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    中國山羊痘弱毒疫苗AV41株基因組分子標(biāo)記的比較分析

    2021-07-19 09:01:32南文龍鞏明霞鄒艷麗吳曉東彭大新陳義平
    中國獸藥雜志 2021年6期
    關(guān)鍵詞:痘病毒羊痘毒株

    陸 游,南文龍,鞏明霞,李 林,鄒艷麗,吳曉東,彭大新,陳義平*

    (1. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,江蘇揚(yáng)州 225009;2. 中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心,山東青島 266032)

    牛結(jié)節(jié)性皮膚病(Lumpy skin disease,LSD)是一種由羊痘病毒屬牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒(Lumpy skin disease virus, LSDV)引發(fā)的急性、亞急性傳染病[1]。該病臨床表現(xiàn)為皮膚水腫及局部堅硬的結(jié)節(jié)、結(jié)痂或潰瘍,懷孕牛流產(chǎn),奶牛產(chǎn)奶量減少,公牛暫時或永久不育,商品牛的肉質(zhì)或皮張利用率明顯下降[2-3]。2019年8月,LSD疫情首次發(fā)生于我國新疆伊犁州,2020年6月以來,我國福建長汀、江西贛州、廣東潮州、安徽黃山、浙江金華等地又確診發(fā)生該疫情[4]。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為法定報告的動物疫病,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部暫時將其作為二類動物疫病管理。

    根據(jù)《牛結(jié)節(jié)性皮膚病防治技術(shù)規(guī)范》,我國采用山羊痘弱毒疫苗AV41株,按山羊的五倍劑量免疫牛來預(yù)防LSD[5]。但弱毒疫苗的使用可對LSDV野毒的診斷和監(jiān)測產(chǎn)生干擾[6-7]。當(dāng)前尚無AV41株的特異性鑒別檢測方法,本研究擬篩選、驗證AV41株基因組獨(dú)特性分子標(biāo)記,為該疫苗株與我國LSDV野毒株的鑒別提供分子依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 毒株 山羊痘弱毒疫苗AV41株購自哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司、山東綠都生物科技有限公司,山羊痘病毒+小反芻獸疫病毒二聯(lián)弱毒疫苗(AV41株+Clone 9株)購自華派生物工程集團(tuán)有限公司。中國LSDV野毒株LSDV/China/XJ2019-1由中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心分離鑒定。

    1.2 試劑與儀器 磁珠法病毒DNA/RNA提取試劑盒購自TIANGEN公司,PCR擴(kuò)增試劑2×Taq Plus Master Mix(Dye Plus)購自Vazyme公司,毛細(xì)管電泳儀及DNA Marker購自QIAGEN公司,引物由睿博興科(青島)有限公司合成。

    1.3 病毒核酸提取 采用磁珠法病毒DNA/RNA提取試劑盒,提取中國LSDV野毒株和不同廠家來源的山羊痘弱毒疫苗AV41株的基因組DNA,廠家代號為A、B、C。

    1.4 基因組分子標(biāo)記篩選 從GenBank中下載已有的全部27 株LSDV基因組全序列(GenBank登錄號:MN995838.1、MT130502.1、MN642592.1、MN072619.1、KX894508.1、MH893760.2、KY829023.3、KY702007.1、KX683219.1、MT134042.1、MT643825.1、AF325528.1、AF409137.1、MH646674.1、MT992618.1、MN636843.1、MN636841.1、MN636840.1、MN636839.1、MN636838.1、MK4418381、MG972412.1、KX764645.1、KX764644.1、KX764643.1、AF409138.1、MT134042.1),除AV41株以外全部11 株GTPV基因組全序列(GenBank登錄號:MN072621.1、KC951854.1、MN072625.1、MN072624.1、MN072623.1、MN072623.1、MN072620.1、KX576657.1、MW020570.1、AY077836.1、AY077835.1)和全部的12 株綿羊痘病毒(Sheep poxvirus,SPPV)基因組全序列(GenBank登錄號:MN072631.1、MN072630.1、MN072629.1、MN072628.1、MN072627.1、MN072626.1、MW020571.1、AY077834.1、AY077833.1、AY077832.1、KT438551.1、KT438550.1)。利用生物信息學(xué)軟件BLAST和DNAstar,將AV41株基因組全序列(GenBank登錄號:MH381810.1)逐段與上述LSDV、GTPV、SPPV基因組全序列進(jìn)行比較,分析篩選AV41株基因組分子標(biāo)記。

    1.5 測序驗證 于1.4篩選的AV41株分子標(biāo)記所在的基因兩側(cè)序列設(shè)計引物,采用1.3方法制備的DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,對擴(kuò)增產(chǎn)物測序,驗證不同來源的AV41株相關(guān)分子標(biāo)記位置的基因組序列,并與我國LSDV 野毒株基因相比較,確認(rèn)AV41株基因組獨(dú)特分子標(biāo)記存在及分布情況。

    反應(yīng)體系25 μL:2×Vazyme Taq Plus Master Mix(Dye Plus)12.5 μL,上下游引物(5 μmol/L)各1 μL,核酸模板2 μL,無核酸酶水8.5 μL。

    反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性40 s,52 ℃退火30 s,72 ℃延伸40 s,共35個循環(huán);72 ℃最后延伸6 min。PCR 反應(yīng)結(jié)束,利用毛細(xì)管電泳儀分析結(jié)果,PCR 產(chǎn)物送睿博興科(青島)有限公司測序。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 基因組分子標(biāo)記篩選 將AV41株基因組全序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫下載中的27株LSDV、11株GTPV、12株SPPV基因組全序列進(jìn)行比較,共篩選獲得19個AV41 株分子標(biāo)記,包含4個插入標(biāo)記,4個缺失標(biāo)記和11個單核苷酸多態(tài)性(SNP)標(biāo)記(表1),而其余LSDV、GTPV、SPPV毒株基因組全序列對比結(jié)果中,尚未發(fā)現(xiàn)上述19個標(biāo)記。根據(jù)分子標(biāo)記所在基因兩側(cè)序列設(shè)計引物(表2),其中,EEV maturation protein基因采用兩組引物擴(kuò)增,一組用于G2261T位點(diǎn)測序,另一組用于2285C2286與ΔC2293-2294兩個位點(diǎn)測序。IL-1R基因的C582A和T571G位點(diǎn)采用同一組引物進(jìn)行擴(kuò)增測序。

    表2 AV41 分子標(biāo)記測序驗證用PCR 引物Tab 2 PCR primers for molecular marker sequencing verification of AV41

    2.2 測序驗證 以中國LSDV野毒株和不同廠家生產(chǎn)的AV41株的基因組DNA為模板,對2.1中19個分子標(biāo)記所在位置相應(yīng)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,毛細(xì)管電泳顯示,擴(kuò)增基因目的條帶均與預(yù)期大小相符(圖1)。經(jīng)測序驗證,并與LSDV野毒株基因組相關(guān)位置序列相比,其中7個為AV41基因組獨(dú)有的分子標(biāo)記,包括2個插入標(biāo)記(DNA ligase基因2433A2434、Kelch-like protein基因1831A1832)和5個SNP位點(diǎn)標(biāo)記(GTPV_gp020基因G203A、GTPV_gp021基因C681T、DNA-binding viron core protein基因C47T、RNA polymerase subunit 基因T64C和Myristylated protein基因C746A),具體見表1與圖2。

    1:15-3000bp Marker;2:GTPV_gp001 gene;3:IL-1R gene;4:EEV maturation protein gene (G2261T);5:GTPV_gp058 gene;6:GTPV_gp066gene;7:Virion core protein gene;8:DNA ligase gene;9:GTPV_gp021 gene;10:GTPV_gp020 gene;11:DNA-binding viron core protein gene;12:EEV maturation protein gene (2285C2286+ΔC2293~2294);13:RNA polymerase subunit gene;14:Myristylated protein gene;15:TK gene;16:RING finger host range protein gene;17:Kelch-like protein gene;18:Ankyrin-like 圖1 AV41分子標(biāo)記所在基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig 1 PCR amplification of marker genes of AV41

    NCBI AV41、NCBI 27 LSDVs、NCBI 11 GTPVs、NCBI 12 SPPVs:NCBI數(shù)據(jù)庫中的1株AV41、27株LSDV、除AV41外的11株GTPV、12株SPPV序列;A-AV41、B-AV41、C-AV41:不同廠家生產(chǎn)的AV41;WT-LSDV:中國LSDV野毒株;方框所示堿基為差異堿基;“-”:表示該處堿基缺失NCBI AV41, NCBI 27 LSDVs, NCBI 11 GTPVs, NCBI 12 SPPVs:1 strain of AV41, 27 strains of LSDV, 11 strains of GTPV except for AV41 and 12 strains of SPPV in NCBI database; A- AV41, B- AV41 and C-AV41:AV41 strains produced by different manufacturers;WT-LSDV:wild-type LSDV in China. The bases shown in the box are different bases;"-":base deletion圖2 AV41 7個獨(dú)特分子標(biāo)記所在基因序列對比Fig 2 Sequence comparison of seven specific molecular markers for AV41

    3 討論與結(jié)論

    牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒與山羊痘病毒、綿羊痘病毒同為羊痘病毒屬成員,相互間基因組全序列同源性高達(dá)95%[8],編碼主要抗原的基因序列相近。因此,采用同屬同源或異源弱毒疫苗株進(jìn)行免疫,都可預(yù)防牛結(jié)節(jié)性皮膚病。國際上用于LSD免疫的同源疫苗株有Neethling株與0240/KS-1株,異源疫苗株有SPPV RM65株與Romanian株,GTPV_Mysore株與Gorgan株等。非洲、中東、巴爾干等LSD流行地區(qū)的防控經(jīng)驗顯示,采用弱毒疫苗免疫有效控制了該病的傳播擴(kuò)散[9-10]。

    分子生物學(xué)方法是鑒別野毒株與疫苗株的主要手段,如熒光探針法和高分辨率熔解峰分析法(High-resolution melting,HRM)等。Eirini等根據(jù)Neethling株在G蛋白偶聯(lián)趨化因子受體基因處插入的12 bp堿基,設(shè)計了雙重探針的熒光定量PCR方法,可以區(qū)分Neethling_vaccine_LW疫苗株和LSDV_Turkey_2014等9種LSDV野毒株[11]。Tesfaye等基于SPPV疫苗株在B22R同源基因存在的21 bp與27 bp堿基缺失,建立了HRM分析法,可用于SPPV Romanian疫苗株等4種SPPV疫苗株與LSDV_Evros/GR/15等4種LSDV野毒株的鑒別[12- 13]。當(dāng)前,我國尚未開發(fā)或從國外引進(jìn)LSDV同源疫苗株。山羊痘弱毒疫苗AV41株可用于免疫山羊和綿羊預(yù)防GTPV與SPPV,已有近35年使用經(jīng)歷,證實其安全有效[14-15]。該疫苗株也可作為我國預(yù)防LSD的異源弱毒疫苗使用。鑒別診斷方面,聶福平等基于LSDV野毒株ORF126區(qū)域插入的26 bp堿基,建立了檢測LSDV野毒株的TaqMan-MGB熒光定量PCR方法,僅特異性擴(kuò)增LSDV野毒株相關(guān)基因,而對異源疫苗AV41株無擴(kuò)增信號[16]。

    目前,國內(nèi)尚無直接鑒別檢測AV41株的方法。本研究將AV41株基因組全序列與GenBank中的LSDV、GTPV和SPPV毒株序列比較,對中國LSDV野毒株和不同廠家生產(chǎn)的AV41株相關(guān)基因測序,證實其中7 個分子標(biāo)記為AV41株獨(dú)特性,包括DNA ligase基因2433A2434、Kelch-like protein基因1831A1832、GTPV_gp020基因G203A、GTPV_gp021基因C681T、DNA-binding viron core protein基因C47T、RNA polymerase subunit基因T64C、Myristylated protein基因C746A。上述結(jié)果顯示,所選分子標(biāo)記可用于我國山羊痘弱毒AV41株和LSDV野毒株的病原鑒別,即對分子標(biāo)記位置采用直接測序的方法,可鑒定為疫苗株或野毒株;或基于分子標(biāo)記中的SNP位點(diǎn),開發(fā)可用于區(qū)分相關(guān)SNP位點(diǎn)的熒光定量PCR方法;或基于插入位點(diǎn),建立可區(qū)分野毒株與疫苗株不同熔解曲線峰圖的高分辨率熔解峰分析法等。本研究可為我國LSD防控工作提供技術(shù)支持,也可進(jìn)一步為山羊痘弱毒AV41株與國內(nèi)山羊痘病毒、綿羊痘病毒野毒株的鑒別提供參考。

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