基于氧化還原響應(yīng)型刺芒柄花素印跡的智能藥物載體研究

譚 倪,陳 燦,廖 森,劉雅晴,丁 醉

(南華大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,湖南 衡陽(yáng) 421001)

0 引 言

刺芒柄花素(formononetin)屬于異黃酮類化合物，其主要來(lái)源于豆科植物紅車軸草的花序及帶花枝葉、刺芒花全草，是當(dāng)歸、黃芪、葛根、雞血藤等常用中草藥的活性成分之一[1]。刺芒柄花素結(jié)構(gòu)式如圖1所示，由于具有類似于動(dòng)物體內(nèi)雌激素樣的雙羥基酚式結(jié)構(gòu)，所以較高劑量的刺芒柄花素在體內(nèi)便具有雌激素樣作用，它可在一定程度上改善婦女更年期癥狀，對(duì)生殖系統(tǒng)具有一定的安全性[2]。近來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究還表明，刺芒柄花素具有抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化、預(yù)防骨質(zhì)疏松、乳腺癌等效用[3-6]。

圖1 刺芒柄花素結(jié)構(gòu)式

癌癥作為一種“健康殺手”，它嚴(yán)重威脅著人們的生命，因此，對(duì)于癌癥的預(yù)防治療一直便是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。目前，化學(xué)治療法是臨床上治療惡性腫瘤最常用的方法，該法雖能殺滅患者體內(nèi)的癌細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)全身性治療，但它對(duì)機(jī)體正常組織細(xì)胞同樣具有一定的損傷[7]，產(chǎn)生多種副作用，臨床主要表現(xiàn)為免疫力下降、頭發(fā)脫落、惡心嘔吐等。另外，當(dāng)前許多用于化學(xué)治療的抗腫瘤藥物還具有溶解度低、生物利用率低、靶向性差等諸多不足。近年來(lái)，納米載藥系統(tǒng)不僅能夠有效解決抗腫瘤藥物水溶性差及藥物在其他部位富集等問(wèn)題、而且還能延緩藥物體內(nèi)釋放速度，并對(duì)腫瘤微環(huán)境具有刺激性響應(yīng)的載體可實(shí)現(xiàn)靶向釋放。當(dāng)前已經(jīng)上市或進(jìn)入臨床階段的腫瘤納米制劑的載體有脂質(zhì)體、聚合物膠束、白蛋白納米粒等[8-10]。由于腫瘤細(xì)胞往往具有特殊的微環(huán)境[11-12]，研究者還進(jìn)一步開發(fā)設(shè)計(jì)了刺激響應(yīng)型納米藥物載體，如pH響應(yīng)型[13]、光響應(yīng)型[14]、溫度響應(yīng)型[15]、多重響應(yīng)型[16]等。由此可見，未來(lái)對(duì)環(huán)境響應(yīng)性納米藥物載體的研究應(yīng)具有十分廣闊的前景。

本論文利用腫瘤細(xì)胞高還原狀態(tài)環(huán)境，以刺芒柄花素為模板，甲基丙烯酸為功能單體，含二硫鍵的N,N′-雙丙烯酰胱胺(BAC)為交聯(lián)劑，F(xiàn)e3O4@葡聚糖磁性納米粒子(Fe3O4@Dextran)為基體制備了具有氧化還原響應(yīng)的刺芒柄花素分子印跡聚合物，該聚合物對(duì)還原環(huán)境刺激敏感，生物毒性小且可降解，有望實(shí)現(xiàn)藥物靶向釋放，對(duì)抗氧化、抗乳腺癌等的智能給藥系統(tǒng)研究具有一定意義。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

試劑：甲基丙烯酸(MAA，98%)、刺芒柄花素(formononetin，98%)、五甲基二乙烯三胺(PMDETA，98%)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA，99%)、葡聚糖(Dextran，分子量2萬(wàn))、大豆苷元(daidzein，98%)、N,N′-雙丙烯酰胱胺(BAC、98%)、還原性谷胱甘肽(GSH，98%)、硫酸亞鐵·七水(FeSO4·7H2O)、無(wú)水三氯化鐵(FeCl3)和2,2′-偶氮異丁腈(AIBN)，均為分析純。

儀器：UV-8500分光光度計(jì)(天津市普瑞斯儀器有限公司)、7307型振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)(美國(guó)Lakeshore有限公司)、MutliFlex 2kW X射線衍射儀(興和儀器上海有限公司)，Nicolet IS 10傅立葉紅外光譜儀(美國(guó)Thermo fisher有限公司)。

1.2 氧化還原響應(yīng)刺芒柄花素分子印跡聚合物的制備

1.2.1 磁性Fe3O4@Dextran載體的制備

根據(jù)先前的文獻(xiàn)報(bào)道[17-18]，本試驗(yàn)采用共沉淀法制備Fe3O4@Dextran：將0.002 mol FeSO4·7H2O和0.004 mol FeCl3溶于蒸餾水中，得澄明溶液備用。稱取100 mg葡聚糖溶于50 mL體積分?jǐn)?shù)為0.25%醋酸溶液，然后將之加入到上述溶液體系中，再緩慢加入10 mL NH4OH，在N2保護(hù)下，加熱至75 ℃攪拌2 h，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，采用磁鐵將產(chǎn)物Fe3O4@Dextran與反應(yīng)溶液分離，甲醇洗滌至中性，-45 ℃下冷凍干燥。

1.2.2 氧化還原響應(yīng)刺芒柄花素分子印跡聚合物的合成

基于課題組之前研究[19]，采用反向原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法(reverse atom transfer radical polymerization,RATRP)合成目標(biāo)產(chǎn)物。取0.026 8 g刺芒柄花素，超聲溶于20 mL甲醇，再加入35.2 μL MAA，反應(yīng)體系在N2氛圍下，室溫?cái)嚢?2 h。預(yù)聚合結(jié)束后，依次向反應(yīng)體系中加入EGDMA(377 μL)，BAC(0.130 0 g)，AIBN(60 mg)，CuBr2(10 mg)，PMDETA(20.1 μL)，F(xiàn)e3O4@Dextran載體100 mg，在N2保護(hù)下，75 ℃恒溫反應(yīng)24 h。反應(yīng)完成后，借助外磁場(chǎng)分離產(chǎn)物，甲醇洗滌除去表面附著物，隨后將產(chǎn)物置于體積比為7：3的甲醇-乙酸洗脫液中，采用索氏提取法洗脫模板分子至檢測(cè)不到紫外吸收，然后用乙醇反復(fù)洗滌，最后產(chǎn)物置于60 ℃真空干燥。非印跡聚合物(non-imprinted polymer,NIPs)合成不加入模板分子，其他步驟與MIP的合成一致。MIP合成路線如圖2所示。

圖2 刺芒柄花素分子印跡材料的制備過(guò)程圖

1.3 印跡材料的吸附性能研究

1.3.1 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

稱取3 mg MIP/NIP分別加入到5 mL一系列不同濃度刺芒柄花素溶液中，室溫下震蕩420 min，隨后利用外磁場(chǎng)分離吸附劑，在260 nm處測(cè)定上清液吸光度，得到刺芒柄花素的吸附平衡濃度，根據(jù)公式(1)計(jì)算出兩種材料的吸附量Qe。

(1)

式中：C0(mg/mL)和Ce(mg/mL)分別是刺芒柄花素初始質(zhì)量濃度和平衡質(zhì)量濃度；V(mL)代表吸附體系溶液的體積；M(g)為MIP或NIP的質(zhì)量。

1.3.2 動(dòng)力學(xué)吸附實(shí)驗(yàn)

分別稱取MIP/NIP 3 mg于5 mL 0.200 mg/mL刺芒柄花素甲醇溶液中，室溫下，混合物在振蕩器中孵育10、20、40、80、120、180、240、300、420、540和660 min，磁鐵分離吸附劑，取上清液過(guò)濾后，測(cè)量刺芒柄花素的吸光度，由方程(1)得到對(duì)應(yīng)時(shí)間內(nèi)的吸附量。

1.3.3 選擇性考察實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)采用結(jié)構(gòu)類似的大豆苷元(daidzein)作為競(jìng)爭(zhēng)底物探索材料的選擇性。將3 mg MIP/NIP分別加入到0.200 mg/mL刺芒柄花素和大豆苷元溶液中，室溫下震蕩420 min，上清液過(guò)濾后，通過(guò)UV測(cè)定其紫外吸收，利用公式(2)～公式(4)得到MIP/NIP分別對(duì)刺芒柄花素和大豆苷元的吸附量及相應(yīng)的選擇性參數(shù)。

Kd=Qe/Ce

(2)

α=Kd1/Kd2

(3)

β=α1/α2

(4)

式中：Kd1和Kd2分別為刺芒柄花素和大豆苷元的分布系數(shù)；Ce(mg/mL)為刺芒柄花素和大豆苷元的平衡濃度；α指選擇系數(shù)；β為MIP的相對(duì)選擇系數(shù)。

1.3.4 重復(fù)再生性能研究

取3 mg MIP與5 mL 0.200 mg/mL的刺芒柄花素溶液混合，室溫下震蕩420 min后，外磁場(chǎng)分離上清液測(cè)定其吸光度，轉(zhuǎn)移吸附劑至索氏提取器中，洗滌除去模板分子至檢測(cè)不到紫外吸收，然后將吸附劑干燥后用于下一次吸附。重復(fù)上述吸附-解吸實(shí)驗(yàn)6次，計(jì)算每一循環(huán)的吸附量。

1.4 印跡材料還原刺激響應(yīng)性釋放實(shí)驗(yàn)

稱取10 mg載藥MIP/NIP分散于20 mL含有吐溫80磷酸緩沖溶液(PBS，pH 7.4)、PBS(pH 7.4，10 mol/L GSH)中，混合體系在溫度為37 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min條件下體外釋放。在預(yù)設(shè)時(shí)間點(diǎn)，取出3 mL上層釋放介質(zhì)，并加入同體積的新鮮緩沖溶液保持溶液體積不變，檢測(cè)上清液的吸光度，然后根據(jù)公式(5)計(jì)算不同條件下藥物累積釋放量。

(5)

式中：Cn(mg/mL)表示第n次取樣時(shí)刺芒柄花素溶液的質(zhì)量濃度；V1(mL)為緩沖溶液的總體積；V(mL)代表置換溶液的體積；M(mg)指吸附劑的載藥量。

2 結(jié)果與分析

2.1 表征分析

2.1.1 FT-IR分析

a—Fe3O4;b—Fe3O4@Dextran;c—MIP;d—吸附后MIP。

2.1.2 VSM分析

Fe3O4(曲線a)，F(xiàn)e3O4@Dextran(曲線b)，MIP(曲線c)三種物質(zhì)的磁回滯線如圖4所示。室溫條件下，F(xiàn)e3O4，F(xiàn)e3O4@Dextran，MIP的飽和磁化強(qiáng)度分別為81.75、70.93、45.25 Am2/kg。Fe3O4@Dextran，MIP磁飽和強(qiáng)度相比于Fe3O4依次降低的原因可能是葡聚糖包裹層和印跡層的順次加入。同時(shí)，在原點(diǎn)處三種物質(zhì)的矯頑力趨近于零，即沒(méi)有出現(xiàn)磁滯現(xiàn)象。以上結(jié)果表明，三種粒子具有超順磁性[23]，制備的印跡材料表現(xiàn)出良好的磁響應(yīng)性。

a—Fe3O4；b—Fe3O4@Dextran；c—MIP。

2.2 印跡材料的吸附性能研究

2.2.1 靜態(tài)吸附研究

由吸附等溫線圖5可知，初始濃度小于0.200 mg/mL時(shí)，MIP對(duì)刺芒柄花素的吸附量與初始濃度呈正相關(guān)，吸附量隨濃度的增加而增大，當(dāng)濃度達(dá)到0.200 mg/mL時(shí)，吸附達(dá)到平衡狀態(tài)，平衡吸附量為31.170 mg/g。這是由于隨著濃度增大，MIP上的印跡孔穴利用率隨之提高，當(dāng)濃度增大至0.200 mg/g時(shí)，MIP表面的印跡位點(diǎn)基本達(dá)到飽和狀態(tài)，故實(shí)現(xiàn)吸附平衡。在整個(gè)吸附過(guò)程中，NIP的吸附量明顯低于MIP，其最大吸附量?jī)H為7.167 mg/g，可見，MIP表面存在大量刺芒柄花素的特異性結(jié)合位點(diǎn)，因此對(duì)其具有更高的親和力。以上結(jié)果表明，MIP對(duì)刺芒柄花素具有特異性吸附，而NIP對(duì)其僅具有非特異性吸附(物理吸附)。

圖5 MIP,NIP的靜態(tài)吸附曲線

隨后，基于以上數(shù)據(jù)運(yùn)用Scatchard模型對(duì)其進(jìn)一步分析，探究?jī)煞N材料的吸附特性。Scatchard方程式如下：

(6)

式中：Qe(mg/g)為MIP或NIP在不同濃度溶液中的吸附量；Qmax(mg/g)是最大表觀結(jié)合量；C(mg/mL)表示刺芒柄花素吸附平衡時(shí)的濃度；Kd為平衡解離常數(shù)。

MIP/NIP的Scatchard擬合曲線如圖6(a),(b)所示，相關(guān)參數(shù)如表1所示。圖6(a)中存在兩條斜率不同的直線，表明MIP對(duì)刺芒柄花素的結(jié)合是不均勻的，其內(nèi)部可能存在兩種不同類型的吸附位點(diǎn)[24]，即高親和位點(diǎn)與低親和位點(diǎn)，其線性方程分別為：Y1=-11.452 9X+452.944 39，Y2=-7.612 6X+81.394 76，根據(jù)兩條直線的截距和斜率，可得到高親和位點(diǎn)和低親和位點(diǎn)的Kd和Qmax分別為0.087 31 mg/mL和0.131 36 mg/g，及39.548 45 mg/g和10.692 11 mg/g；圖6(b)中只出現(xiàn)了一條直線，且線性關(guān)系較差，這說(shuō)明NIP表面對(duì)模板分子僅存在一種吸附類型，即為低親和位點(diǎn)，其線性擬合方程為：Y3=-18.062 36X+138.011 59，計(jì)算得出Kd和Qmax分別為0.055 36 mg/mL和7.641 00 mg/g，說(shuō)明NIP對(duì)刺芒柄花素是簡(jiǎn)單的物理結(jié)合，且結(jié)合能力較低。綜上可知，相對(duì)于NIP，MIP對(duì)刺芒柄花素具有更強(qiáng)的吸附性能。

圖6 MIP和NIP的Scatchard擬合圖

表1 Scatchard擬合參數(shù)

2.2.2 動(dòng)力學(xué)吸附研究

根據(jù)動(dòng)態(tài)吸附圖7可知，前期MIP對(duì)刺芒柄花素的吸附量隨時(shí)間的增加而增大，增長(zhǎng)速率較快，主要由于其表面具有大量特定印跡孔穴，可快速結(jié)合溶液中的模板分子，當(dāng)吸附時(shí)間達(dá)到420 min后，吸附量達(dá)到最大值(31.170 mg/g)且趨向平衡，表明隨時(shí)間推移，材料表面的印跡位點(diǎn)逐漸被模板分子占據(jù)，最終達(dá)到飽和狀態(tài)。相比于MIP，在任一時(shí)間點(diǎn)，NIP對(duì)模板分子的吸附量都明顯低于MIP，而且隨時(shí)間增長(zhǎng)較緩慢，在180 min便達(dá)到吸附平衡，平衡時(shí)間比MIP提前了140 min，此時(shí)的最大吸附量為7.167 mg/g，以上結(jié)果歸因于，MIP內(nèi)部存在大量特異性吸附位點(diǎn)，而NIP對(duì)模板分子不具有特異性吸附，僅為簡(jiǎn)單的物理吸附過(guò)程。

圖7 MIP/NIP動(dòng)力學(xué)吸附圖

2.2.3 選擇性研究

選擇性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示，MIP對(duì)刺芒柄花素的吸附量高達(dá)31.170 mg/g，而對(duì)大豆苷元的吸附量?jī)H為刺芒柄花素的一半(15.000 mg/g)；相比于MIP，NIP對(duì)模板分子和競(jìng)爭(zhēng)底物的吸附量相差不大(7.167 mg/g，8.500 mg/g)，由此可知，MIP對(duì)模板分子具有特異識(shí)別性。

圖8 MIP/NIP對(duì)刺芒柄花素和大豆苷元的吸附量

隨后，根據(jù)公式(2)～公式(4)得到兩種材料的選擇性相關(guān)參數(shù)，列于表2。由表可知，吸附劑為MIP時(shí)，對(duì)刺芒柄花素的分布系數(shù)Kd值(167.671 mg/mL)顯然大于大豆苷元(58.820 mL/g)，且MIP對(duì)兩種物質(zhì)的選擇系數(shù)α為2.851，而NIP的選擇系數(shù)僅為0.361；同時(shí)，MIP對(duì)兩者的相對(duì)選擇性因子β為7.898，遠(yuǎn)大于1。所以，MIP對(duì)刺芒柄花素具有高選擇性和親和力。

表2 選擇性相關(guān)參數(shù)

2.2.4 重復(fù)再生性能研究

MIP再生性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9所示。由圖9可知，六次循環(huán)試驗(yàn)后，MIP對(duì)模板分子的吸附量由31.170 mg/g減少到27.167 mg/g，相比于初次吸附僅降低了12.84%，這可能是由于洗脫和干燥過(guò)程中，少量三維印跡空腔被破壞，特異性結(jié)合位點(diǎn)減少?？梢?，印跡材料保持較高的穩(wěn)定性和較強(qiáng)重復(fù)利用性能。

圖9 MIP重復(fù)再生性能

2.3 印跡材料還原刺激響應(yīng)性釋放分析

MIP的還原響應(yīng)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖10所示，pH值為7.4的條件下，刺芒柄花素在含有GSH的溶液中累積釋放量和釋放時(shí)間大于不含GSH的對(duì)照組，其最大累積釋放量達(dá)42.43%，釋放時(shí)間為90 h；而在不含GSH的介質(zhì)中最大釋放量?jī)H為10.09%，80 h達(dá)到釋放平衡，二者累積釋放量相差4倍；造成上述現(xiàn)象的主要原因是，在還原環(huán)境中，交聯(lián)劑BAC中的S-S容易斷裂，使材料的交聯(lián)結(jié)構(gòu)受到破壞，印跡孔穴坍塌，增大了藥物的釋放量，因此，MIP具有較強(qiáng)的還原敏感性，預(yù)計(jì)對(duì)腫瘤細(xì)胞微環(huán)境具有氧化還原響應(yīng)。

圖10 載藥MIP在不同環(huán)境中刺芒柄花素累積釋放率

3 結(jié) 論

本論文以刺芒柄花素為模板分子，甲基丙烯酸為功能單體，引入含二硫鍵的N,N′-雙丙烯酰胱胺為交聯(lián)劑，運(yùn)用反向原子自由基聚合法成功合成了具有氧化還原響應(yīng)的刺芒柄花素分子印跡聚合物，該材料不僅對(duì)模板分子具有良好的吸附性能(優(yōu)化條件下最大載藥量達(dá)31.170 mg/g，是非印跡材料載藥量的4.35倍)，而且具有較強(qiáng)的選擇性，其選擇性因子(α)和相對(duì)選擇性因子(β)分別為2.851，7.898。Scatchard分析結(jié)果表明印跡材料內(nèi)部存在兩種結(jié)合位點(diǎn)，分別是高親和位點(diǎn)和低親和位點(diǎn)。藥物釋放結(jié)果表明目標(biāo)產(chǎn)物對(duì)氧化還原刺激具有較好響應(yīng)性：還原條件下藥物累積釋放量是非還原條件下4倍。