列擴(kuò)增到pGL4熒光素酶載體的下游位點(diǎn)，使用快速定點(diǎn)誘變?cè)噭┖猩赏蛔冃停╩ut-）PI3K。將H2c9細(xì)胞以3×104/孔的密度接種在24孔板中，24 h后，使用Lipofectamine?2000將1 μg的wt-PI3K或mut-PI3K熒光素酶質(zhì)粒、50 nM的miR-124-3p mimic或 miR-124-3p NC、150 ng的Renilla熒光素酶質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞。將細(xì)胞在37℃下孵育36 h。使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性。所有數(shù)據(jù)均以Renilla熒光素酶活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.4.2 細(xì)胞分組和處理將H2c9細(xì)胞在DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，環(huán)境條件為5%CO2、37℃和95%濕度，培養(yǎng)基含有10%的胎牛血清、100 mg/ml的鏈霉素和100 U/ml的青霉素。將細(xì)胞在5%CO2培養(yǎng)箱中于37℃和95%濕度下培養(yǎng)。細(xì)胞分為miR-124-3p NC組和miR-124-3p mimic組，細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-124-3p NC和miR-124-3p mimic，按說明書利用LipofectamineTM 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染條件為7℃和5%CO2，48 h后收集細(xì)胞。檢測(cè)miR-124-3p，通過Western blot檢測(cè)PI3K蛋白。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19.0軟件。多組間進(jìn)行方差分析，兩兩比較使用SNK-q檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）表示。每個(gè)檢測(cè)設(shè)立3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組miR-124-3p水平比較對(duì)照組、SHR組、SHR+miR-124-3p agomir和SHR+miR-124-3p antagomir組大鼠心肌組織中的miR-124-3p水平分別為（0.87±0.12）、（2.56±0.38）、（4.51±0.86）和（1.13±0.16）。SHR大鼠心肌組織中miR-124-3p水平升高，且通過agomir和antagomir提高和降低心肌細(xì)胞中miR-124-3p水平。

2.2 miR-124-3p對(duì)大鼠心肌酶指標(biāo)的影響四組大鼠外周血中心肌酶指標(biāo)比較差異顯著（P＜0.05）。SHR組的LDH（1982.35±207.44）IU/L和CK-MB（942.55±107.62）IU/L顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。SHR+miR-124-3p agomir組的LDH（2371.92±244.26）IU/L和CK-MB（1301.42±135.49） IU/L顯著高于SHR組（P＜0.05）。SHR+miR-124-3p antagomir組的LDH（1624.43±176.31） IU/L和CK-MB（722.41±78.43）IU/L顯著低于SHR組（P＜0.05）。

2.3 miR-124-3p對(duì)SHR大鼠心肌組織的影響對(duì)照組心肌細(xì)胞染色均勻，細(xì)胞核飽滿，細(xì)胞成纖維狀且緊密排列；SHR組大鼠心肌細(xì)胞染色不均勻，細(xì)胞腫脹，緊密排列紊亂；SHR+miR-124-3p agomir組心肌細(xì)胞損傷情況加?。籗HR+miR-124-3p antagomir組的心肌組織損傷情況較SHR組有所緩解，排列較為緊密有序（圖1）。

圖1 miR-124-3p對(duì)SHR大鼠心肌組織損傷的影響（×200）

2.4 miR-124-3p對(duì)SHR大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響四組大鼠細(xì)胞的心肌細(xì)胞凋亡情況比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。SHR組凋亡細(xì)胞數(shù)目（27.18±2.10）個(gè)顯著高于對(duì)照組。SHR+miR-124-3p agomir組凋亡細(xì)胞數(shù)目（52.76±3.56）個(gè)顯著高于SHR組。SHR+miR-124-3p antagomir組凋亡細(xì)胞數(shù)目（11.85±0.97）個(gè)，顯著低于SHR組。

2.5 miR-124-3p的水平對(duì)SHR大鼠心肌細(xì)胞線粒體凋亡途徑的影響四組大鼠心肌組織中線粒體凋亡途徑標(biāo)志蛋白水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。SHR組的Cyt C、caspase9和cleaved-caspase3蛋白表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。與SHR組比較，SHR+miR-124-3p agomir組的Cyt C、caspase9和cleaved-caspase3蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），而SHR+miR-124-3p antagomir組顯著降低（P＜0.05）（圖3）。

圖2 miR-124-3p對(duì)SHR大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響（×200）

圖3 提高和降低miR-124-3p的水平對(duì)Cyt C、caspase9和cleavedcaspase3表達(dá)量的影響

2.6 miR-124-3p的水平對(duì)SHR大鼠PI3K/AKT的影響四組SHR大鼠心肌細(xì)胞中PI3K/AKT通路水平比較差異顯著。SHR組的PI3K和AKT mRNA和蛋白表達(dá)量顯著低于對(duì)照組。SHR+miR-124-3p agomir組的PI3K和AKT mRNA和蛋白表達(dá)量顯著低于SHR組。SHR+miR-124-3p antagomir組的PI3K和AKT mRNA和蛋白表達(dá)量顯著高于SHR組（圖4）。

圖4 miR-124-3p的水平對(duì)SHR大鼠心肌細(xì)胞中PI3K和AKT蛋白表達(dá)量的影響

2.7 miR-124-3p與PI3K的靶向關(guān)系通過雙熒光素酶報(bào)告在NCI-N87細(xì)胞中驗(yàn)證miR-124-3p靶向PI3K mRNA。PI3K是由PIK3CA基因編碼的，結(jié)果顯示同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-124-3p mimic和wt-PI3K后細(xì)胞中相對(duì)熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05），提示miR-124-3p與PI3K靶向結(jié)合。

2.8 miR-124-3p對(duì)PI3K表達(dá)的影響miR-124-3p mimic組的miR-124-3p水平（5.76±0.54）顯著高于NC組（0.94±0.09）（P＜0.05），提示轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)成功。miR-124-3p mimic組的PI3K mRNA（0.95±0.09）和蛋白（0.52±0.05）的表達(dá)水平顯著低于miR-124-3p NC組（3.78±0.35vs. 2.13±0.20），（P＜0.05）。

3 討論

血壓升高會(huì)引起心肌機(jī)械壓力異常、神經(jīng)激素改變、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子表達(dá)異常，使心肌耗氧量增加和凋亡，最終導(dǎo)致心室功能障礙[9]。

miRNA是在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)水平的重要途徑，miRNA通過堿基互補(bǔ)配對(duì)方式識(shí)別mRNA的3’端的非翻譯區(qū)域（UTR）并誘導(dǎo)mRNA降解和翻譯抑制[10]。最近研究顯示miRNA在高血壓和心臟疾病中發(fā)揮重要作用，可能成為評(píng)估高血壓相關(guān)心力衰竭的臨床標(biāo)志因子[11]。miR-124-p通過調(diào)節(jié)核受體亞家族3C組成員的表達(dá)導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷促進(jìn)高血壓[12]。在血管緊張素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中，miR-124-3p升高可促進(jìn)細(xì)胞中活性氧自由基的水平，導(dǎo)致細(xì)胞損傷和凋亡[13]。Zhao等[14]研究結(jié)果顯示miR-124-3p會(huì)導(dǎo)致心臟重構(gòu)加劇心力衰竭。本研究結(jié)果顯示與健康大鼠比較，SHR心肌組織中的miR-124-3p水平上調(diào)。提高心肌組織中的miR-124-3p水平會(huì)加劇SHR大鼠的心肌損傷和心肌細(xì)胞凋亡，而抑制miR-124-3p水平會(huì)緩解心肌損傷抑制心肌細(xì)胞凋亡。Liu等[15]研究顯示miR-124-3p促進(jìn)缺血/再灌注引起的心肌細(xì)胞凋亡。Han等[16]發(fā)現(xiàn)miR-124調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和缺氧反應(yīng)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡參與心肌梗塞，提示降低miR-124-3p的水平會(huì)緩解高血壓導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷和凋亡。

由高血壓引起的心肌耗氧量增加會(huì)引起活氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致線粒體功能異常，線粒體中的Cyt C釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)并激活凋亡執(zhí)行蛋白cleaved caspase3蛋白導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[17]。提高PI3K/AKT通路水平能夠減弱氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的線粒體依賴性細(xì)胞凋亡[18]。本研究結(jié)果顯示提高miR-124-3p進(jìn)一步抑制PI3K/AKT通路促進(jìn)線粒體凋亡，而抑制miR-124-3p會(huì)緩解以上影響。miR-124通過調(diào)控的PI3K/AKT途徑改善缺血后神經(jīng)元的軸突生長(zhǎng)[19]，提示抑制miR-124-3p的表達(dá)能夠恢復(fù)PI3K/AKT通路水平，從而緩解氧化應(yīng)激保護(hù)線粒體功能，抑制心肌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，SHR大鼠心肌組織中miR-124-3p升高，miR-124-3p的水平會(huì)抑制PI3K/AKT加劇線粒體凋亡途徑，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡。但關(guān)于miR-124-3p在高血壓心肌病中的臨床意義及高血壓誘導(dǎo)miR-124-3p過表達(dá)的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。