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    男性無(wú)精癥或少精癥患者細(xì)胞遺傳學(xué)及Y染色體微缺失分析

    2020-09-16 10:14:58白瑞芳侯東霞周雪原王曉華冀小平
    關(guān)鍵詞:精癥遺傳學(xué)核型

    馬 科,周 燕,董 弘,白瑞芳,侯東霞,周雪原,王曉華,冀小平

    (內(nèi)蒙古自治區(qū)婦幼保健院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020)

    近年來(lái)隨著社會(huì)快速發(fā)展、生活壓力及環(huán)境污染等多方面的影響,不孕不育患者的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。據(jù)報(bào)道不育夫婦占已婚育齡夫婦10 %~15 %,因男性因素引起的不育約占50 %,其中遺傳學(xué)因素所致不育占2 %~21 %[1]。染色體異常引起的男性不育類型有多種,臨床癥狀與表現(xiàn)均不同,這些遺傳學(xué)改變均會(huì)阻礙男性生殖腺或泌尿生殖道發(fā)育,對(duì)精子發(fā)育、形成產(chǎn)生影響,使精子在發(fā)育過程中停滯,造成無(wú)精癥或少精癥,從而使男性患者喪失生殖能力最終導(dǎo)致不育。Y染色體精子生成因子AZF(Azoospermia factor,AZF)位于Y染色體長(zhǎng)臂,控制精子發(fā)生,分為三個(gè)相互獨(dú)立區(qū)域:AZF a、AZF b、AZF c。相關(guān)研究已經(jīng)證實(shí),Y染色體AZF基因的主要作用是調(diào)節(jié)精母細(xì)胞增殖。當(dāng)AZF基因出現(xiàn)微缺失時(shí)會(huì)導(dǎo)致無(wú)精癥,不同基因亞區(qū)對(duì)精子生長(zhǎng)有不同影響[2]。本研究對(duì)男性無(wú)精癥或少精癥患者進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)及Y染色體微缺失分析,探討男性不育患者染色體核型異常及AZF(azoospermia factor,AZF)微缺失類型的分布,為男性不育癥患者診療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 對(duì)象與方法

    1.1對(duì)象 選取2012年1月至2019年5月在本院遺傳科行遺傳學(xué)檢測(cè)的男性無(wú)精癥或少精癥患者228例,年齡22~38歲,平均年齡(28.3±1.2)歲,所有患者均參照世界衛(wèi)生組織(WHO)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行精液常規(guī)分析,精液標(biāo)本在3~7 d內(nèi)射精獲得,連續(xù)3次不同時(shí)間段進(jìn)行精液檢查,并經(jīng)離心沉淀后鏡檢均無(wú)精子者為無(wú)精癥,精子計(jì)數(shù)≤5×106/mL者為嚴(yán)重少精癥[3]。

    1.2方法

    1.2.1外周血染色體核型分析 將肝素抗凝的外周血注入淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基,37 ℃密閉式培養(yǎng)箱培養(yǎng)66~72 h。培養(yǎng)終止前加入0.01~0.02 mL濃度為20 ug/mL的秋水仙素,在37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h,低滲、固定處理制片。將制好的玻片經(jīng)0.025 %的胰酶消化,然后用吉姆薩染液染色、鏡檢。每例計(jì)數(shù)20個(gè)細(xì)胞分裂中期的分裂相,分析5個(gè)核型。

    1.2.2Y染色體微缺失檢測(cè) 采用兩管多重PCR擴(kuò)增技術(shù)提取外周血淋巴細(xì)胞DNA,檢測(cè)AZF微缺失,包括AZFa區(qū)SY84、SY86,AZFb區(qū)SY127、SY134和AZFc區(qū)SY254、SY255。

    1.2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 23.0軟件對(duì)每種檢測(cè)方法檢出率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用χ2檢驗(yàn)評(píng)價(jià)差異程度,以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1外周血染色體核型分析結(jié)果 149例患者行外周血染色體核型分析,17例患者異常,染色體異常率為11.4 %。數(shù)目異常11例占異常總數(shù)64.7 %,其中9例47,XXY(Klinefelter綜合征)、1例47,XYY、1例46,XY/45,X嵌合體;結(jié)構(gòu)異常6例占異??倲?shù)35.3 %,其中2例常染色體結(jié)構(gòu)異常、1例46,XY16qh+、1例46,XY t(X,12)(q21;q14)、2例大Y、1例小Y,詳見表1。

    表1 染色體核型分析檢測(cè)結(jié)果

    2.2Y染色體微缺失檢測(cè)結(jié)果 188例Y染色體微缺失檢測(cè)患者中檢出9例異常者,檢出率為4.78 %。異常類型AZFc區(qū)7例,AZFb區(qū)1例,AZFa+b+c區(qū)1例,詳見表2。

    表2 Y染色體微缺失檢測(cè)結(jié)果

    2.3兩種方法聯(lián)合應(yīng)用檢出率 109例患者既進(jìn)行染色體核型分析又進(jìn)行Y染色體微缺失檢測(cè),檢出異常患者19例,異常檢出率為17.4 %;單一進(jìn)行染色體核型分析患者40例,檢出異常患者4例,異常檢出率為10.0 %;單一進(jìn)行Y染色體微缺失檢測(cè)79例,檢出異?;颊?例,異常檢出率為3.8 %。兩種方法聯(lián)合應(yīng)用較單一方法檢出率高(χ2=8.522,P=0.014)。

    表3 單一染色體核型分析、Y染色體微缺失檢測(cè)及兩種方法聯(lián)合檢測(cè)檢出率

    3 討論

    近年來(lái)新興男性學(xué)科與遺傳學(xué)關(guān)系較為密切,已引起醫(yī)學(xué)界高度重視。男性無(wú)精癥或少精癥常見遺傳缺陷包括染色體核型異常、基因拷貝數(shù)變異、單基因突變和多態(tài)性、Y染色體微缺失等。染色體畸變是導(dǎo)致男性不育的重要因素,據(jù)研究顯示染色體異常發(fā)生率與精子生成為反比,性染色體異常和常染色體結(jié)構(gòu)異常在不育男性中發(fā)生率高于正常男性[4]。性染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常導(dǎo)致性器官發(fā)育不全,引起生精功能障礙,患者臨床表現(xiàn)為先天性多發(fā)畸形,智力和生長(zhǎng)發(fā)育遲緩,性腺和第二性征不發(fā)育等。AZF微缺失是引起男性生精障礙導(dǎo)致無(wú)精癥或少精癥的另一個(gè)常見遺傳學(xué)因素。AZFc區(qū)缺失是最常見的Y染色體微缺失區(qū)域,包含較多與生精有關(guān)的基因,該區(qū)域基因缺失會(huì)對(duì)男性精子生成產(chǎn)生嚴(yán)重影響,隨時(shí)間推移,精子數(shù)量可能會(huì)進(jìn)行性減少。AZFb區(qū)缺失導(dǎo)致精子停滯在減數(shù)分裂前期或中期,使精子生成障礙,造成男性無(wú)精癥或少精癥。AZFa區(qū)缺失導(dǎo)致青春期精子形成過程受阻,臨床表現(xiàn)為“唯支持細(xì)胞綜合征”,無(wú)精子生成[5]。

    根據(jù)近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)遺傳因素對(duì)男性不育起著關(guān)鍵作用,其中以Klinefelter綜合征為主的染色體核型異常及Y染色體長(zhǎng)臂微缺失最為常見[6]。本研究Klinefelter綜合征檢出9例,占異常類型52.94 %,異常率高于其他異常類型,與上述研究結(jié)論一致。本研究檢出Y染色體微缺失9例,其中AZFc區(qū)缺失7例,占總?cè)笔ь愋?7.8 %,是發(fā)生率最高的缺失類型;AZFb區(qū)缺失1例,占總?cè)笔ь愋?6.6 %;AZFa區(qū)未見缺失;AZFa+b+c區(qū)缺失型1例,對(duì)其行外周血染色體核型檢測(cè)結(jié)果為45,X。臨床癥狀表現(xiàn)為無(wú)精癥、睪丸體積小、出現(xiàn)Ⅰ型唯支持細(xì)胞綜合征。除上述常見的兩種導(dǎo)致無(wú)精癥或少精癥的因素外,目前越來(lái)越多研究表明Y染色體的大小也會(huì)表現(xiàn)出相應(yīng)遺傳學(xué)效應(yīng)。臨床診斷大Y標(biāo)準(zhǔn)為Y≥18號(hào)染色體,小Y診斷標(biāo)準(zhǔn)為Y≤21號(hào)染色體。本研究發(fā)現(xiàn)2例大Y型,占異常的11.76 %;1例小Y型,占異常的5.88 %;

    1例47,XYY核型,患者表現(xiàn)為身材較高大,性腺發(fā)育不全,精液檢測(cè)為無(wú)精癥。Y染色體數(shù)目異常導(dǎo)致精子形成時(shí)聯(lián)會(huì)過程發(fā)生紊亂,引起患者無(wú)精。本研究中2例常染色體異常和1例次鎰痕增加,均為常染色體結(jié)構(gòu)異常。其中1例為羅氏易位,臨床表現(xiàn)為少精,其智力正常。少精是由于羅氏易位干預(yù)減數(shù)分裂檢驗(yàn)點(diǎn),使細(xì)胞停滯于第一次減數(shù)分裂末而發(fā)生凋亡。無(wú)精可能與減數(shù)分裂過程中聯(lián)會(huì)異常,不能形成配子有關(guān)[7]。另一例易位發(fā)生在常染色體與性染色體之間。研究表明,減數(shù)分裂過程中染色體易位可導(dǎo)致同源染色體之間無(wú)法正常配對(duì),使精子發(fā)生過程受到影響,最終可能導(dǎo)致男性少精癥[8]。

    本研究無(wú)精癥或少精癥的男性患者染色體核型異常率為11.4 %(17/149),與其他文獻(xiàn)研究相近[9]。據(jù)國(guó)內(nèi)外不同文獻(xiàn)報(bào)道AZF缺失率為1.9 %~55.6 %,平均發(fā)生率為10.8 %[10]。本研究Y染色體微缺失異常率為4.78 %(9/188),低于文獻(xiàn)報(bào)道平均發(fā)生率??赡苡捎诟餮芯窟x擇對(duì)象來(lái)自于不同地區(qū),因此缺失率存在地域差異。兩種方法聯(lián)合檢測(cè)檢出異常病例19例,異常檢出率為17.4 %(19/109)。對(duì)比兩種方法對(duì)無(wú)精癥或少精癥患者的檢測(cè),發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測(cè)能夠提高異常檢出率。兩種方法分別從細(xì)胞學(xué)水平和分子學(xué)水平對(duì)患者染色體進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)運(yùn)用兩種方法聯(lián)合檢測(cè),能夠從不同水平上篩查病因,提高患者病因的檢出率。

    無(wú)精癥或少精癥患者病因復(fù)雜,染色體核型異常及Y染色體微缺失是導(dǎo)致男性不育的遺傳因素。對(duì)不育患者進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)及分子遺傳學(xué)診斷,通過檢測(cè)分型能夠?yàn)椴挥颊哒业讲∫?,避免?duì)患者進(jìn)行盲目治療,為其進(jìn)行遺傳咨詢和制定合理的治療方案提供更多幫助。

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