林可霉素微球制劑在鵝體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究

王麗坤，張 備，金振華，劉雪松，鹿凌巖，李 燁，張 艷，朱慶賀，史同瑞

(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江齊齊哈爾 161005)

微球制劑是近年發(fā)展起來的一種新型載藥系統(tǒng)，是利用具有生物相容性好、無毒、可降解的殼聚糖(chitosan，CS，CHIT)和海藻酸鈉(sodiumalginate，SA，ALG，NaAlg)等為材料制備的藻酸鹽藥物包封載體。微球制劑具有提高藥物穩(wěn)定性、緩釋、控釋與靶向釋放的作用，具有提高藥物的生物利用度等優(yōu)點，因此，微球作為藥物載體的開發(fā)應(yīng)用日趨廣泛[1,2]。殼聚糖是一種天然的堿性直鏈陽離子聚合多糖，具有生物相容性好，在體內(nèi)能被多種酶生物降解，無毒、無抗原性、資源豐富、經(jīng)濟價廉等優(yōu)點[3]。海藻酸鈉是從天然褐藻中提取的一種線性陰離子高分子多糖，具有良好的穩(wěn)定性、增稠性、成膜性、螯合性、絮凝性和吸附性能[4]。殼聚糖能夠與海藻酸鈉陰離子聚電解質(zhì)發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，形成由聚電解質(zhì)絡(luò)合物構(gòu)成的高分子半透膜，利用該特性可制成載藥微球，從而實現(xiàn)藥物的緩釋、控釋等功能。

林可霉素(Lincomycin)，又稱潔霉素，是林可鏈霉素(Streptomyces lincolnensis)產(chǎn)生的林可酰胺類抗生素，能夠抑制細菌細胞蛋白質(zhì)的合成，其鹽酸鹽為白色結(jié)晶粉末，微臭、味苦，易溶于水，在乙醇中略溶。主要用于治療革蘭氏陽性菌引起的感染性疾病，特別是葡萄球菌、鏈球菌及厭氧菌的抗菌作用顯著[5]。由于其對組織和細胞的穿透力強，應(yīng)用方便，不需要做皮試，且價格低廉，因此，在畜牧養(yǎng)殖業(yè)疾病的預(yù)防和治療中應(yīng)用比較廣泛[6-7]。本研究結(jié)合林可霉素和載藥微球的特性，制備了林可霉素微球制劑，并進行了鵝體內(nèi)藥代動力學(xué)的檢測，證明林可霉素微球具有緩釋性能，從而本制劑可以延長林可霉素的作用時間，更大限度地發(fā)揮林可霉素的抑菌抗炎作用。

1 材 料

1.1 試劑 林可霉素標準品(含量為84.9%，CAS號為K0102002，中國獸醫(yī)藥品檢查所)；甲醇(色譜純，美國Fisher公司)；乙腈(色譜純，美國Fisher公司)；四硼酸鈉(分析純，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠)。

1.2 儀器 高效液相色譜儀(LC-20AT SPD-20A,SHIMADZU，島津公司)；InertSustain C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；純水儀(PT-40,銳思捷水純化技術(shù)有限公司)；電子分析天平(MS104TS/02型，梅特勒-托利多有限公司)；試驗室pH計(PHS-3E，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)；超聲波清洗器(KQ5200B，昆山市超聲儀器有限公司)；隔膜真空泵(GM-0.33A，)氮吹儀(N-EVAP112，杭州奧盛儀器有限公司)。

1.3 動物與藥品 試驗動物為健康雌性霍爾多巴吉鵝20只，年齡120日齡，平均體重4 kg/只，由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院試驗鵝廠提供。試驗鵝常規(guī)飼養(yǎng)，在1月內(nèi)未使用藥物。30%林可霉素微球制劑、30%林可霉素注射液均由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院獸藥研究室自制。

2 方 法

2.1 給藥 健康試驗鵝隨機分為試驗組和對照組，每組10只。試驗組一次性胸部肌肉注射30%林可霉素微球溶液，0.5 mL/只，對照組一次性肌內(nèi)注射30%林可霉素注射液，0.5 mL/只。試驗期間，按照常規(guī)飼養(yǎng)方式自由采食和飲水，飼料中不含抗菌藥物。

2.2 樣品采集 兩組試驗鵝在給藥后0、1、2、4、8、16、24、28、32、48、54、72 h進行采取血樣，每次每只鵝翅下靜脈采血2 mL，分別置于肝素鈉抗凝管中，3000 r/min離心5 min，取上清血漿置于離心管中，冷凍備用。

2.3 樣品前處理 取冷凍保存的血漿樣品，自然解凍，搖勻，取1 mL血漿樣品于10 mL聚丙烯離心管中，加入2 mL乙腈，渦旋混勻后置于4 ℃離心機中，3000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清置新的離心管中，沉淀中再次加入2 mL乙腈，混勻，離心，重復(fù)提取一次，合并兩次提取液，50 ℃水浴中氮氣吹干，吹干后加入1 mL流動相混勻，溶解混勻后利用孔徑為0.22 μm的針式過濾器進行過濾，過濾兩次后裝入上樣瓶中供高效液相色譜測定。

2.4 色譜條件 流動相：0.1 mol/L硼砂溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH值至6.0)-甲醇-乙腈(67:33:2)；色譜柱：C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流速：0.8 mL/min；檢測波長：204 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：20 μL。

2.5 檢測方法考察

2.5.1 血藥濃度標準曲線建立通過空白添加的試驗方法進行檢測 鹽酸林可霉素標準儲備液的配制：精密稱取鹽酸林可霉素標準品20 mg，以甲醇定容至10 mL容量瓶中，制得濃度2.0 mg/mL儲備液。分別精密吸取適量標準儲備液，以流動相稀釋成5 μg/mL、10 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、500 μg/mL的標準工作液，置4 ℃冰箱中保存。分別采集健康鵝空白血漿0.9 mL，依次加入不同濃度標準工作液各0.1 mL，使工作液終濃度為0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、10.0 μg/mL、20.0 μg/mL、50.0 μg/mL。每個濃度處理3個樣品，每個樣品重復(fù)進樣3次，以待測物濃度為橫坐標，以待測物色譜圖的峰面積為縱坐標，建立標準曲線。

2.5.2 方法專屬性 取一定濃度的鹽酸林可霉素標準工作液20 μL進樣，得到無血漿基質(zhì)影響的鹽酸林可霉素色譜圖；取空白血漿1 mL，除不加標準工作液外，按2.5.1項方法獲得空白樣品的色譜圖；將一定濃度的鹽酸林可霉素溶液加入鵝空白血漿中，依同樣方法操作，獲得相應(yīng)色譜圖；同樣方法獲得鵝給藥后血漿樣品色譜圖，考察血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對鹽酸林可霉素測定結(jié)果有無干擾。

2.5.3 精密度測定 分別在同一天和連續(xù)3 d內(nèi)制備濃度分別為1.0、5.0 μg/mL和25.0 μg/mL的血漿樣品各3個，處理后進樣20 μL進行測定，連續(xù)測定3 d，并與標準曲線同時進行，依當日的標準曲線計算樣品濃度，計算日內(nèi)與日間精密度，回收率=實測濃度/理論濃度×100%。

2.5.4 回收率測定 分別配制鹽酸林可霉素濃度為1.0、5.0和25.0 μg/mL的血漿樣品各3個，每個樣品進樣20 μL，以提取后的鹽酸林可霉素的峰面積與空白血漿提取后加入相應(yīng)濃度標準工作液處理后的樣品進樣所得色譜圖峰面積之比，考察樣品的回收率。

2.6 樣品測定 每組每個時間點的10份血漿樣品進行平行處理，測定其中林可霉素含量，采用HPLC檢測，外標法測定，結(jié)果取平均值。

2.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析 分別將實測的鵝血漿中林可霉素血藥濃度-時間數(shù)據(jù)采用DAS2.1.1版本藥動學(xué)分析軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，得出所需要的藥物代謝動力學(xué)參數(shù)，計算相對生物利用度。

3 結(jié)果與分析

3.1 線性關(guān)系考察結(jié)果 鹽酸林可霉素血漿標準品濃度及其測得的峰面積見表1。以鹽酸林可霉素血漿藥物濃度(mg/L)為橫坐標(X)，鹽酸林可霉素的峰面積(AU)為縱坐標(Y)，繪制標準曲線。如圖1所示，血漿中鹽酸林可霉素在0.5～50 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性相關(guān)，標準曲線相關(guān)系數(shù)(R2)大于0.999，線性方程為：y=39172.2x-4705.14。

表1 林可霉素血漿樣品濃度及測得峰面積Tab 1 Lincomycin plasma sample concentration and measured peak area

圖1 標準曲線Fig 1 Standard curve line

3.2 方法專屬性考察 以一定濃度的20 μL鹽酸林可霉素標準工作液進樣檢測后，得色譜圖(圖2)，可得鹽酸林可霉素的保留時間為10.686 min。由空白血漿色譜圖(圖3)、空白血漿加標準品色譜圖(圖4)可知：在本試驗分析條件下，鹽酸林可霉素有良好的分離度，血漿內(nèi)源性物質(zhì)對樣品沒有干擾。

圖2 空白血漿色譜圖Fig 2 Blank plasma chromatogram

圖3 空白血漿添加標準品色譜圖Fig 4 Chromatogram of blank plasma with standard addition

3.3 精密度測定結(jié)果 鹽酸林可霉素在鵝血漿中的精密度試驗數(shù)據(jù)見表2。該數(shù)據(jù)表明：鵝血漿中鹽酸林可霉素低(1.0 μg/mL)、中(10.0 μg/m L)、高(20.0 μg/mL)三個濃度樣品的日內(nèi)分析精密度小于5%，日間分析精密度均小于8%，血漿樣品的分析方法符合有關(guān)規(guī)范要求。

3.4 回收率測定結(jié)果 回收率結(jié)果表明：該方法中鹽酸林可霉素在1.0、10.0和20.0 μg/mL三個濃度下血漿樣品的平均回收率分別為97.8%、98.4%和97.7%，鹽酸林可霉素的總回收率為98.0%，回收率均符合測定要求。

3.5 樣品測定結(jié)果 林可霉素注射液組與林可霉素微球制劑組各時間點林可霉素含量測定結(jié)果顯示，試驗組鵝肌肉注射37.5 mg/kg林可霉素微球后，林可霉素微球在血漿中緩慢釋放，達峰時間Tmax約為1 h，達峰濃度Cmax為2.632 mg/L，給藥后24 h內(nèi)血液中藥物濃度維持在0.3 mg/L以上，緩釋時間長達72 h，血漿中林可霉素含量在0.145 mg/L以上。對照組鵝肌肉注射37.5 mg/kg林可霉素注射液后，達峰時間Tmax約為1 h，達峰濃度Cmax為3.83 mg/L，達峰濃度高，但釋藥時間短，在24 h后血漿中檢測不到林可霉素，見圖5。相關(guān)藥代動力學(xué)參數(shù)見下表。

圖5 動物試驗結(jié)果Fig 5 Animal test results

4 討論與結(jié)論

4.1 鵝血漿中林可霉素微球濃度的HLPC法的建立 為保證禽類產(chǎn)品質(zhì)量安全和食品安全，為人們身體健康提供保障，有必要靈敏準確的檢測到動物體內(nèi)林可霉素的含量，林可霉素的檢測方法主要有微生物法、液相色譜法和毛細管法等[8]。黃新球等采用液相色譜法測定蜂王漿中林可霉素的殘留，該方法方便快捷，穩(wěn)定性較好，成本較低，回收率高[7]。張曉燕等采用高效液相色譜法精密度較好的檢測豬肉中的鹽酸林可霉素殘留量[9]。陳明等采用高效液相色譜法檢測牛奶中林可霉素殘留，該方法過程簡單，檢測速度快，分析穩(wěn)定可靠[10]。

表3 血漿中林可霉素的回收率Tab 3 The recovery rate of lincomycin in plasma

表4 藥代動力學(xué)參數(shù)Tab 4 Pharmacokinetic parameters

選用液相色譜法建立了鵝血漿中林可霉素的含量檢測方法，采用液相色譜法。試驗中以0.01 mol/L硼砂-甲醇溶液(40∶60)為流動相以Waters Symmetry C18色譜柱為分離柱，利用高效液相色譜法二極管陣列檢測器測得鹽酸林可霉素在0.2～50 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R2為0.9999，血漿平均回收率、日內(nèi)日間變異系數(shù)均與王春艷[11]、戴平[12]等研究相符，相比之下最低檢測限更低，是由不同種類檢測器其靈敏度也不同造成的。同時對該方法進行了驗證，考察內(nèi)容包括標準曲線和準確度、緊密度、提取回收率、穩(wěn)定性。證明該方法準確、可靠。

4.2 林可霉素微球的鵝血漿藥代動力學(xué)研究 隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，普通藥物劑型已經(jīng)不能滿足獸醫(yī)臨床的應(yīng)用，臨床用藥中對藥物劑型的研究正向著緩釋、控釋方向發(fā)展[13]。緩釋、控釋制劑能夠降低血漿藥物濃度波動，減少給藥次數(shù)，提高藥物療效，降低不良反應(yīng)，而且使用方便，因而越來越引起人們的興趣。近幾年來研制成緩、控釋制劑的藥物品種顯著增加，首過效應(yīng)、半衰期、耐藥性等許多限制被打破；復(fù)方緩釋、控釋制劑的研制成功更為緩、控釋制劑發(fā)展提供了良好的前景。本研究進行了林可霉素微球在鵝血漿中的藥代動力學(xué)研究，結(jié)果表明，與林可霉素注射液相比，鵝肌肉注射37.5 mg/kg林可霉素微球后，林可霉素微球在血漿中緩慢釋放，緩釋時間達72 h以上，達峰濃度Cmax為2.632 mg/L，達峰時間Tmax約為1 h。李濤[14]等發(fā)現(xiàn)林可霉素濃度在0.4-1 mg/L時對革蘭氏陽性菌具有抑菌效果。利用林可霉素微球制劑給藥后24 h內(nèi)血液中藥物濃度維持在0.3 mg/L以上，單日單劑量注射后有效抑菌時間約為24 h。此外林可霉素注射液常規(guī)給藥方案是一日二次注射法，注射林可霉素注射液后血藥濃度達到峰值迅速，且峰值較高，一日兩次注射操作不當易引起藥物過量，產(chǎn)生不良反應(yīng)，另外用藥量浪費大，血藥維持不夠平穩(wěn)，易導(dǎo)致耐藥菌株出現(xiàn)；與其相比林可霉素微球制劑給藥后，達到峰值濃度時間相同，藥時曲線下面積更大，殺菌抑菌持續(xù)時間更長，殺菌抑菌更加徹底，由此可見林可霉素微球給藥更加合理，還能夠進一步降低細菌耐藥性產(chǎn)生。王耀華等[15]利用殼聚糖-海藻酸鈉作為藥物載體制備了康普瑞丁磷酸二鈉微球制劑，并進行了大鼠中的藥代動力學(xué)研究，結(jié)果表明，微球制劑在大鼠肺和肝中AUC顯著增加了49.34和20.65倍。研究也采用殼聚糖-海藻酸鈉作為藥物載體制備微球制劑，與林可霉素注射液相比AUC增加了約3.02倍。研究結(jié)果表明，自制林可霉素微球制劑緩釋效果顯著，生物利用度比林可霉素注射液明顯增高。長效微球注射劑是由傳遞系統(tǒng)而非波動的生物因素控制吸收，所以藥物緩釋速率、釋放持續(xù)時間、適用藥物類型寬泛，因此微球劑型不僅局限于普通抗菌藥物的添加，疫苗同樣可以采用微球化技術(shù)包括在可生物降解的聚合物中，一次注射后，抗原在體內(nèi)連續(xù)釋放以保持較長時間的高抗體水平，避免多次加強免疫，這對于獸醫(yī)臨床免疫具有很大的實用意義[13]。

林可霉素微球在鵝體內(nèi)藥代動力學(xué)研究結(jié)果進一步為緩釋藥物研發(fā)奠定物質(zhì)基礎(chǔ)，提供理論依據(jù)。研究為林可霉素微球的安全評價及質(zhì)量評估提供了藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)支持。