五指精藍(lán)顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

肖 明，譚安薔，羅宇東，李芳嬋，韋日紅

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠，廣西 南寧 530023；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200）

五指精藍(lán)顆粒由五指毛桃、黃芪、絞股藍(lán)、黃精、人參等藥材組成，具有調(diào)節(jié)免疫力、抗疲勞、健脾祛濕等功效，臨床用于防治慢性疲勞綜合征。五指毛桃為處方中的君藥，主要成分為補(bǔ)骨脂素，臨床用于脾虛浮腫、肺癆咳嗽、風(fēng)濕疼痛、慢性支氣管炎、腰酸背痛等［1］。黃芪具有抗氧化、抗疲勞、防衰老、保護(hù)心腦血管和腎臟等作用［2］，人參可提高機(jī)體免疫力［3］，兩者共為臣藥。本研究采用薄層色譜法對(duì)五指精藍(lán)顆粒處方中五指毛桃、黃芪、人參進(jìn)行定性分析，采用高效液相色譜法測(cè)定處方中補(bǔ)骨脂素的含量，為五指精藍(lán)顆粒的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器 ME104E/02型電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；SG250HE型超聲清洗儀（上海冠特超聲儀器有限公司）；XMTD-8222型高效液相色譜儀（安捷倫Agilent科技有限公司）。

1.2 試藥 五指精藍(lán)顆粒（批號(hào)：20190301、20190302、20190303、20190304、20190401、20190402、20190403、20190404、20190501、20190502）由廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬制藥廠提供；補(bǔ)骨脂素、五指毛桃對(duì)照藥材、人參對(duì)照藥材、黃芪對(duì)照藥材由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；乙腈和甲醇為色譜純，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 五指毛桃的薄層鑒別

2.1.1.1 供試品溶液的制備 取適量五指精藍(lán)顆粒樣品，研細(xì)，稱(chēng)取5 g于三角瓶中，加入30 ml乙酸乙酯超聲提取30 min，冷卻后，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)舆m量乙酸乙酯溶解，定容至2 ml，即得。

2.1.1.2 對(duì)照藥材溶液的制備 稱(chēng)取五指毛桃對(duì)照藥材粉末約5 g，按照“2.1.1.1”供試品溶液的制備方法操作，即得五指毛桃對(duì)照藥材溶液。

2.1.1.3 陰性樣品對(duì)照溶液 按處方制備缺五指毛桃的陰性樣品，研細(xì)，稱(chēng)取5 g，按照“2.1.1.1”供試品溶液的制備方法操作，制成缺五指毛桃陰性對(duì)照溶液。

2.1.1.4 補(bǔ)骨脂素對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取補(bǔ)骨脂素對(duì)照品2 mg，用少量甲醇溶解，定容至10 ml量瓶，即得補(bǔ)骨脂素對(duì)照品溶液。

按《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版通則0502薄層色譜法［4］操作，精密吸取以上4種溶液各5μl，分別點(diǎn)在同一塊薄層硅膠G板上，以正己烷-乙酸乙酯-甲酸-三氯甲烷（18∶6∶0.8∶5）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果見(jiàn)圖1。供試品在與對(duì)照藥材、對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上出現(xiàn)相同的熒光斑點(diǎn)，而陰性樣品色譜在相應(yīng)位置上未出現(xiàn)斑點(diǎn)，表明陰性樣品對(duì)鑒別無(wú)干擾。

圖1 五指毛桃TLC色譜圖

2.1.2 黃芪的薄層鑒別

2.1.2.1 供試品溶液的制備 取五指精藍(lán)顆粒樣品，研細(xì)，稱(chēng)取3 g于三角瓶中，加入95%乙醇30 ml超聲30 min，濾過(guò)，棄去濾渣，濾液水浴蒸干，殘?jiān)?.3%氫氧化鈉溶液10 ml溶解，濾紙過(guò)濾。濾液置于小燒杯中，用稀鹽酸將pH值調(diào)至5～6，再加入乙酸乙酯10 ml，分液漏斗振搖提取，靜置分層，取上層乙酸乙酯試液。用無(wú)水硫酸鈉溶液濕潤(rùn)后的濾紙過(guò)濾，濾液用蒸發(fā)皿置于水浴鍋上加熱蒸干，其剩下的殘?jiān)眠m量乙酸乙酯溶解，并將其轉(zhuǎn)移至2 ml量瓶中定容至刻度，作為五指精藍(lán)顆粒供試品溶液，備用。

2.1.2.2 對(duì)照藥材溶液的制備 稱(chēng)取黃芪對(duì)照藥材粉末2 g，按“2.1.2.1”方法制備，制得黃芪對(duì)照品藥材溶液。

2.1.2.3 陰性樣品溶液 按處方制備不含黃芪的陰性樣品，并按“2.1.2.1”方法制備得缺黃芪的陰性樣品溶液。

精密吸取以上3種溶液各5μl，分別點(diǎn)在同一塊薄層硅膠G薄層板上，展開(kāi)劑為甲烷-甲醇（10∶1），展開(kāi)，晾干，置裝有飽和氨蒸氣的展開(kāi)缸中熏至斑點(diǎn)顯色，取出，紫外光燈（365 nm）下檢視。見(jiàn)圖2。五指精藍(lán)顆粒供試品在與黃芪對(duì)照藥材相應(yīng)位置上有相同顏色的熒光斑點(diǎn)，而陰性樣品在相應(yīng)位置上無(wú)斑點(diǎn)出現(xiàn)。

圖2 黃芪TLC色譜圖

2.1.3 人參的薄層鑒別

2.1.3.1 對(duì)照藥材溶液的制備 稱(chēng)取人參對(duì)照藥材粉末約1.5 g，加入40 ml三氯甲烷溶液，加熱回流提取1 h，待試劑冷卻后，過(guò)濾除去三氯甲烷溶液，藥渣揮干三氯甲烷溶液，置于三角瓶中，用適量水濕潤(rùn)，加入水飽和正丁醇溶液10 ml超聲提取30 min，放冷，濾過(guò)，濾液裝入分液漏斗中，加入3倍量氨水溶液，振搖提取，靜置等待分層，取上層溶液，放入蒸發(fā)皿中用水浴鍋加熱蒸干，殘?jiān)舆m量甲醇溶解，并轉(zhuǎn)移至2 ml量瓶中定容至刻度，作為人參藥材對(duì)照品溶液。

2.1.3.2 供試品溶液的制備 取五指精藍(lán)顆粒樣品研細(xì)，稱(chēng)取約3 g，加三氯甲烷溶液30 ml在分液漏斗中振搖提取，共2次，靜置分層后，分取上層溶液合并備用。用水飽和正丁醇溶液20 ml振搖提取，共5次，取上層溶液，合并5次提取液。用氨水試液振搖洗滌2次，每次80 ml，洗滌后取上層正丁醇溶液，合并2次提取液，水浴蒸干。剩余的殘?jiān)尤?0%乙醇溶液10 ml溶解，經(jīng)D型大孔吸附樹(shù)脂柱洗脫（內(nèi)徑1.5 cm，長(zhǎng)12 cm），先以50 ml純水洗脫，然后再以40%乙醇30 ml洗脫，棄去洗脫液；加入70%乙醇溶液50 ml洗脫，收集洗脫液，水浴蒸干后用適量甲醇溶解，并轉(zhuǎn)移至2 ml量瓶中定容至刻度，作為供試品溶液，備用。

2.1.3.3 陰性樣品溶液的制備 根據(jù)處方工藝制備不含人參的陰性樣品，按“2.1.3.2”項(xiàng)下方法制得缺人參的陰性樣品溶液。

精密吸取上述3種溶液各5μl，點(diǎn)于同一塊薄層硅膠G板上，用［正丁醇-乙酸乙酯-水（5∶1.2∶6）的上層溶液］-甲醇（10∶1）的混合溶液作為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出晾干，噴以10%硫酸-乙醇溶液使其濕潤(rùn)，晾干，放入烘箱中100℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，紫外光燈（365 nm）下檢視。見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示，供試品溶液在與人參對(duì)照藥材色譜在相應(yīng)位置上出現(xiàn)相同顏色斑點(diǎn)，而陰性樣品色譜在相應(yīng)位置上無(wú)斑點(diǎn)出現(xiàn)。

圖3 人參TLC色譜圖

2.2 補(bǔ)骨脂素的含量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取補(bǔ)骨脂素對(duì)照品5.09 mg，置于10 ml容量瓶中，用少量甲醇（色譜純）溶解并定容至刻度，即得到濃度為含0.509 mg/ml的補(bǔ)骨脂素對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取適量五指精藍(lán)顆粒樣品研細(xì)，精密稱(chēng)定3.0 g置于具塞錐形瓶中，加入75%乙醇溶液25 ml超聲提取30 min，靜置冷卻后用75%乙醇溶液補(bǔ)足重量，振搖均勻，過(guò)濾，濾液用蒸發(fā)皿水浴蒸干，剩余殘?jiān)由倭考状既芙猓糜?0 ml量瓶中用甲醇定容至刻度，搖勻，即得五指精藍(lán)顆粒供試品溶液。

2.2.3 缺五指毛桃的陰性樣品溶液的制備 按處方制備缺五指毛桃的五指精藍(lán)顆粒陰性樣品，取適量陰性樣品，研細(xì)成粉末，精密稱(chēng)取約3 g，按照“2.2.2”五指精藍(lán)顆粒供試品溶液的操作步驟，制備得陰性樣品溶液，備用。

2.2.4 色譜條件參考文獻(xiàn)［5］選定色譜條件。色譜柱：Gemini C18110A（5μm，250 mm×4.6 mm）；流動(dòng)相：乙腈-0.2%磷酸溶液（40∶60）；進(jìn)樣量：10μl；流速：1.0 ml/min；柱溫：40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：245 nm。

2.2.5 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及缺五指毛桃的陰性溶液各10μl，依次注入高效液相色譜儀中，按上述“2.2.4”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果補(bǔ)骨脂素基線分離良好，且其它成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 五指精藍(lán)顆粒HPLC色譜圖

2.2.6 線性關(guān)系考察 取上述補(bǔ)骨脂素對(duì)照品溶液，分別制成濃度為0.203 6 mg/ml、0.407 2 mg/ml、0.814 4 mg/ml、1.221 6 mg/ml、1.628 8 mg/ml、2.036 0 mg/ml的對(duì)照品系列溶液。精密吸取系列溶液各10μl，按照“2.2.4”色譜條件進(jìn)樣測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣量濃度作為橫坐標(biāo)（X），峰面積作為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為：Y=58 234.73X+776 018 415。結(jié)果顯示，補(bǔ)骨脂素進(jìn)樣濃度在0.203 6～2.03 6 mg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為r=0.999 8。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 取上述“2.2.1”補(bǔ)骨脂素對(duì)照品溶液，精密吸取1 ml于10 ml量瓶中，用甲醇稀釋?zhuān)ㄈ?，搖勻，精密吸取稀釋后的對(duì)照品溶液10μl，依照“2.2.4”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)操作6次，記錄峰面積。結(jié)果平均峰面積為1 288 396.333，峰面積RSD為0.20%（n=6），結(jié)果顯示該儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取五指精藍(lán)顆粒樣品，按“2.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液。分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h后精密吸取10μl注入高效液相色譜儀中，測(cè)定補(bǔ)骨脂素含量。求得峰面積分別為8 262 010、8 242 062、8 258 315、8 226 052、8 195 624、8 174 613、8 198 844，平均峰面積為8 222 502，RSD為0.41%（n=7），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批五指精藍(lán)顆粒樣品，按“2.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液6份，按上述“2.2.4”色譜條件測(cè)定方法測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算出含量為0.818 mg/g、0.827 mg/g、0.825 mg/g、0.821 mg/g、0.818 mg/g、0.823 mg/g，平均含量為0.822 mg/g，RSD為0.45%（n=6），可見(jiàn)該測(cè)定方法的重復(fù)性良好。

2.2.10 加樣回收試驗(yàn) 取同一批已知補(bǔ)骨脂素含量的五指精藍(lán)顆粒樣品共9份，每份約0.6 g（含補(bǔ)骨脂素0.861 2 mg/g），研末，按照1∶1比例分別加入補(bǔ)骨脂素對(duì)照品，分別精密吸取1 ml對(duì)照品溶液加入到樣品中，混合均勻，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。再按照“2.2.4”項(xiàng)下的測(cè)定方法對(duì)樣品進(jìn)行含量測(cè)定。經(jīng)計(jì)算，樣品平均回收率為99.53%，RSD為1.11%（n=9），結(jié)果表明該方法回收率良好。見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率結(jié)果 （n=9）

2.2.11 樣品含量測(cè)定 分別取10份不同批號(hào)的五指精藍(lán)顆粒樣品，每份約1 g，精密稱(chēng)定，按“2.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液。分別精密吸取供試品溶液和補(bǔ)骨脂素對(duì)照品溶液各10μl，按照“2.2.4”測(cè)定方法進(jìn)樣測(cè)定。見(jiàn)表2。

表2 五指精藍(lán)顆粒中補(bǔ)骨脂素的含量測(cè)定結(jié)果（n=10）

按照擬定方法測(cè)定含量，五指精藍(lán)顆粒每袋以10 g計(jì)算，10批樣品補(bǔ)骨脂素總量分別在7.29～8.39 mg/袋之間，考慮到每批藥材含量不同、制備工藝等因素的影響，故暫制定限度為“本品每袋（10 g）含五指毛桃以補(bǔ)骨脂素總量計(jì)算，不得少于7.0 mg”。

3 討論

本研究對(duì)五指精藍(lán)顆粒中的五指毛桃、黃芪、人參藥材進(jìn)行了薄層鑒別，其中五指毛桃藥材的鑒別參考了《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版通則0502方法，展開(kāi)劑為正己烷-乙酸乙酯-甲酸-三氯甲烷（20∶5∶0.7∶4），但在紫外燈光下觀察，斑點(diǎn)顯示分離得不夠清晰，邊緣效應(yīng)也較明顯；經(jīng)過(guò)調(diào)整展開(kāi)劑的比例，最終選用正己烷-乙酸乙酯-甲酸-三氯甲烷（18∶6∶0.8∶5）的混合溶液為展開(kāi)劑，可清晰觀察到五指精藍(lán)顆粒樣品在與五指毛桃對(duì)照藥材、補(bǔ)骨脂素對(duì)照品色譜相對(duì)應(yīng)位置上出現(xiàn)相同的熒光斑點(diǎn)，且分離度良好，而缺五指毛桃陰性樣品的色譜圖上沒(méi)有出現(xiàn)相應(yīng)斑點(diǎn)。

在黃芪藥材的鑒別中，曾經(jīng)嘗試使用多種展開(kāi)劑進(jìn)行薄層鑒別，如以三氯甲烷-甲醇-水（15∶13∶5）的溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，并噴以10%硫酸乙醇溶液使其濕潤(rùn)，但在紫外燈光下查看斑點(diǎn)不清晰。經(jīng)參照藥典方法，以三氯甲烷-甲醇（10∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，經(jīng)飽和氨氣熏后，在紫外燈光下觀察，可清晰看到色譜圖上有清晰的斑點(diǎn)，且五指精藍(lán)顆粒供試品溶液與黃芪藥材對(duì)照品溶液在相應(yīng)位置上有相同斑點(diǎn)，而缺黃芪的陰性樣品溶液在相同位置上無(wú)相應(yīng)斑點(diǎn)。

五指毛桃的主要成分是補(bǔ)骨脂素，具有抗凝血、增強(qiáng)免疫力、抑制Hela細(xì)胞生長(zhǎng)、抗菌、抑制腫瘤等作用，并且對(duì)紅細(xì)胞系統(tǒng)造血有一定的促進(jìn)作用［6-7］。因此，本研究選擇將補(bǔ)骨胎素作為五指精藍(lán)顆粒中五指毛桃的指標(biāo)性成分。經(jīng)嘗試多種色譜條件，最終確定使用乙腈-0.2%磷酸作為流動(dòng)相，進(jìn)樣量為10μl，流速為1.0 ml/min，柱溫為40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為245 nm，結(jié)果分離度良好，陰性樣品對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，表明該方法可用于本品的含量測(cè)定。