土霉素原料藥中N-亞硝基二甲胺雜質(zhì)檢查方法的分析探討

郝麗霞，智 越，陳倩倩，李 惠

(巴彥淖爾市產(chǎn)品質(zhì)量計(jì)量檢測中心,內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 015000)

N-亞硝基二甲胺(C2H6N2O,NDMA)是亞硝胺類化合物的一種,在環(huán)境中廣泛存在。經(jīng)消化道、呼吸道吸收迅速,經(jīng)皮膚吸收緩慢。經(jīng)現(xiàn)代研究證實(shí),被認(rèn)定為具有遺傳毒性的物質(zhì),明確列入世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)在2017年10月27日公布的致癌物清單中[1-2]。基因毒性雜質(zhì)在痕量即可引起細(xì)胞產(chǎn)生基因突變或體內(nèi)誘變。NDMA幾乎可以引發(fā)人體所有臟器腫瘤, 靶器官主要為肝和腎。關(guān)于NDMA,最早引起轟動的是2013的“復(fù)旦大學(xué)投毒案”；2018年又一次進(jìn)入醫(yī)藥行業(yè)的視野,是因?yàn)閲宜幈O(jiān)局通報華海藥業(yè)纈沙坦原料藥中存在NDMA殘留,也由此,業(yè)界更加關(guān)注NDMA雜質(zhì)的檢測和分析。NDMA可由二甲胺與亞硝酸鹽在酸性條件下反應(yīng)而生成。二甲胺和亞硝酸都是常用的制藥原料,生產(chǎn)過程中如果出現(xiàn)吻合條件,就有可能在終端產(chǎn)品中形成殘留,因此,建立準(zhǔn)確可靠的檢驗(yàn)方法,考查評價產(chǎn)品質(zhì)量是保證藥品安全有效的手段。

土霉素是四環(huán)素類抗生素,為廣譜抑菌劑,許多立克次體屬、支原體、衣原體等微生物對該品敏感,在上個世紀(jì)六七十年代,土霉素在臨床用藥中占有舉足輕重的地位。隨著醫(yī)藥技術(shù)的進(jìn)步,更多抗生素藥物被研制成功,替代品推陳出新。土霉素生產(chǎn)過程包括發(fā)酵、酸化過濾、脫色結(jié)晶、離心干燥等環(huán)節(jié),各環(huán)節(jié)所用培養(yǎng)基、酸化劑等工藝輔料以及環(huán)境,都有可能潛在痕量的NDMA。目前,獲得國家藥品監(jiān)管部門批準(zhǔn)的土霉素原料藥和制劑文號仍然保存有700余個,尤其是原料藥的出口有更嚴(yán)格要求,因此,對于該品種質(zhì)量評價的研究依然重要。

1 材料與試驗(yàn)條件

1.1 儀器與試劑試藥

7890B氣相色譜儀；7010質(zhì)譜儀；LPD2500多管旋渦；OM-INNOWAXms色譜柱(30mm×0.25mm×0.25μm)；HC-3018R高速冷凍離心機(jī)；氦氣和氮?dú)?純度99.999%)；N-亞硝基二甲胺標(biāo)準(zhǔn)溶液(批號：S070533,規(guī)格1000μg/mL)；乙腈(批號：20210222,純度99.9%)。

1.2 氣相色譜條件

色譜柱：OM-INNOWAXms色譜柱(30mm×0.25mm,0.25μm)；程序升溫：初始柱溫為40℃,保持0.5分鐘,以每分鐘20℃的速率升溫至200℃；再以每分鐘60℃速率升溫至240℃,保持5分鐘；進(jìn)樣口溫度250℃；進(jìn)樣體積1.0μL；進(jìn)樣模式：不分流進(jìn)樣,不分流時間0.75min；恒壓模式,壓力7.0699psi。

1.3 質(zhì)譜條件

離子源：電子轟擊離子源(EI)電壓為70eV；傳輸線溫度：250℃；離子源溫度：250℃；碰撞氣：氮?dú)?；增益因子?；溶劑延遲2.5min；檢測模式：MRM；定量離子對：74.1→44.1；碰撞能：6V；定性離子對：74.1→42.1,碰撞能量：17V。

2 對照溶液與供試溶液制備

2.1 對照溶液制備

精密量取N-亞硝基二甲胺標(biāo)準(zhǔn)溶液適量,用乙腈稀釋定容制成1000ng/mL的溶液,作為標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。取上述標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液適量,用乙腈逐級稀釋制得系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液,濃度依次為5.0、10.0、25.0、50.0、100.0、200.0ng/mL；(試驗(yàn)中用二氯甲烷作為首選溶劑,因出峰不穩(wěn)定,故調(diào)整為乙腈)

2.2 供試溶液制備

精密稱取原料藥約500mg,置50mL具蓋離心管中,精密加入乙腈5.0mL,旋渦5min,以5000r/min(4℃)離心5min,取上清液適量,以0.45μm濾膜過濾,取續(xù)濾液,作為供試品溶液。

3 測定方法

分別取對照品系列溶液和供試品溶液進(jìn)樣測定,記錄譜圖。

4 驗(yàn)證試驗(yàn)

4.1 專屬性試驗(yàn)

分別對乙腈溶劑空白、N-亞硝基二甲胺標(biāo)準(zhǔn)溶液及供試品溶液進(jìn)行測定,記錄譜圖,結(jié)果顯示專屬性良好。詳見圖1～圖3。

圖1 乙腈溶劑空白譜圖

圖2 N-亞硝基二甲胺標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖

圖3 供試品溶液譜圖

4.2 線性范圍

對系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液分別進(jìn)行測定,記錄譜圖。以濃度(x)為橫坐標(biāo)對定量離子峰面積(y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果表明,N-亞硝基二甲胺在5.0～200ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)r2為0.9997,線性關(guān)系良好。詳見圖4。

圖4 線性關(guān)系

4.3 儀器檢出限和定量限

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線中系列標(biāo)準(zhǔn)溶液來分別計(jì)算N-亞硝基二甲胺的儀器檢出限和定量限濃度,檢出限為0.2722 ng/mL,定量限為0.9073 ng/mL。見表1。

表1 檢出限和定量限

4.4 重復(fù)性試驗(yàn)

分別精密稱取原料藥約500mg共六份,分別精密量取加入標(biāo)準(zhǔn)溶液(1000 ng/mL)0.25mL,制成濃度為0.50mg/kg的平行六份進(jìn)行測定,結(jié)果顯示N-亞硝基二甲胺的重復(fù)性及精密度試驗(yàn)RSD值為1.97%。見表2。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

4.5 回收率試驗(yàn)

分別精密稱取原料藥約500mg共九份,分別精密加入標(biāo)準(zhǔn)溶液適量,制成3個濃度(0.10、0.25和1.00mg/kg)各三份,進(jìn)行測定。結(jié)果顯示N-亞硝基二甲胺的平均回收率為112%,回收率RSD值為2.64%,方法準(zhǔn)確定較高。見表3。

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果

4.6 方法檢出限

根據(jù)驗(yàn)證準(zhǔn)確度的回收率試驗(yàn)中,制備的最低加標(biāo)濃度點(diǎn)的信噪比,計(jì)算得到方法檢出限,方法檢出限LOD(mg/kg)均值：0.0298 mg/kg。

5 結(jié)果判斷

以子離子對的m/z和色譜圖中的保留時間進(jìn)行定性；同時按標(biāo)準(zhǔn)曲線法,以定量離子的峰面積計(jì)算含量。分別對不同生產(chǎn)企業(yè)的6批土霉素原料藥進(jìn)行測定,結(jié)果顯示均未檢出N-亞硝基二甲胺。

6 結(jié)論

通過以上檢測數(shù)據(jù),可見,采用GC-MS/MS法測定土霉素原料藥中N-亞硝基二甲胺化合物的測定,方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明,方法操作簡便,結(jié)果準(zhǔn)確,具有良好的應(yīng)用前景,有助于原料監(jiān)管要求和保障質(zhì)量安全。