漁業(yè)養(yǎng)殖水體中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物殘留量的檢測(cè)方法研究

楊盈悅，朱羽莊，梅光明，李晉成

（1.浙江海洋大學(xué) 食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 舟山316021；2.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江 舟山316021；3.浙江省海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山316021；4.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院，北京100141）

孔雀石綠和結(jié)晶紫是人工合成的三苯甲烷類(lèi)染料，由于價(jià)格低廉且具有較好的驅(qū)蟲(chóng)和殺菌效果，曾在水產(chǎn)養(yǎng)殖中被廣泛用于環(huán)境消毒和治療水霉病、腮霉病等［1-2］?？兹甘G和結(jié)晶紫容易代謝轉(zhuǎn)化為化學(xué)性質(zhì)更穩(wěn)定、毒性更強(qiáng)的隱色孔雀石綠和隱色結(jié)晶紫，在生物體和環(huán)境中代謝緩慢、殘留時(shí)間長(zhǎng)。研究表明，孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物均致癌、致畸和致突變［3-4］，因此，包括我國(guó)在內(nèi)的很多國(guó)家都將孔雀石綠和結(jié)晶紫列為禁用藥物［5］。由于孔雀石綠和結(jié)晶紫曾被廣泛使用，造成部分養(yǎng)殖環(huán)境被污染，經(jīng)常有養(yǎng)殖戶(hù)反映，在養(yǎng)殖過(guò)程中并未使用孔雀石綠類(lèi)藥物，卻在產(chǎn)品中被檢出，推測(cè)可能由環(huán)境中的歷史殘留引起。目前，對(duì)孔雀石綠的監(jiān)測(cè)主要集中在水產(chǎn)品終端［6-8］，對(duì)漁業(yè)養(yǎng)殖水體環(huán)境中的孔雀石綠類(lèi)污染狀況關(guān)注較少。為監(jiān)測(cè)并掌握孔雀石綠污染情況，保障養(yǎng)殖水產(chǎn)品的質(zhì)量安全，有必要建立一套對(duì)養(yǎng)殖水體中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物的檢測(cè)方法。

水體中孔雀石綠的常用檢測(cè)方法有液相色譜法［9-11］、酶聯(lián)免疫法［12］、液質(zhì)聯(lián)用法［13-15］、熒光探針?lè)ǎ?6?17］、納米電化學(xué)傳感器法［18］等。其中，液質(zhì)聯(lián)用法無(wú)論在定性判斷上或在定量的準(zhǔn)確性上均具絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，其他方法存在特異性不強(qiáng)、容易出現(xiàn)假陽(yáng)性和檢測(cè)限較高等缺點(diǎn)，且現(xiàn)有方法中可檢測(cè)到的目標(biāo)物很少能覆蓋孔雀石綠和結(jié)晶紫及其代謝物4種組分。本文以二氯甲烷液液萃取結(jié)合活塞式中性氧化鋁分散固相萃取凈化，以氘代同位素物為內(nèi)標(biāo)物，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)養(yǎng)殖水體中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物殘留量的快速準(zhǔn)確檢測(cè)，為對(duì)漁業(yè)養(yǎng)殖水體的環(huán)境監(jiān)測(cè)提供了方法和分析手段。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)所用儀器為ACQUITY H-Class UPLC–xevo TQS串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters公司）；Centrifuge 5810高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司出品）；MS2漩渦混合器（德國(guó)IKA公司）。

實(shí)驗(yàn)所用試劑為Milli-Q超純水系統(tǒng)制備的高純水；乙腈（色譜純，Merk公司）；甲酸（色譜純，sigma公司）；乙酸銨（色譜純，美國(guó)TEDIA公司）；鹽酸羥胺（分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)公司）；孔雀石綠（MG）、隱色孔雀石綠（LMG）、結(jié)晶紫（CV）和隱色結(jié)晶紫（LCV）標(biāo)準(zhǔn)品（純度均在98%以上）（德國(guó)Dr公司）；氘代孔雀石綠（MG_D5）、氘代隱色孔雀石綠（LMG_D6）、氘代結(jié)晶紫（CV_D6）、氘代隱色結(jié)晶紫（LCV_D6）標(biāo)準(zhǔn)品（純度均在98%以上）（德國(guó)WITEGA公司）；中性氧化鋁SPE填料（100～300目）、C18SPE填料（40～63μm）和PSA QuEChERS專(zhuān)用填料（40～63μm）（上海安譜公司）。

1.2 溶液配制

目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和混合外標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)使用液的配置：分別準(zhǔn)確稱(chēng)取適量的MG、LMG、CV、LCV標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶液溶解并定容，配成濃度為100μg·mL-1的目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18℃冷凍保存。再用乙腈將4種目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋為0.1μg·mL-1的混合目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)使用液，于-18℃避光保存。

內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和混合內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)使用液的配置：分別準(zhǔn)確稱(chēng)取適量的MG_D5、LMG_D6、CV_D6和LCV_D6標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解并定容，配成濃度為100μg·mL-1的內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18℃冷凍保存。再用乙腈將4種內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋為0.1μg·mL-1的混合內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)使用液，于-18℃避光保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 水樣預(yù)處理

按采樣點(diǎn)均勻分布原則，在每個(gè)養(yǎng)殖水域采集3個(gè)水樣，各500 mL，充分混合后抽濾，去除懸浮物等固形物。

量取水樣100 mL，置于500 mL分液漏斗中，加入20μL濃度為0.1μg·mL-1的混合內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)使用液和2 mL 20%的鹽酸羥胺溶液，再加入50 mL二氯甲烷，劇烈振搖萃取5 min，靜置30 min，分層后取下層二氯甲烷于150 mL梨形瓶中，再向分液漏斗加入50 mL二氯甲烷，重復(fù)萃取一次（若分層不明顯，取其下層液于50 mL離心管中，6 000 r·min-1離心3 min，再取下層液），將兩次萃取的二氯甲烷合并置于40℃水浴減壓濃縮至近干，用1 mL乙腈復(fù)溶，拉動(dòng)活塞式分散固相萃取凈化柱（裝填中性氧化鋁粉末50 mg，預(yù)先用2.5 mL乙腈沖洗柱子）抽取復(fù)溶液，推動(dòng)活塞并接收流出液，再加入5.0 mmoL·L-1乙酸銨溶液并定容至2.0 mL，過(guò)0.22μm有機(jī)相濾膜后供UPLC-MS/MS儀測(cè)定。

1.3.2 色譜及質(zhì)譜條件

色譜條件：Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7μm）；柱溫40℃；進(jìn)樣量5μL；流動(dòng)相由5 mmol·L-1乙酸銨緩沖溶液（用甲酸調(diào)節(jié)p H為4.5，A）和乙腈（B）組成；梯度洗脫程序：0～1.50 min、5%～50%A（線(xiàn) 性 改 變），1.50～3.50 min、5%A，3.50～4.00 min、5%～50%A（線(xiàn)性改變），4.0～5.0 min、50%A；流速0.3 mL·min-1。

質(zhì)譜條件：電噴霧正離子（ESI+）模式；毛細(xì)管電壓1.70 k V，源補(bǔ)償電壓50 V；脫溶劑溫度600℃；脫溶劑氣流量600 L·h-1，錐孔氣流量150 L·h-1；霧化壓力0.7 MPa；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）掃描模式。目標(biāo)物母離子、子離子、錐孔電壓、碰撞能量和掃描時(shí)間等質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)條件見(jiàn)表1。MG、LMG、CV和LCV分別以MG_D5、LMG_D6、CV_D6和LCV_D6為內(nèi)標(biāo)物，按照內(nèi)標(biāo)法由MassLynx軟件自動(dòng)計(jì)算質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

表1 質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)條件Table 1 MRM conditions for mass spectrometry

2 結(jié)果與分析

2.1 液相色譜與質(zhì)譜分析條件的確定

2.1.1 液相色譜條件的確定

以Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7μm）為液相色譜分離柱，5 mmol·L-1乙酸銨緩沖溶液（含甲酸0.1%）和乙腈為流動(dòng)相，在梯度洗脫程序下，可將漁業(yè)養(yǎng)殖水體中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物隱色孔雀石綠和隱色結(jié)晶紫4種目標(biāo)物與樣品基質(zhì)完全分離，無(wú)干擾，在5 min內(nèi)全部出峰，且色譜峰型明顯，峰響應(yīng)強(qiáng)度高，0.2μg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液響應(yīng)強(qiáng)度可達(dá)到e5，見(jiàn)圖1。

2.1.2 質(zhì)譜分析條件的確定

在ESI+模式下，分別將0.1μg·mL-1的MG、LMG、CV、LCV、MG_D5、LMG_D6、CV_D6和LCV_D6標(biāo)準(zhǔn)品溶液通過(guò)蠕動(dòng)泵進(jìn)樣，采用一級(jí)質(zhì)譜分析MS SCAN，得到各目標(biāo)物的母離子信息，并對(duì)子離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，得到碎片離子信息，同時(shí)進(jìn)一步優(yōu)化錐孔電壓和碰撞能量等參數(shù)，使母離子和子離子的響應(yīng)最大化。優(yōu)化后的質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)條件如表1所示。

2.2 水樣前處理?xiàng)l件的確定

2.2.1 前處理方法的選擇

水體中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物濃度低，對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行富集以降低檢測(cè)限。在目前已有的關(guān)于水體中孔雀石綠類(lèi)測(cè)定的文獻(xiàn)中，多采用液液萃取法［19］或固相萃取法［20-21］進(jìn)行樣品前處理。固相萃取法在去除雜質(zhì)和降低基質(zhì)干擾上有較大優(yōu)勢(shì)，但在常規(guī)操作中，若取樣體積過(guò)小，易出現(xiàn)富集倍數(shù)不足和靈敏度較低的問(wèn)題；若為提高富集倍數(shù)和降低檢出限而增大取樣體積，則會(huì)增加固相萃取操作的復(fù)雜性，使檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)大大增長(zhǎng)，影響檢測(cè)效率?？紤]漁業(yè)養(yǎng)殖水體基質(zhì)相對(duì)簡(jiǎn)單，待測(cè)組分孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物在有機(jī)溶劑中溶解性好，因此選擇液液萃取法進(jìn)行水樣前處理。液液萃取法操作簡(jiǎn)單，不必用固相萃取中成本相對(duì)較高的SPE小柱，檢測(cè)成本低；還可通過(guò)大體積取樣提高目標(biāo)物的富集倍數(shù)，達(dá)到降低檢出限的目的，對(duì)富集后的樣品進(jìn)行吸附除雜，有利于降低基質(zhì)干擾。

2.2.2 液液萃取條件的確定

孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物在二氯甲烷中均有很好的溶解性，且二氯甲烷在水中的溶解度低，因此選擇二氯甲烷作為反萃取試劑進(jìn)行液液萃取。在100 mL水樣中分別添加10μL濃度為0.10μg·mL-1的MG、LMG、CV和LCV的4種混合目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)使用液（添加濃度約為10 ng·L-1）和20μL濃度為0.10μg·mL-1的混合內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)使用液，二氯甲烷的萃取體積分別為30，40，50，60，70 mL，進(jìn)行樣品前處理，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，當(dāng)萃取體積為50 mL時(shí)，4種目標(biāo)物的平均絕對(duì)回收率較高，繼續(xù)增大萃取體積，回收率提高不明顯，因此，選擇50 mL作為萃取體積。

圖1 0.2μg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatogram of 0.2μg·L-1 standard solution

圖3為分別用50 mL二氯甲烷液液萃取1，2，3次時(shí)4種目標(biāo)物的平均絕對(duì)回收率情況。由圖3可知，萃取2次時(shí)的平均絕對(duì)回收率較萃取1次時(shí)有明顯提高，但萃取3次時(shí)的平均絕對(duì)回收率較萃取2次時(shí)無(wú)明顯改善，因此，選擇萃取2次。

圖4為采用50 mL二氯甲烷液液萃取2次、振蕩時(shí)間分別為2，3，5，6和8 min時(shí)4種目標(biāo)物的平均絕對(duì)回收率情況。由圖4可知，在振蕩時(shí)間為2～5 min時(shí)，隨單次振蕩時(shí)間的增加，平均絕對(duì)回收率均逐漸提高；當(dāng)振蕩時(shí)間超過(guò)5 min后，繼續(xù)增長(zhǎng)振蕩時(shí)間，平均絕對(duì)回收率無(wú)明顯提高，因此，選擇單次振蕩的時(shí)間為5 min。

2.2.3 分散固相萃取凈化條件

采用2 mL活塞式分散固相萃取凈化柱，拉動(dòng)活塞將復(fù)溶液轉(zhuǎn)移至含有凈化填料的凈化柱，推動(dòng)活塞將凈化后的提取液轉(zhuǎn)移至離心管，加入5.0 mmoL·L-1乙酸銨緩沖溶液（0.1%甲酸）并定容至2 mL，過(guò)0.22μm濾膜后上機(jī)分析。分別裝填50 mg乙二胺-N-丙基硅烷顆粒（PSA）、50 mg十八烷基鍵合硅膠顆粒（C18）和50 mg中性氧化鋁，并比較經(jīng)3種填料吸附除雜后的平均絕對(duì)回收率（見(jiàn)圖5）。由圖5可知，C18對(duì)LMG、LCV的吸附作用較強(qiáng)，導(dǎo)致二者的平均絕對(duì)回收率很低；PSA對(duì)4種目標(biāo)物均有一定的吸附作用，且對(duì)MG、CV的吸附作用強(qiáng)于LMG和LCV；中性氧化鋁的整體吸附作用優(yōu)于PSA和C18，對(duì)4種目標(biāo)物的吸附作用較小，平均絕對(duì)回收率較高。漁業(yè)養(yǎng)殖水體的基質(zhì)相對(duì)較簡(jiǎn)單，但考慮部分水樣可能存在因含較多的水藻、殘留餌料及水體富營(yíng)養(yǎng)化帶來(lái)的基質(zhì)干擾效應(yīng)，可用活塞式中性氧化鋁分散固相萃取凈化柱進(jìn)行凈化，此方法操作簡(jiǎn)單，對(duì)水體中色素類(lèi)雜質(zhì)具有明顯的吸附除雜作用，從而降低基質(zhì)干擾，提高分析物的絕對(duì)回收率。

圖2 萃取體積對(duì)平均絕對(duì)回收率的影響Fig.2 Effect of extraction volume on average absolute recovery

圖3 萃取次數(shù)對(duì)平均絕對(duì)回收率的影響Fig.3 Effect of extraction times on average absolute recovery

圖4 萃取時(shí)間對(duì)平均絕對(duì)回收率的影響Fig.4 Effect of extraction time on average absolute recovery

圖5 不同填料凈化方式對(duì)平均絕對(duì)回收率的影響Fig.5 Effect of different packing purification methods on the average absolute recovery

2.3 方法確認(rèn)

2.3.1 準(zhǔn)確度和精密度

在浙江省舟山市朱家尖某大黃魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)采集水樣，經(jīng)檢測(cè)不含MG、CV及其代謝物。將其作為空白水樣，進(jìn)行不同添加濃度的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，考查方法的準(zhǔn)確率（以?xún)?nèi)標(biāo)法計(jì)算加標(biāo)回收率）和精密度。取100 mL樣品，設(shè)置4個(gè)加標(biāo)水平，每個(gè)加標(biāo)水平設(shè)6個(gè)平行組，每個(gè)加標(biāo)水平重復(fù)3次，添加濃度、加標(biāo)回收率及精密度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，在養(yǎng)殖海水基質(zhì)5～100 ng·L-1添加濃度下，MG、CV及其代謝物的平均加標(biāo)回收率為81.8%～109.5%，批內(nèi)精密度和批間精密度均小于10%，表明該方法的準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好。

2.3.2 方法的檢測(cè)限及線(xiàn)性范圍

分別配制MG、LMG、CV和LCV 4種目標(biāo)物工作 濃 度 為0.20，0.50，1.0，2.0和5.0μg·L-1，其 中MG_D5、LMG_D6、CV_D6和LCV_D6內(nèi)標(biāo)物濃度均為1.0μg·L-1。用4種目標(biāo)物峰的質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度和濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算相關(guān)系數(shù)，以信噪比（S/N）為3的響應(yīng)強(qiáng)度的目標(biāo)物濃度作為方法檢測(cè)限，以S/N≥10，且回收率大于70%的濃度作為方法定量限。4種目標(biāo)物的曲線(xiàn)方程及相關(guān)系數(shù)、檢測(cè)限與定量限如表3所示。由表3可知，MG、LMG、CV和LCV在0.2～5.0μg·L-1濃度范圍內(nèi)曲線(xiàn)方程均呈較好的線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.998，方法檢測(cè)限和定量限分別為2.0 ng·L-1和5.0 ng·L-1。

表2 養(yǎng)殖海水中MG、CV及其代謝物的加標(biāo)回收率與精密度實(shí)驗(yàn)（n=6）Table 2 Recovery and precision test of MG，CV and metabolites from aquaculture seawater when n=6

表3 MG、LMG、CV和LCV的工作曲線(xiàn)方程Table 3 Working curve equations of MG，LMG，CV and LCV

2.3.3 實(shí)際樣品驗(yàn)證

用40 L的魚(yú)缸養(yǎng)殖鯽魚(yú)數(shù)尾（體重為100～150 g·尾-1），用人為添加MG和CV污染濃度均為25.0μg·kg-1的配合飼料連續(xù)投喂4 d，投喂量為魚(yú)體重的1/20，2 d后對(duì)養(yǎng)殖水樣按照本研究方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水樣中均檢出MG、LMG、CV和LCV，濃 度 分 別 為0.007 1，0.025 0，0.008 4和0.028 0μg·L-1。結(jié)果表明，本方法能滿(mǎn)足漁業(yè)養(yǎng)殖水體中MG、CV及其代謝物痕量檢測(cè)要求。

另外，結(jié)合筆者團(tuán)隊(duì)承擔(dān)的浙江省養(yǎng)殖魚(yú)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)任務(wù)，同時(shí)對(duì)21處水產(chǎn)養(yǎng)殖水體進(jìn)行了取樣檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，某地的1份烏鱧養(yǎng)殖水體中檢出LMG，濃度為0.006 7μg·L-1，該地生產(chǎn)的烏鱧樣品中也檢出LMG，濃度為1.550 0μg·kg-1。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確率至關(guān)重要，因此對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的儲(chǔ)存有效期進(jìn)行了探究。將新配置的100μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分裝，密封后于-18℃冷存，每隔30 d取出1瓶，恢復(fù)至室溫后稀釋至1.0μg·L-1，用液質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，記錄每次測(cè)定的峰面積，同時(shí)測(cè)定新鮮配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積。以每次新鮮配制溶液的峰面積為基準(zhǔn)（100%），記錄在30～240 d時(shí)相應(yīng)組分的峰面積，計(jì)算并比較峰面積比例，用以表征標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的穩(wěn)定性，見(jiàn)圖6。由圖6知，MG貯存時(shí)間在180 d內(nèi)時(shí)，峰面積為新鮮配制溶液峰面積的99.2%～95.7%，貯存時(shí)間在210和240 d時(shí)，峰面積分別為新鮮配制溶液峰面積的93.2%和92.1%；LMG貯存時(shí)間在180 d內(nèi)時(shí)，峰面積為新鮮配制溶液峰面積的99.5%～97.3%，貯存時(shí)間在210和240 d時(shí)，峰面積分別為新鮮配制溶液峰面積的96.2%和94.3%；CV貯存時(shí)間在180 d內(nèi)時(shí)，峰面積為新鮮配制溶液峰面積的98.5%～95.4%，貯存時(shí)間在210和240 d時(shí)，峰面積分別為新鮮配制溶液峰面積的94.7%和92.4%；LCV貯存時(shí)間在180 d內(nèi)時(shí)，峰面積為新鮮配制溶液峰面積的99.1%～96.2%，貯存時(shí)間在210和240 d時(shí)，峰面積分別為新鮮配制溶液峰面積的95.7%和94.2%；MG_D5貯存時(shí)間在180 d內(nèi)時(shí)，峰面積為新鮮配制溶液峰面積的98.5%～95.0%，貯存時(shí)間在210和240 d時(shí)，峰面積分別為新鮮配制溶液峰面積的93.4%和92.1%；LMG_D6貯存時(shí)間在180 d內(nèi)時(shí)，峰面積為新鮮配制溶液峰面積的98.2%～95.2%，貯存時(shí)間在210和240 d時(shí)，峰面積分別為新鮮配制溶液峰面積的93.1%和91.7%；CV_D6貯存時(shí)間在180 d內(nèi)時(shí)，峰面積為新鮮配制溶液峰面積的98.4%～94.2%，貯存時(shí)間在210和240 d時(shí)，峰面積分別為新鮮配制溶液峰面積的93.8%和92.0%；LCV_D6貯存時(shí)間在180 d內(nèi)時(shí)，峰面積為新鮮配制溶液峰面積的98.5%～94.7%，貯存時(shí)間在210和240 d時(shí)，峰面積分別為新鮮配制溶液峰面積的93.2%和90.7%。因此確定8種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液在-18℃條件下的貯存時(shí)間不宜超過(guò)180 d。

圖6 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液穩(wěn)定性研究Fig.6 Study on stability of standard reserve fluid

將新配制的0.1μg·mL-1的混合目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)使用液和混合內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)使用液分裝，密封后于-18℃下冷存，每隔2 d取出1瓶，恢復(fù)至室溫后稀釋至1.0μg·L-1，用液質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，記錄每次測(cè)定的峰面積，同時(shí)測(cè)定新鮮配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積。以新鮮配制溶液的峰面積為基準(zhǔn)（100%），記錄不同取樣時(shí)間測(cè)定的相應(yīng)組分的峰面積，計(jì)算并比較峰面積比例，以表征標(biāo)準(zhǔn)使用液的穩(wěn)定性，見(jiàn)圖7。由圖7知，貯存時(shí)間在34 d內(nèi)，MG峰面積為新鮮配制溶液峰面積的99.6%～92.7%，LMG峰面積為新鮮配制溶液峰面積的99.5%～94.3%，CV峰面積為新鮮配制溶液峰面積的99.6%～89.4%，LCV峰面積為新鮮配制溶液峰面積的99.3%～93.7%，MG_D5峰面積為新鮮配制溶液峰面積的99.1%～89.4%，LMG_D6峰面積為新鮮配制溶液峰面積的99.6%～90.2%，CV_D6峰面積為新鮮配制溶液峰面積的99.5%～92.7%，LCV_D6峰面積為新鮮配制溶液峰面積的99.7%～93.1%；貯存時(shí)間為30 d時(shí)，MG、LMG、CV、LCV、MG_D5、LMG_D6、CV_D6和LCV_D6的峰面積分別為新鮮配制溶液峰面積的94.2%，95.2%，93.9%，94.2%，93.6%，93.9%，94.1%和94.2%。因此，確定8種標(biāo)準(zhǔn)使用液在-18℃條件下的貯存時(shí)間不應(yīng)超過(guò)30 d。

圖7 標(biāo)準(zhǔn)使用液穩(wěn)定性研究Fig.7 Study on the stability of standard service liquid

3 結(jié) 論

建立了用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)漁業(yè)養(yǎng)殖水體中的MG、CV及其代謝物殘留量的方法。采用二氯甲烷液液萃取法，結(jié)合活塞式中性氧化鋁分散固相萃取凈化柱，前處理方法簡(jiǎn)單快捷。該方法準(zhǔn)確率高、重現(xiàn)性好，可較好地用于漁業(yè)養(yǎng)殖水體中MG及CV殘留量的監(jiān)測(cè)。