頭季稻氮肥運(yùn)籌對再生稻根際機(jī)能及產(chǎn)量的影響

黃錦文 吳珈誼 陳鴻飛 張志興 方長旬 邵彩虹 林偉偉 翁佩瑩 林文雄,*

頭季稻氮肥運(yùn)籌對再生稻根際機(jī)能及產(chǎn)量的影響

黃錦文1, #吳珈誼1, #陳鴻飛1張志興1方長旬1邵彩虹2林偉偉1翁佩瑩1林文雄1,*

(1作物遺傳育種與綜合利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)學(xué)院/作物生態(tài)與分子生理學(xué)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福州 350002;2江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與資源環(huán)境研究所, 南昌 330200;#共同第一作者;*通信聯(lián)系人，E-mail: wenxiong181@163.com)

【目的】再生稻是頭季稻生長的延續(xù)。本研究嘗試從根際微生態(tài)系統(tǒng)的變化來闡明機(jī)械化栽培下頭季稻氮肥管理對頭季-再生季水稻產(chǎn)量形成的影響，為再生稻高產(chǎn)高效栽培提供參考?！痉椒ā恳浴梆畠?yōu)1540”為材料，通過2年的田間試驗(yàn)，在頭季總施氮量(225.00 kg/hm2)不變的前提下，設(shè)置頭季不同氮肥運(yùn)籌處理，分析了機(jī)械化栽培下再生稻產(chǎn)量、根系傷流強(qiáng)度、根際土壤酶活性及其微生物多樣性的變化特點(diǎn)?！窘Y(jié)果】頭季前氮后移施肥處理(N1、N2)有助于根系保持較高活力，尤其在頭季生長中后期N1處理(基肥∶一次分蘗肥∶二次分蘗肥∶孕穗肥=3∶1∶2∶4)根系傷流強(qiáng)度比對照(N0)和當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)施肥處理(N4)顯著提高；N1處理兩季總產(chǎn)量最高，2年平均達(dá)17 351.23 kg/hm2，比當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)施肥處理(N4)提高了23.00%。土壤酶活性分析表明，蔗糖酶活性在頭季齊穗期表現(xiàn)為N2>N1>N3>N4>N0，之后則表現(xiàn)為N1>N2>N3>N4>N0；過氧化氫酶與硝酸還原酶活性在頭季生長期均表現(xiàn)為N1>N2>N3>N4>N0；脲酶活性從頭季齊穗期至再生季齊穗始終表現(xiàn)為N1>N2>N3>N4>N0；各生育時(shí)期土壤酶活性與根系傷流強(qiáng)度間均呈顯著或極顯著正相關(guān)。細(xì)菌 16S rDNA 測序表明，施肥與不施肥處理細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性差異顯著，N1處理細(xì)菌 Chao1 指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)顯著高于其他處理。菌群結(jié)構(gòu)分析表明，施肥處理增加了與土壤碳氮循環(huán)、有機(jī)質(zhì)含量及抗逆性密切相關(guān)的細(xì)菌數(shù)量，尤其是N1、N2處理硝化螺旋菌屬相對豐度較高，有利土壤氮素循環(huán)?！窘Y(jié)論】機(jī)械化栽培下，頭季氮肥適當(dāng)后移有利于再生稻根際微生態(tài)系統(tǒng)的改善，從而提高根系活力，促進(jìn)水稻生長，獲得兩季水稻的高產(chǎn)。

再生稻；氮肥運(yùn)籌；根系活力；根際土壤；群落多樣性

近年來，強(qiáng)再生力水稻品種的育成和栽培技術(shù)的發(fā)展，使得再生稻栽培成為中國南方提高復(fù)種指數(shù)，穩(wěn)定稻谷總產(chǎn)的一項(xiàng)種植制度[1]。再生稻是頭季水稻收割后稻樁上的休眠芽萌發(fā)而成的一季短生育期水稻，其根系由頭季根系和再生根系兩部分組成[2]。研究表明，再生苗成穗率及產(chǎn)量與再生稻的根系機(jī)能極顯著正相關(guān)，健壯的頭季稻根系和一定數(shù)量新生根系的有效結(jié)合是再生稻高產(chǎn)的關(guān)鍵[3-6]。氮素是水稻生長發(fā)育進(jìn)程以及產(chǎn)量形成的關(guān)鍵養(yǎng)分因子。饒鳴鈿等[7]研究指出，頭季稻氮肥是影響再生季產(chǎn)量的主要因素之一。陳鴻飛等[8]、楊東等[9-10]、王森等[11]和鄭景生等[12]從水稻光合生理、氮代謝、干物質(zhì)積累運(yùn)轉(zhuǎn)及養(yǎng)分的吸收利用等方面分析了頭季稻不同氮肥運(yùn)籌方式對再生稻產(chǎn)量形成的影響；任天舉等[13]、林燕等[14]認(rèn)為頭季稻不同的施肥方式對再生稻的生育進(jìn)程、根系和再生苗生長具有明顯的效應(yīng)。前人的研究表明，合理的氮肥運(yùn)籌不僅對提高頭季產(chǎn)量，而且對防止頭季稻后期根系早衰，穩(wěn)定再生季產(chǎn)量，實(shí)現(xiàn)兩季高產(chǎn)意義重大[15]。然而，前人的研究大多是在人工栽培條件下展開的。隨著農(nóng)村勞動(dòng)力的轉(zhuǎn)移，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)機(jī)械化已成為當(dāng)前作物生產(chǎn)的主流。與人工栽培相比，機(jī)械化栽培再生稻必須解決兩個(gè)關(guān)鍵問題：一是頭季機(jī)插秧移栽秧齡小，生育期短，植傷重[16-19]；其次，與人工高留樁栽培不同，機(jī)插再生稻必須選用耐碾壓品種進(jìn)行低留樁收割來減輕收割機(jī)對稻樁的碾壓[1]?？梢姡瑱C(jī)插再生稻的品種選擇及相應(yīng)的栽培管理模式都與人工栽培有所不同。目前，機(jī)栽下頭季稻氮肥管理方式對再生稻根際機(jī)能及產(chǎn)量的影響未見深入的研究報(bào)道。此外，近年來研究認(rèn)為，根系-微生物的直接相互作用對植物的生長、健康和適應(yīng)性起著至關(guān)重要的作用，根際被認(rèn)為是植物的第二基因組[20]。植物與根際微生物的互作現(xiàn)象及其機(jī)制，也是生命科學(xué)研究關(guān)注的熱點(diǎn)和農(nóng)業(yè)微生物利用的關(guān)鍵問題[21,22]。因此，本研究以閩北廣泛種植的“甬優(yōu)1540”為材料，并基于人工栽培水稻農(nóng)民多施基肥的傳統(tǒng)習(xí)慣和機(jī)栽再生稻生長的特點(diǎn)，設(shè)置了頭季稻氮肥適當(dāng)后移的施肥模式，分析頭季稻氮肥運(yùn)籌對再生稻根際微生物群落多樣性的影響及其對土壤酶活性和根系活力的影響，嘗試從微生態(tài)系統(tǒng)變化來闡明機(jī)栽再生稻高產(chǎn)形成機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

試驗(yàn)以秈型三系雜交稻“甬優(yōu)1540”為材料，于2017年3月至11月在福建省南平市建陽區(qū)崇雒鄉(xiāng)(118°13′E, 27°30′N)進(jìn)行。試驗(yàn)地為沙壤土，含有機(jī)質(zhì)3.4%，銨態(tài)氮20.5 mg/kg，速效磷6.8 mg/kg，速效鉀65 mg/kg，pH值為6.3。2017年頭季于3月11日播種，采用軟盤育秧機(jī)插，4月11日插秧，插秧規(guī)格30 cm×17 cm，叢插平均2粒谷秧。頭季稻施氮量為(折合純氮)225 kg/hm2，N∶P2O5∶K2O=1∶0.5∶0.8，以尿素作氮肥，以過磷酸鈣作P肥，P肥全部作基肥，以氯化鉀作K肥，K肥基肥∶孕穗肥= 5∶5，氮肥運(yùn)籌比例設(shè)5種處理，即基肥、一次分蘗肥、二次分蘗肥、孕穗肥比分別為3∶1∶2∶4、3∶2∶1∶4、3∶3∶0∶4、4∶3∶0∶3，依次設(shè)為N1、N2、N3、N4處理，以頭季及再生季均不施氮肥為對照(N0處理)，其中，N4是當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)施肥方式，具體氮肥施用見表1。每處理種植750 m2，設(shè)置3次重復(fù)。各處理間設(shè)置塑料擋板以防止串肥，設(shè)置高30 cm、寬40 cm田埂，工作溝寬30 cm；頭季成熟時(shí)機(jī)收，留樁高度為25 cm。再生季施肥情況：除N0處理外，其他各處理施純氮172.5 kg/hm2，以尿素作氮肥，按1∶1分促芽肥和促苗肥兩次施用，促芽肥于頭季齊穗后20 d施用，促苗肥于頭季收割后5 d施用。再生稻全程機(jī)械化栽培，除施肥處理外，其他按當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)高產(chǎn)栽培管理。2018年在同一地塊上進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，頭季于3月4日播種，4月10日插秧，其他試驗(yàn)設(shè)計(jì)與2017年相同。2017年進(jìn)行頭季和再生季水稻測產(chǎn)，2018年除產(chǎn)量測定外，還進(jìn)行了根系傷流量及根際土壤酶活性測定和土壤細(xì)菌群落特性分析。

B－頭季稻基肥，插秧前2 d施用；T1－第一次分蘗肥，插秧10 d后施用；T2－第二次分蘗肥，第一次分蘗肥施用后10 d施用；RB－孕穗肥，倒2葉期施用。BP－促芽肥，頭季稻齊穗后20 d施用；SP－再生季促苗肥，頭季收割后5 d施用。

B refers to basal fertilizer of main crop rice, which was applied two days before transplanting; T1, Primary fertilizer application for tillering, which was applied 10 d after transplanting; T2, Secondary fertilizer application for tillering, which was applied 10 d after T1；RB stands for topdressing for panicle initiation, which was applied in the penultimate leaf growth period.BP refers to bud-promoting fertilizer, which was applied 20 d after full heading; SP refers to seedling-promoting fertilizer, which was applied 5 d after harvest.

1.2 測定項(xiàng)目與方法

1.2.1 水稻產(chǎn)量與產(chǎn)量構(gòu)成因素測定

于頭季及再生季水稻成熟期，每個(gè)小區(qū)根據(jù)平均有效穗數(shù)取有代表性水稻 5 株，考查每株有效穗數(shù)、每穗總粒數(shù)及實(shí)粒數(shù)、千粒重，計(jì)算結(jié)實(shí)率和理論產(chǎn)量并記錄。水稻成熟期每處理隨機(jī)抽取3塊有代表性的田塊人工收割測產(chǎn)，每塊地實(shí)割測產(chǎn)面積2 m×2 m。

1.2.2 水稻根系傷流量測定

分別于頭季水稻齊穗期、成熟期和再生季水稻的齊穗期、成熟期，采用李合生[23]貼棉吸附法進(jìn)行根系傷流量測定。每個(gè)小區(qū)于測定日18:00選取具有代表性的3叢水稻，每叢水稻在離地12 cm處水平割去地上部分，并將已知質(zhì)量的棉花完全包裹住切口，套上對應(yīng)的塑料袋，用橡皮筋進(jìn)行固定，做好防雨水、露水措施；次日6:00回收田間放置的棉花袋，并進(jìn)行稱量，記錄其增量。每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.3 土壤樣品采集

于頭季水稻齊穗期、成熟期和再生季水稻齊穗期、成熟期取樣，測定土壤相關(guān)酶活性；于頭季水稻生長后期(齊穗后10 d)取樣，分析根際土壤細(xì)菌群落特性。

每次每處理采用五點(diǎn)取樣法隨機(jī)選取稻株(連根拔起)，用無菌剪刀剝除離根系較遠(yuǎn)的土壤，露出根際土，用剪刀輕輕剝掉根上大約1～3mm的土壤混勻，分為2份，分別保存于4℃冰箱和?80℃冰箱備用。

1.2.4 根際土壤相關(guān)酶活測定

參照關(guān)松蔭等[24]的方法，根際土壤中脲酶采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法測定，蔗糖酶采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定，過氧化氫酶采用高錳酸鉀滴定法測定；硝酸還原酶參照Alef 等[25]的方法采用高錳酸鉀滴定法測定。每個(gè)小區(qū)取3次重復(fù)。

1.2.5 根際土壤微生物總 DNA提取及PCR擴(kuò)增

土壤DNA 提取方法參照 FastDNA SPIN Kit for soil(MP Biomedicals，USA)試劑盒說明書進(jìn)行。提取得到的DNA樣品用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測和分光光度法(260 nm/280 nm光密度比)進(jìn)行質(zhì)量檢測。檢測后，將樣品于?20℃下保存以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。微生物多樣性檢測選取細(xì)菌16S rRNA V3～V4區(qū)，DNA樣本送至北京奧維森基因科技有限公司，利用 Illumina Miseq PE300高通量測序平臺進(jìn)行測序。細(xì)菌16S rRNA V3～V4可變區(qū)特異引物為338F(5＇-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3＇)和806R(5＇-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3＇)。PCR反應(yīng)體系包括12.5 μL 2×PCR MasterMix，3 μL BSA (2 ng/μL)，2 Primer(5 μmol/L)，2 μL模板 DNA和5.5 μL ddH2O。反應(yīng)程序：95 ℃下預(yù)變性5 min；95 ℃下變性45 s，55 ℃下退火50 s，72 ℃下延伸45 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃下延伸10 min。測序原始序列上傳至NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫。

表2 頭季稻氮肥運(yùn)籌對頭季-再生季水稻產(chǎn)量的影響

*<0.05; **<0.01; *Significant at< 0.05; **Significant at<0.01.

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

測序數(shù)據(jù)分析：原始數(shù)據(jù)存在一定干擾數(shù)據(jù)，在去除barcode、primer序列后使用FLASH 軟件進(jìn)行拼接，得到原始Tags 數(shù)據(jù)(raw_tags)，對Tags數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，得到高質(zhì)量Tags數(shù)據(jù)(clean_tags)。使用usearch軟件按照97%相似性序列進(jìn)行OTU (Operational Taxonomic Unit，可操作分類單元)聚類，獲得OTU，統(tǒng)計(jì)所測樣品每個(gè)OTU中的豐度信息。隨機(jī)抽樣法抽取數(shù)據(jù)，并與所代表的OTU數(shù)目構(gòu)建稀釋曲線，使用R語言和Mothur繪制稀釋曲線并進(jìn)行Alpha多樣性指數(shù)組間差異分析。使用 Qiime 軟件計(jì)算所測樣品Observed-species、Chao1、Shannon、Goods-coverage、PD_whole_tree 指數(shù)。對OTU代表序列進(jìn)行數(shù)據(jù)庫比對分析，得出物種注釋總表，并進(jìn)行不同水平的物種數(shù)量統(tǒng)計(jì)，獲得各分類水平(Phylum, Class, Order, Family, Genus, Species)的物種豐度表，進(jìn)行屬水平OTU豐度微生物功能分析。對OTU豐度進(jìn)行均一化處理，并且進(jìn)行Alpha多樣性和PCA 統(tǒng)計(jì)分析。使用R語言作圖。

水稻產(chǎn)量、根系傷流量及酶活性測定結(jié)果采用Excel 2016和DPS 7.05統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行整理分析，采用GraphPad Prism 5進(jìn)行數(shù)據(jù)圖表處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 頭季-再生季水稻產(chǎn)量及產(chǎn)量構(gòu)成因素

由表2可知，產(chǎn)量年度間差異不顯著，施肥處理間差異極顯著。2年的產(chǎn)量表現(xiàn)無論是頭季還是再生季，施氮處理均極顯著高于不施氮(N0)處理，頭季及再生季產(chǎn)量均表現(xiàn)為N1>N2>N3>N4>N0,其中N1與N2之間差異不顯著。N1兩季實(shí)際總產(chǎn)量2年平均比不施肥N0、當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)施肥N4處理分別提高71.32%、23.00%；N2兩季實(shí)際總產(chǎn)量2年平均比N0、N4處理分別提高59.24%、14.32%。

圖1 水稻根系傷流強(qiáng)度隨生育時(shí)期變化

Fig.1.Changes of root bleeding intensity of rice at various growth stages.

由于年度間產(chǎn)量差異不顯著，以2年產(chǎn)量平均值作進(jìn)一步分析(表3)，各處理再生季有效穗數(shù)均比頭季稻多，尤其是施肥處理，再生季平均有效穗數(shù)是頭季稻的1.27～1.39倍，其中，N1處理不管是頭季還是再生季有效穗數(shù)均最高，其次是N2處理。每穗粒數(shù)方面，再生季比頭季少，各處理再生季為頭季稻的52.23%～55.24%，頭季及再生季各處理間每穗粒數(shù)表現(xiàn)為N2＞N1＞N3＞N4＞N0，再生季各施肥處理間差異不顯著。千粒重不管頭季還是再生季各處理間無顯著差異；頭季結(jié)實(shí)率平均為93.45%，再生季平均為80.23%，頭季高于再生季。

2.2 水稻根系活力及其與再生季產(chǎn)量的相關(guān)性

2.2.1 根系傷流強(qiáng)度的變化

根系傷流是不挖掘水稻的情況下能對水稻根系生理活性進(jìn)行簡單判斷的有效方法，其流量強(qiáng)度是根系活力的指標(biāo)之一。由圖1可知，從頭季齊穗-頭季成熟-再生季齊穗-再生季成熟隨著生育進(jìn)程各處理根系傷流強(qiáng)度呈下降趨勢，頭季齊穗期各處理均達(dá)到峰值，N1、N2處理顯著高于N3、N4、N0處理，N1處理每株水稻根系傷流強(qiáng)度達(dá)2.10 g/h，比N0處理高75.65%，比N4處理高47.89%；N2處理比N0處理高52.94%，比N4處理高28.17%，N2與N3處理差異不顯著。頭季成熟期各處理根系傷流強(qiáng)度均下降，但依然表現(xiàn)為N1＞N2＞N3＞N4＞N0，N1處理分別比N0、N4處理提高了116.88%和39.66%。隨著再生稻生長發(fā)育進(jìn)程，再生季水稻根系傷流強(qiáng)度都明顯低于頭季稻，由于再生季除對照外各處理施肥一致，各處理間(除對照外)差距也明顯減小，但依然是N1、N2傷流強(qiáng)度較高。可見，在前氮后移N1、N2處理下水稻整個(gè)生育期中根系均能保持較高活力，尤其頭季生長后期N1處理根系傷流強(qiáng)度顯著高于其他處理。

2.2.2 根系傷流強(qiáng)度與再生季產(chǎn)量的相關(guān)性

根系傷流強(qiáng)度與再生季水稻產(chǎn)量及產(chǎn)量構(gòu)成因素相關(guān)分析表明(表4)，再生季產(chǎn)量與頭季齊穗和成熟及再生季的齊穗與成熟4個(gè)時(shí)期的根系傷流強(qiáng)度均達(dá)到極顯著正相關(guān)，說明從頭季到再生季生長過程根系活力對再生季產(chǎn)量都極為重要，其中與頭季成熟期相關(guān)度最高。進(jìn)一步從產(chǎn)量構(gòu)成因素分析，有效穗數(shù)與以上4個(gè)時(shí)期的根系傷流強(qiáng)度也均為極顯著正相關(guān)，其中與頭季成熟期根系傷流強(qiáng)度相關(guān)度最高；每穗粒數(shù)與再生季成熟期的根系傷流強(qiáng)度顯著相關(guān)，但與頭季齊穗期、頭季成熟期及再生季齊穗期根系傷流量強(qiáng)度相關(guān)未達(dá)顯著水平；其他產(chǎn)量構(gòu)成因素與根系傷流強(qiáng)度之間相關(guān)不顯著。由此可見，根系活力主要通過影響有效穗數(shù)從而影響再生季產(chǎn)量，且以頭季齊穗至頭季成熟期根系活力最為關(guān)鍵。

2.3 根際土壤酶活性變化及其根系活力的相關(guān)性

2.3.1 土壤酶活性變化

表5表明，水稻根際土壤與營養(yǎng)轉(zhuǎn)化相關(guān)的蔗糖酶、過氧化氫酶、脲酶和硝酸還原酶活性，頭季和再生季均表現(xiàn)為齊穗期高于成熟期，但不同土壤酶在不同生育時(shí)期間變化趨勢并不完全一致。

表3 頭季-再生季水稻產(chǎn)量及產(chǎn)量構(gòu)成因素變化(2年平均值)

同一列中同一稻作類型各平均數(shù)之后不同小寫字母表示差異達(dá)5%顯著水平。下同。

Different letters indicate statistical significance at the 0.05 probability level within the same column for the same cropping system.

表4 水稻根系傷流強(qiáng)度與再生季產(chǎn)量及其構(gòu)成因素的相關(guān)性

*和**分別表示=0.05和=0.01顯著水平；=15，0.05=0.5139;0.01=0.6411。

* indicate significant correlation at the level of 0.05;**indicate extremely significant correlation at the level of 0.01.=15，0.05=0.5139;0.01=0.6411.

蔗糖酶活性總體表現(xiàn)為頭季齊穗期最高，頭季成熟期下降。再生季齊穗有較大幅度上升，至再生季成熟期又下降。從不同處理看，在頭季齊穗期中蔗糖活性最高的為N2處理，比N0和N4分別高出171.12%和136.75%，其次為N1、N3、N4、N0處理，但其他3個(gè)時(shí)期均是N1處理活性最強(qiáng)，其次是N2處理。

圖2 頭季水稻生長后期根際細(xì)菌群落Shannon-Wiener曲線

Fig.2.Shannon-Wiener curves of bacterial community in rhizosphere soil at the late stage of main crop rice.

表5 根際土壤酶活性隨水稻生育時(shí)期變化情況

過氧化氫酶各處理在頭季齊穗期和成熟期均表現(xiàn)為前氮后移的N1、N2處理顯著高于其他處理，但N1與N2處理間差異不顯著，頭季齊穗期N1、N2處理分別比N4處理(當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)施肥)高出14.83%、10.97%，頭季成熟期N1、N2處理分別比N4處理高出18.94%、17.42%。但到了再生季齊穗期和成熟期各施肥處理均顯著高于不施肥對照，但各施肥處理間差異不顯著。

脲酶廣泛存在于土壤之中，與尿素氮肥水解密切相關(guān)，在一定程度上反映土壤的供氮能力。頭季稻齊穗期、成熟期和再生季齊穗期各處理脲酶均表現(xiàn)為N1＞N2＞N3＞N4＞N0，但N1與N2處理間差異不顯著，到了再生季成熟期各施肥處理間差異不顯著，但各施肥處理均顯著高于不施肥對照。

在頭季稻生長期內(nèi)，各處理硝酸還原酶活性差異大多顯著，在頭季稻齊穗期和成熟期均表現(xiàn)為N1＞N2＞N3＞N4＞N0，但N1與N2處理間差異不顯著，N3與N2處理間差異不顯著；到了再生季齊穗期和成熟期各施肥處理間差異不顯著，但各施肥處理均顯著高于不施肥對照。

2.3.2 根系傷流強(qiáng)度與土壤酶活性的相關(guān)性

不同生育時(shí)期根系傷流強(qiáng)度與土壤酶活性的相關(guān)性分析表明(表6)：根系傷流強(qiáng)度與頭季齊穗期至再生季成熟期各時(shí)期的蔗糖酶、過氧化氫酶、脲酶及硝酸還原酶酶活性均呈極顯著或顯著正相關(guān)。其中，與蔗糖酶活性的相關(guān)性不管是頭季還是再生季其齊穗期相關(guān)性均大于成熟期；與土壤解毒相關(guān)的過氧化氫酶及與氮素營養(yǎng)相關(guān)的脲酶和硝酸還原酶活性的相關(guān)系數(shù)則表現(xiàn)為頭季大于再生季?？梢姡^季稻籽粒灌漿過程，即頭季齊穗期至頭季成熟期土壤酶活性對根系生長的影響更突出。

表6 根系傷流強(qiáng)度與土壤酶活性的相關(guān)性分析

*和**分別表示=0.05和=0.01顯著水平；=15，r0.05=0.5139; r0.01=0.6411。

* indicate significant correlation at the level of 0.05 level; **indicate extremely significant correlation at the level of 0.01.

圓圈相交部分表示共有微生物數(shù)目，非相交部分表示特有微生物數(shù)目

Fig.3.Venn graph of bacterial OTUs in rhizosphere soil at the late stage of main rice.

2.4 根際土壤細(xì)菌群落的變化

頭季水稻生長后期是決定其收割后稻樁上腋芽萌發(fā)好壞的關(guān)鍵時(shí)期，腋芽的萌發(fā)又與其根系生長好壞有著直接的關(guān)系，而土壤微生物參與土壤中的各種生物化學(xué)過程，是土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化、活化的主要?jiǎng)恿?，是影響根系生長的主要環(huán)境因素。

2.4.1 根際土壤細(xì)菌群落Alpha多樣性分析

Shannon-Wiener曲線是采用97%相似度的 OTU 對所測定土壤樣本進(jìn)行稀釋曲線分析，用以反映各樣本在不同測序數(shù)量時(shí)的微生物多樣性[26]。通過不同樣本的測序量在不同測序深度水平上的微生物多樣性指數(shù)來構(gòu)建稀釋性曲線，由于深層次測序數(shù)量只會(huì)產(chǎn)生少量新增的OTU，因此，當(dāng)曲線趨向平坦時(shí)，說明測序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣品中絕大多數(shù)的微生物信息。從圖2可以看出，隨著測序深度的增加，各處理下的OTU數(shù)逐漸增長，隨后趨于平坦，說明各處理測序數(shù)據(jù)量合理，所測根際土壤樣本可以反映大多數(shù)細(xì)菌群落信息。observed_species指數(shù)是指隨測序深度的增加，實(shí)測到 OTU 的數(shù)量，Coverage為樣本文庫覆蓋度。表7表明，5個(gè)處理的observed_species和Coverage兩個(gè)指數(shù)差異都不顯著，且數(shù)值均處于合理范圍，Coverage各樣本測序覆蓋度均大于0.95，樣本測序結(jié)果已經(jīng)包含樣本中絕大部分的細(xì)菌物種，可以進(jìn)行后續(xù)分析。

表7顯示了頭季不同氮肥管理下土壤根際細(xì)菌群落Alpha多樣性指數(shù)。Chao1 指數(shù)反映樣品中群落的豐富度，與樣品中物種豐富性呈正相關(guān)。表7表明，所有施肥處理Chao1 指數(shù)均高于對照N0處理，N1處理其值最高，其次是N2處理，但N1與N2處理間差異不顯著，N3、N4與N0間差異不顯著；Shannon 指數(shù)反映群落的多樣性，5個(gè)處理中N1處理其值最高，顯著高于不施肥的N0處理和當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)施肥N4處理，其他4個(gè)處理間差異不顯著；PD_whole_tree指數(shù)反映了樣品中物種對進(jìn)化歷史保存的差異。表7表明，N1處理PD_whole_tree指數(shù)值最高，N2次之，兩者間無顯著差異，但顯著高于N0和N4處理。

表7 頭季水稻生長后期根際土壤細(xì)菌群落多樣性指數(shù)

韋恩圖(Venn Graph)可以用來比較樣本之間特有及共有的OTU (操作分類單元)數(shù)量。圖3表明，在頭季不同氮肥運(yùn)籌下，鑒定到頭季生長后期N0、N1、N2、N3、N4處理的根際土壤OTU數(shù)分別2534、2655、2581、2533、2531個(gè)。其中，N1處理所測定的OTU數(shù)量最多，達(dá)到2655個(gè)，其次是N2處理。5個(gè)處理共有OTU 1612個(gè)，N0、N1、N2、N3和N4處理特有的OTU數(shù)分別為83、80、72、57、52個(gè)，說明不施肥處理下存在特有的OTU數(shù)量最多，而在頭季同等施肥量條件下，N1處理特有的OTU數(shù)高于其他施肥處理，N2次之，N3、N4處理特有的OTU數(shù)量則明顯減少。

圖4 頭季稻生長后期根際土壤細(xì)菌群落PCA分析

Fig.4.PCA analysis of bacterial community in rhizosphere soil at the late stage of main crop rice.

2.4.2 根際土壤細(xì)菌群落PCA分析

PCA分析(Principal Component Analysis)，即主成分分析，通過分析不同樣本中97%相似性的OTU組成，可以初步反映出各處理樣本間可能表現(xiàn)出分散和聚集的分布情況。如圖4所示，主成分1和主成分2反映處理間差異的方差累計(jì)貢獻(xiàn)率分別為25.52%和10.97%?？傮w來看，頭季水稻施肥與不施肥處理引起的差異主要沿著橫軸PC1分布，不施肥的N0處理位于主成分1的負(fù)端，遠(yuǎn)離各施肥處理，表明施肥處理與不施肥處理細(xì)菌群落差異性較大；N2、N3和N4處理位于主成分1的正端且區(qū)分不明顯，N1處理與這3個(gè)處理有一定的距離，表明N1處理與N2、N3、N4之間細(xì)菌群落差異性也比較大。由施肥處理引起的差異主要沿著縱軸PC2分布，N3與N4處理間差異小主要位于PC2的負(fù)端，N2處理則位于PC2的正端，N1則位于二者之間。可見，主成分分析基本上能夠區(qū)分不同施肥處理間根際土壤微生物的群落特征，尤其是施肥與不施肥處理間區(qū)分明顯。

2.4.3 根際細(xì)菌群落構(gòu)成分析

將優(yōu)質(zhì)序列聚類后得到的OTU進(jìn)行物種注釋，選取各分類水平上豐度最高的物種繪制優(yōu)勢物種的相對豐度柱形圖。圖5-A顯示，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)中相對豐度大于1%的門類中位于前10位的從大到小依次為酸桿菌門(Acidobacteria)、變形菌門(Proteo bacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、放線菌門(Actinobacteria)、疣微菌門(Verrucomi crobia)、Latescibaoteria、Lgnavibacteriae和擬桿菌門(Bacteroidetes)，共占總數(shù)的93%以上。各處理均以酸桿菌門相對豐度最高，達(dá)24%～40%，其中，N4處理酸桿菌門相對豐度最高，N1處理最低；N1處理變形菌門和綠彎菌門相對豐度均最高，其他各處理間無顯著差異；硝化螺旋菌門是一類革蘭氏陰性細(xì)菌，N1處理相對豐度最高，其次是N0處理，其他各處理間差異不大。芽單胞菌門各施肥處理高于不施肥處理，但施肥處理間差異不顯著。

圖5-B表明，共鑒定到的細(xì)菌綱類有25個(gè)。其中根際相對豐度大于1%的綱類(top10)從大到小依次酸桿菌(Acidobacter)、變形菌(Deltaproteobac teria)、α-變形菌-革蘭氏陰性菌(Alphaproteobact eria)、硝化螺旋菌門下的Niterospira、SBR2076，酸桿菌門下的Solibacteres、未被鑒定的綱類、β-變形菌綱(Betaproteobacteria)、Subgroup_18和纖線桿菌綱(Ktedonobacteria)。其中，N2、N3、N4處理中酸桿菌綱類、纖線桿菌綱相對豐度比較高；N0和N1處理中變形菌綱類、SBR2076相對豐度比較高；N1、N2處理中β-變形菌綱的相對豐度較高。

圖5-C顯示，共鑒定到的細(xì)菌屬類10個(gè)，已鑒定的比重最大的細(xì)菌屬是，屬于念珠菌屬中分解有機(jī)質(zhì)、利用碳源的細(xì)菌。其他依次為地桿菌屬()、、氨基酸桿菌屬()、。其中N0、N1處理地桿菌屬顯著高于其他處理。與對照不施肥處理相比較，各施肥處理中氨基酸桿菌屬相對豐度較高，該菌屬主要功能有利于發(fā)酵土壤氨基酸，特別是谷氨酸。

A－門水平差異；B－綱水平差異；C－屬水平差異。

Fig.5.Changes in the relative abundance of main bacteria in the rhizosphere soil at the late growth stage of main crop rice.

2.4.4 根際土壤細(xì)菌功能分析

如表8所示，相比不施肥(N0)處理，各施肥處理的根際土壤紅假單胞菌屬、硝化螺旋菌屬、羅氏菌屬、土壤桿菌屬、酸桿菌菌屬、黏細(xì)菌屬微生物相對豐度均有所提升，而厭氧繩菌屬、假雙頭斧形菌屬和嘉利翁氏鐵柄桿菌屬的微生物相對豐度有所下降。其中，紅假單胞菌屬屬于固氮細(xì)菌類型，而硝化螺旋菌屬則參與地球氮循環(huán)的硝化作用，二者均與土壤氮素循環(huán)有關(guān)[27]，各施肥處理紅假單胞菌屬豐度均比不施肥處理的有所提高，其中N3處理豐度最高，依次為N4、N2、N1處理；各施肥處理下硝化螺旋菌屬的微生物豐度明顯高于對照，尤其前氮后移的N1和N2處理要高于N3和N4處理，表明施肥尤其頭季前氮后移有利頭季生長后期根際土壤硝化螺旋菌屬數(shù)量的增加，從而促進(jìn)土壤氮循環(huán)。土壤桿菌屬和酸桿菌菌屬功能與改善土壤質(zhì)地及增加土壤有機(jī)質(zhì)有關(guān)[28]，各施肥處理均顯著高于不施肥處理，促進(jìn)土壤化能有機(jī)營養(yǎng)，從而提高土壤有機(jī)質(zhì)含量。黏細(xì)菌屬微生物有利提高作物的抗逆性，各施肥處理黏細(xì)菌屬微生物豐度均比不施肥顯著提高，前期施氮較重的N3、N4處理比前氮后移施肥處理的N1、N2處理來得高。此外，厭氧繩菌屬、假雙頭斧形菌屬、嘉利翁氏鐵柄桿菌屬微生物相對豐度則表現(xiàn)為不施肥(N0)處理高于各施肥處理，說明不施肥處理促進(jìn)土壤碳水化合物降解且土壤微生物耐藥能力要強(qiáng)于施肥處理，不施肥處理中嘉利翁氏鐵柄桿菌屬的增加則會(huì)促進(jìn)土壤中二價(jià)亞鐵氧化成三價(jià)鐵，濃縮和積累土壤環(huán)境中的鐵元素[29]。

3 討論

再生稻是頭季稻收割后稻樁上休眠腋芽萌發(fā)生長抽穗再收獲的一季水稻，因此，頭季稻收割后休眠腋芽能否萌發(fā)成苗是再生稻栽培的關(guān)鍵。鄭景生等[5]研究指出再生稻再生分蘗的生長發(fā)育依賴于頭季稻殘留的根系。在本研究中，頭季齊穗期各處理根系傷流強(qiáng)度均達(dá)到峰值，其中N1(基肥∶一次分蘗肥∶二次分蘗肥∶孕穗肥=3∶1∶2∶4)處理最高，其次是N2處理，N1處理分別比N0和N4處理高75.65%、47.89%。進(jìn)一步的相關(guān)分析表明，再生季水稻產(chǎn)量，尤其是產(chǎn)量構(gòu)成中的有效穗數(shù)與各時(shí)期(頭季齊穗至再生季成熟)，特別是頭季稻生長后期的根系活力呈極顯著正相關(guān)(表4)。劉富貴等[30]研究也表明頭季稻根系對再生季稻的生長發(fā)育起主導(dǎo)作用?？梢?，前氮后移的N1處理因?yàn)楦祷盍?qiáng)，尤其頭季后期根系不早衰不僅有利頭季產(chǎn)量提高，也為后季再生苗分蘗成穗提供了保障，因而兩季實(shí)際總產(chǎn)最高，比當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)施肥N4處理提高了23.00%。

表8 頭季水稻生長后期根際土壤中主要功能菌及其相對豐度

作物根系的形態(tài)和機(jī)能具有品種的固有遺傳特性，同時(shí)也受到環(huán)境的影響[31]。土壤是作物根生長的基礎(chǔ)，也是作物高產(chǎn)的基礎(chǔ)。土壤微生物種群結(jié)構(gòu)及土壤酶活性是土壤微生態(tài)環(huán)境中生理活性最強(qiáng)的部分。其中，土壤酶主要來源于土壤微生物和植物根系的分泌物，在物質(zhì)循環(huán)和營養(yǎng)轉(zhuǎn)化過程中起著關(guān)鍵作用[32]。土壤中蔗糖酶對增加土壤中易溶性營養(yǎng)物質(zhì)起重要作用，脲酶可以表征土壤的氮素供應(yīng)狀況。在本研究中，頭季不同氮肥運(yùn)籌方式下前氮后移的N1、N2處理頭季齊穗期和成熟期及再生季齊穗期，這兩種酶活性均著高于常規(guī)施肥N4處理和對照N0處理；N1、N2處理的過氧化物酶和硝酸還原酶在頭季齊穗與成熟期顯著高于常規(guī)施肥N4處理，在再生季各施肥處理顯著高于對照，但施肥處理間不顯著。前人研究也表明前氮后移有利于土壤協(xié)調(diào)發(fā)展，提高土壤脲酶、蔗糖酶等養(yǎng)分循環(huán)有關(guān)的酶活性，提高土壤有機(jī)質(zhì)含量和土壤養(yǎng)分有效性[33-35]，這與本研究結(jié)果一致。張福鎖等[36]認(rèn)為栽培調(diào)控的實(shí)質(zhì)是調(diào)控根際環(huán)境, 為作物創(chuàng)造良好的根際生態(tài)環(huán)境從而調(diào)控作物、土壤與微生物間的平衡，達(dá)到促進(jìn)作物生長發(fā)育的目的。本研究進(jìn)一步的相關(guān)分析表明，根系傷流強(qiáng)度與頭季齊穗期至再生季成熟期土壤相關(guān)酶活性均達(dá)到顯著或極顯著正相關(guān)，尤其是頭季齊穗至成熟與土壤解毒相關(guān)的過氧化氫酶及與氮素營養(yǎng)相關(guān)的脲酶和硝酸還原酶的相關(guān)性要高于再生季齊穗至成熟期。由此可見，再生稻生長期間尤其頭季稻生長后期土壤養(yǎng)分循環(huán)有關(guān)的酶活性的協(xié)調(diào)，有利再生稻根系的生長從而促進(jìn)植株對營養(yǎng)成分的吸收，實(shí)現(xiàn)水稻高產(chǎn)高效的目的。

根際土壤微生物是根際土壤酶的重要來源, 同時(shí)也直接參與根際的生物過程。本研究細(xì)菌 16S rDNA 高通量測序表明施肥處理與不施肥處理細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性有顯著差異，機(jī)械化栽培中，前氮后移的N1處理細(xì)菌 Chao1 指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)顯著高于其他處理。菌群群落構(gòu)成分析表明, 各施肥處理芽單胞菌門高于不施肥處理，各施肥處理中，N1處理下變形菌門、綠彎菌門和硝化螺旋菌門相對豐度均最高。在屬水平上，各處理檢測到念珠菌屬、地桿菌屬、氨基酸桿菌屬等，與不施肥(N0)處理相比，施肥處理中的氨基酸桿菌屬較多，主要有利于發(fā)酵土壤氨基酸，提高土壤化能有機(jī)營養(yǎng)能力。在屬水平下主要細(xì)菌屬功能分析(表8)表明，各施肥處理中紅假細(xì)胞菌屬、黏細(xì)菌屬等微生物的提升在很大程度上能夠改善土壤質(zhì)地，有效促進(jìn)土壤的碳氮循環(huán)，提高土壤抗逆性[37]，尤其是N1處理硝化螺旋菌屬豐度最高，可以利用尿素作為營養(yǎng)來源，在它們的基因組中編碼的脲酶可以將尿素分解為土壤所需養(yǎng)分，促進(jìn)土壤氮素循環(huán)[38-41]，加之酸桿菌菌屬豐度的提高有利增加土壤有機(jī)質(zhì)含量，提高土壤肥力，為水稻的生長發(fā)育提供良好的微生物環(huán)境。

4 結(jié)論

綜上所述，再生稻機(jī)械化栽培在頭季稻總氮量保持不變情況下，氮肥適當(dāng)后移的運(yùn)籌方式，可提高再生稻根際土壤微生物多樣性，增加根際土壤中促進(jìn)碳氮循環(huán)及提高土壤抗逆性密切相關(guān)的細(xì)菌數(shù)量，有利協(xié)調(diào)土壤養(yǎng)分循環(huán)有關(guān)的酶活性，從而活化再生稻尤其是頭季生長后期根際功能，促進(jìn)根系對養(yǎng)分的吸收，達(dá)到兩季水稻高產(chǎn)。在本研究中，N1處理(基肥∶一次分蘗肥∶二次分蘗肥∶孕穗肥=3∶1∶2∶4)最有利根際機(jī)能的改善，兩季水稻總產(chǎn)量最高。

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Nitrogen Fertilizer Management for Main Crop Rice and Its Carrying-over Effect on Rhizosphere Function and Yield of Ratoon Rice

HUANG Jinwen1,#, WU Jiayi1, #, CHEN Hongfei1, ZHANG Zhixing1, FANG Changxun1, SHAO Caihong2, LIN Weiwei1, WENG Peiying1, LIN Wenxiong1, *

(Key Laboratory for Genetics Breeding and Multiple Utilization of Crops, Ministry of Education/ College of Agriculture, Fujian Agriculture and Forestry University/Key Laboratory of Crop Ecology and Molecular Physiology, Fuzhou 350002, China; Institute of Soil Fertilizer and Resources Environment, Jiangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanchang 330200, China; )

【Objective】Ratoon rice is the continuation of the main crop.We attempt to elucidate the effect of mechanical transplanting of main crop together with nitrogen fertilizer management on the yield of the main crop and ratoon rice from the perspective of rhizosphere microecosystem, which may provide a reference for the high-yielding and efficient cultivation of ratoon rice.【Method】The rice genotype of Yongyou 1540 was used as the material.At a total nitrogen application level of 225.00 kg/hm2in the main crop, different nitrogen fertilizer treatments were designed to analyze the effects of mechanical cultivation on the yield, root bleeding intensity, enzyme activities and microbial diversity in rhizosphere soil in two consecutive years in paddy field.【Result】In N1 and N2 treatments, the root system maintained higher vigor, especially in the late growing period of the main season in the N1 treatment (basal fertilizer : primary fertilizer for tillering : secondary fertilizer for tillering : fertilizer for panicle initiation= 3 : 1 : 2 : 4) showed a significant increase in root bleeding intensity as compared with the control N0 and the local conventional treatment of N4.The total yield of the N1 treatment was the highest in the two growing seasons, reaching an average of 17 351.23 kg/hm2, 23.00% higher than that of N4.Soil enzyme activity analysis showed that the activities of sucrase followed the trend of N2>N1>N3>N4>N0 in the full heading stage during the main season, but N1>N2> N3>N3>N4>N0 for ratoon rice; the activities of catalase and nitrate reductase both followed a trend of N1>N2> N3>N4>N0 in the full heading stage during the main season; the activities of urease, N1>N2> N3>N4>N0 from the heading stage of the main crop to the heading stage of ratoon rice.Highly significant positive correlations were observed between soil enzyme activities and root bleeding intensity at all growing stages.Bacterial 16S rDNA sequencing showed that the structural diversity of bacterial communities differed significantly between the fertilized and non-fertilized treatments, and the Chao1 index and Shannon index of N1 treatment were significantly higher than those of other treatments.Function analysis of rhizospheric bacterial community showed that fertilization increased the number of bacteria closely related to soil carbon and nitrogen cycle, soil organic matter content and soil stress resistance, especially the N1 and N2 treatment with higher relative abundance of, which were favorable to soil nitrogen cycle.【Conclusion】Under mechanical cultivation, the treatment with properly postponed nitrogen fertilizer application in the main crop is beneficial to the improvement of the rhizosphere microecosystem of ratoon rice, thus improving root vigor, promoting rice growth, and obtaining high yield of rice in both growing seasons.

ratoon rice; nitrogen management; root activity; rhizosphere; community diversity

10.16819/j.1001-7216.2021.200603

2020-06-04；

2020-08-30。

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃資助項(xiàng)目(2016YFD0300508，2017YFD0301602，2018YFD0301105)。