毛細(xì)管氣相色譜法測定巴胺磷溶液含量

楊 星，龔旭昊，馬秋冉，董玲玲，趙富華，彭文繡，于曉輝

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

巴胺磷是一種有機(jī)磷殺蟲藥，主要通過觸殺、胃毒起作用，不僅能滅殺家畜體表寄生蟲如螨、蜱，還能殺滅衛(wèi)生害蟲如蚊、蠅等。市場上的制劑有巴胺磷溶液，主要用于驅(qū)殺綿羊體表螨、虱、蜱等[1]。巴胺磷溶液作為獸用制劑收載于《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(2017年版化學(xué)藥品卷)中，其含量測定方法為填充柱氣相色譜法[2]，在如今的檢測條件下方法適用性較差，給檢驗(yàn)工作帶來較大困擾。目前國內(nèi)外文獻(xiàn)主要采用氣相色譜-火焰光度檢測法、氣相色譜-氮磷檢測法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等方法檢測蔬菜、大米、污水、水果、紡織品、豆粕中的巴胺磷殘留，針對巴胺磷溶液的含量測定方法的研究未見報(bào)道，各國藥典也未收載巴胺磷溶液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[3-9]。為了更好地控制巴胺磷溶液的質(zhì)量，參考?xì)庀嗌V法的相關(guān)文獻(xiàn)[10-11]，本研究擬建立毛細(xì)管氣相色譜-氫火焰離子化檢測法測定巴胺磷溶液含量的方法，以期為獸用制劑巴胺磷溶液含量的測定提供技術(shù)支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 氣相色譜儀：美國安捷倫公司，Agilent 7890A，配氫火焰離子化檢測器(FID)；電子分析天平：瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)， XS 205，精度0.01 mg。

1.2 試藥 巴胺磷對照品來源/批號(hào)/含量：農(nóng)業(yè)部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心/GBW(E)081342/1000.0 μg/mL；鄰苯二甲酸二丁酯內(nèi)標(biāo)物質(zhì)來源/批號(hào)/含量：上海源葉生物科技有限公司/A22D6L7951/99.8%；巴胺磷溶液規(guī)格/批號(hào)：40%/20190401、20190402、20190403；色譜級(jí)丙酮來源/批號(hào)：Fisher/182067。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Supelco SPB-624毛細(xì)管柱(固定相：6%氰丙基苯基-94%二甲基硅氧烷，規(guī)格：30 m×0.25 mm×1.4 μm，柱編號(hào)：24255)；柱溫：240 ℃；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；檢測器(FID)溫度：250 ℃；載氣：氮?dú)猓涣魉伲? mL/min；進(jìn)樣量：1 μL；分流比：15∶ 1。

2.2 溶液制備

2.2.1 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 取鄰苯二甲酸二丁酯約30 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，用丙酮溶解并稀釋至刻度，搖勻(含內(nèi)標(biāo)0.6 mg/mL)。

2.2.2 供試品儲(chǔ)備液的制備 取供試品約125 mg(約相當(dāng)于巴胺磷50 mg)，精密稱定，置50 mL量瓶中，用丙酮稀釋至刻度，搖勻(含巴胺磷1 mg/mL)。

2.2.3 對照品溶液的制備 精密量取1 mL巴胺磷對照品(含巴胺磷1 mg/mL)、1 mL內(nèi)標(biāo)溶液與2 mL丙酮，混勻(含巴胺磷0.25 mg/mL+內(nèi)標(biāo)0.15 mg/mL)。

2.2.4 供試品溶液的制備 精密量取1 mL供試品儲(chǔ)備液、1 mL內(nèi)標(biāo)溶液與2 mL丙酮，混勻(含巴胺磷0.25 mg/mL+內(nèi)標(biāo)0.15 mg/mL)。

2.2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液的制備 精密量取(0.8 mL巴胺磷對照品+2.2 mL丙酮、1 mL巴胺磷對照品+2 mL丙酮、1.2 mL巴胺磷對照品+1.8 mL丙酮)，分別與1 mL內(nèi)標(biāo)溶液混勻，制成相當(dāng)于80%、100%和120%的對照品溶液。

2.2.6 線性溶液的制備 精密量取(0.1 mL巴胺磷對照品+2.9 mL丙酮、0.5 mL巴胺磷對照品+2.5 mL丙酮、0.8 mL巴胺磷對照品+2.2 mL丙酮、1 mL巴胺磷對照品+2 mL丙酮、1.2 mL巴胺磷對照品+1.8 mL丙酮、2 mL巴胺磷對照品+1 mL丙酮)，分別與1 mL內(nèi)標(biāo)溶液混勻，制成含巴胺磷分別為0.025、0.125、0.2、0.25、0.3、0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)線性系列溶液。

2.2.7 回收率供試品溶液的制備 精密量取(0.5 mL供試品儲(chǔ)備液+0.3 mL巴胺磷對照品+2.2 mL丙酮、0.5 mL供試品儲(chǔ)備液+0.5 mL巴胺磷對照品+2 mL丙酮、0.5 mL供試品儲(chǔ)備液+0.7 mL巴胺磷對照品+1.8 mL丙酮)，分別與1 mL內(nèi)標(biāo)溶液混勻，制成相當(dāng)于80%、100%、120%濃度水平的回收率供試品溶液，每種濃度各配制3份。

2.2.8 定量限溶液的制備 精密量取0.01 mL巴胺磷對照品+3 mL丙酮，與1 mL內(nèi)標(biāo)溶液混勻，制成巴胺磷色譜峰信噪比約為10的定量限溶液。

2.2.9 檢測限溶液的制備 精密量取4 μL巴胺磷對照品+3 mL丙酮，與1 mL內(nèi)標(biāo)溶液混勻，制成巴胺磷色譜峰信噪比約為3的檢測限溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性 分別精密量取丙酮、2.2.1項(xiàng)內(nèi)標(biāo)溶液、2.2.3項(xiàng)對照品溶液、2.2.4項(xiàng)供試品溶液各1 μL，照2.1項(xiàng)色譜條件測定。結(jié)果顯示，在該色譜條件下，巴胺磷主峰的理論板數(shù)大于31000，巴胺磷主峰與內(nèi)標(biāo)鄰苯二甲酸二丁酯主峰的分離度大于17.0，且與溶劑峰、輔料峰等其他色譜峰均能完全分離，巴胺磷的測定不受干擾，方法專屬性強(qiáng)(圖1)。

圖1 專屬性溶液色譜圖Fig 1 The chromatogram of solutions for specificity

2.3.2 線性關(guān)系考察 分別精密量取2.2.6項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)線性系列溶液各1 μL，照2.1項(xiàng)色譜條件測定。以巴胺磷峰面積與內(nèi)標(biāo)鄰苯二甲酸二丁酯峰面積的比值(y)為縱坐標(biāo)，相應(yīng)巴胺磷濃度(x)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=3.8151x+0.0048，r2=0.9999，表明巴胺磷在0.025～0.5 mg/mL的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取2.2.5項(xiàng)80%、100%和120%的對照品溶液各1 μL，分別進(jìn)樣2次，按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算平均校正因子，RSD為0.6%；取1批巴胺磷溶液，平行制備6份供試品溶液進(jìn)行測定，計(jì)算巴胺磷的含量，RSD為0.6%。結(jié)果表明，色譜系統(tǒng)和供試品測定的重復(fù)性均良好。

2.3.4 回收率試驗(yàn) 采用加標(biāo)回收率試驗(yàn)測定準(zhǔn)確度。分別精密量取2.2.7項(xiàng)回收率供試品溶液各1 μL，照2.1項(xiàng)色譜條件測定，采用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算測定結(jié)果，結(jié)果見表1。

表1 巴胺磷添加回收率測定結(jié)果Tab 1 The results of the recovery rate ofadded propetamphos

2.3.5 定量限與檢測限 以巴胺磷峰信噪比S/N約為10和3的巴胺磷濃度作為定量限與檢測限，結(jié)果分別為2.5 μg/mL和1.0 μg/mL。

2.3.6 耐用性試驗(yàn) 對該方法進(jìn)行了流速±0.3 mL/min、柱溫±10 ℃、進(jìn)樣口溫度±10 ℃、檢測器溫度±10 ℃、更換不同色譜柱等方面的耐用性考察，結(jié)果如表2所示，不同流速、柱溫、進(jìn)樣口溫度、檢測器溫度、色譜柱的色譜條件下，巴胺磷理論板數(shù)均大于25000，巴胺磷與內(nèi)標(biāo)鄰苯二甲酸二丁酯分離度均大于15.0，方法耐用性良好。

表2 方法耐用性結(jié)果Tab 2 The results of robustness test

2.3.7 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取1份供試品溶液，室溫放置，分別于0、2、4、8、12、24 h后采集色譜圖，考察巴胺磷峰面積、鄰苯二甲酸二丁酯峰面積以及兩者峰面積比值的變化情況，RSD分別為1.9%、1.9%、0.2%。結(jié)果表明，由于采用丙酮作為溶劑，溶液容易揮發(fā)，隨著放置時(shí)間增加，巴胺磷峰面積和鄰苯二甲酸二丁酯峰面積逐漸增大，但24 h內(nèi)兩峰面積的比值穩(wěn)定，不會(huì)對測定結(jié)果造成干擾。

2.3.8 樣品測定 取3批供試品進(jìn)行含量測定，含巴胺磷分別為標(biāo)示量的97.3%、97.6%、97.1%，RSD分別為0.6%、0.4%、0.1%。

3 討論與結(jié)論

3.1 色譜柱 《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(2017年版化學(xué)藥品卷)中，巴胺磷溶液含量測定方法以非極性的100%甲基聚硅氧烷為固定相，本研究考察了與填充柱相同類型的SE-30毛細(xì)管柱、非極性的DB-1毛細(xì)管柱、強(qiáng)極性的HP-INNOWAX毛細(xì)管柱和中等級(jí)性的SPB-624毛細(xì)管柱。結(jié)果顯示，非極性的SE-30、DB-1毛細(xì)管柱巴胺磷峰與內(nèi)標(biāo)峰的峰型較差，強(qiáng)極性的HP-INNOWAX毛細(xì)管柱巴胺磷峰與內(nèi)標(biāo)峰不能完全基線分離，中等級(jí)性的SPB-624毛細(xì)管柱巴胺磷峰與內(nèi)標(biāo)峰的峰型對稱，兩者基線完全分離，適合于巴胺磷的含量測定。

3.2 柱溫 經(jīng)考察，柱溫越高，巴胺磷和內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間越小，測定耗時(shí)越短，同時(shí)巴胺磷峰與內(nèi)標(biāo)峰基線能完全分離，但為了避免過高的溫度對色譜柱填料造成損壞，柱溫不宜超過SPB-624毛細(xì)管柱的最大使用溫度250 ℃。

3.3 檢測器 目前氣相色譜用于巴胺磷殘留量測定的檢測器主要有火焰光度檢測器、氮磷檢測器和質(zhì)譜檢測器，這些檢測器適用于樣品中痕量或微量分析，而巴胺磷溶液含量測定為常量分析，氫火焰離子化檢測器作為高靈敏度通用型檢測器，各實(shí)驗(yàn)室配備率高，適用性更強(qiáng)。

3.4 內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法 采用丙酮作為溶劑，溶液容易揮發(fā)，隨著放置時(shí)間增加，巴胺磷峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積逐漸增大。采用外標(biāo)法測定，測定結(jié)果的準(zhǔn)確度和重復(fù)性容易受到干擾，采用內(nèi)標(biāo)法測定，巴胺磷峰與內(nèi)標(biāo)峰峰面積隨著溶劑揮發(fā)同比例變化，不會(huì)對測定結(jié)果造成干擾。

本研究建立了毛細(xì)管氣相色譜法測定巴胺磷溶液的含量，該方法操作簡便，具有專屬性強(qiáng)、快速準(zhǔn)確、耐用性好等特點(diǎn)，對現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中填充柱氣相色譜法測定巴胺磷溶液含量進(jìn)行了改善，適用于巴胺磷溶液含量的質(zhì)量控制。