銀杏葉提取物對(duì)肺纖維化模型大鼠TGF-β1、MMP-9及NF-κB表達(dá)的影響

盧岳虹，潘 玲，黃茹妍，羅湘蓉，譚玉萍，黎展華

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011）

肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）是一種慢性、進(jìn)行性、纖維化性間質(zhì)性肺疾病，其病理特點(diǎn)主要是肺成纖維細(xì)胞（fibroblast，F(xiàn)B）不斷增生和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）過(guò)度沉積，最后造成肺組織結(jié)構(gòu)的破壞，最終導(dǎo)致慢性呼吸衰竭［1-2］。近年來(lái)肺纖維化的發(fā)病率不斷升高，目前，臨床常用吡非尼酮、尼達(dá)尼布兩種藥物治療肺纖維化，可以減緩疾病的進(jìn)展，但并不能完全有效地降低死亡率［3］，且治療費(fèi)用較高，肺纖維化患者的預(yù)后仍然很差。銀杏葉為銀杏科植物銀杏的葉，其性味苦、澀、平，具有化痰平喘斂肺、活血祛瘀、通絡(luò)止痛、補(bǔ)氣養(yǎng)心等功效，早在唐代的《食療本草》中就有銀杏葉可用于治療心悸怔忡、肺虛咳喘等病癥的記載［4］。銀杏葉提取物主要含有黃酮類、萜類內(nèi)酯、氨基酸、微量元素等多種化學(xué)成分［5］。熊紅等［6］研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物在早期肺泡炎階段可抑制腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）表達(dá)，且在肺纖維化進(jìn)展中其抑制效果明顯優(yōu)于強(qiáng)的松。本實(shí)驗(yàn)觀察銀杏葉提取物對(duì)PF模型大鼠肺組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）及核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NFκB）表達(dá)的影響，為銀杏葉提取物治療PF挖掘病理生理學(xué)的潛力依據(jù)，尋找可靠的多環(huán)節(jié)調(diào)控的中醫(yī)藥治療方法，從而抑制疾病進(jìn)展。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠72只，體質(zhì)量180～200 g，動(dòng)物由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)為SCXK（湘）2016-0002。大鼠飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（溫度22～25℃，濕度60%～70%），可自由飲水及進(jìn)食，飼養(yǎng)觀察1周。

1.2 藥物與試劑 博來(lái)霉素（索萊寶生物科技有限公司）；吡非尼酮（北京康蒂尼藥業(yè)有限公司，規(guī)格：每粒100 mg）；銀杏葉提取物（德國(guó)威瑪舒培博士藥廠，規(guī)格：每片40 mg）；大鼠TGF-β1酶聯(lián)免疫試劑盒（武漢云克隆科技股份有限公司）；MMP-9以及NF-κB免疫組化試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）。

1.3 儀器 BX51T-PHD-J11型顯微鏡（日本奧林巴斯）；RM2015型石蠟切片機(jī)（德國(guó)萊卡）；5430/5430R型離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；MDF-382E型低溫冰箱（日本三洋）；DSHZ-300型恒溫水浴箱（江蘇太倉(cāng)醫(yī)用儀器廠）。

2 方法

2.1 分組 72只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為6組：正常對(duì)照組、肺纖維化模型組、吡非尼酮組、銀杏葉提取物高劑量組、銀杏葉提取物中劑量組、銀杏葉提取物低劑量組，每組12只。

2.2 PF大鼠造模 參考文獻(xiàn)［7］方法進(jìn)行造模。以10%水合氯醛溶液（3 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，麻醉成功后，仰臥位剪開頸部皮膚，鑷子鈍性分離皮下組織以暴露氣管，造模組氣管內(nèi)注入博來(lái)霉素溶液（5 mg/kg），正常對(duì)照組氣管內(nèi)注入生理鹽水（1 ml/kg），均沿氣管斜刺注入，注入完畢后直立大鼠并左右旋轉(zhuǎn)10 s，使藥物分布均勻。最后縫合切口，待大鼠蘇醒。

2.3 給藥及處理 造模24 h后正常飲水進(jìn)食，造模后第8 d各組隨機(jī)處死1只大鼠，取全肺組織行病理學(xué)檢測(cè)確認(rèn)造模是否成功，檢測(cè)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院病理科進(jìn)行。確認(rèn)造模成功當(dāng)天即造模后第8 d開始灌胃給藥，連續(xù)灌胃21 d，正常對(duì)照組每日予生理鹽水10 ml/kg灌胃；肺纖維化模型組每日予生理鹽水10 ml/kg灌胃；吡非尼酮組每日予吡非尼酮溶液50 mg/kg灌胃；銀杏葉提取物高劑量組每日予銀杏葉提取物100 mg/kg灌胃；銀杏葉提取物中劑量組每日予銀杏葉提取物50 mg/kg灌胃；銀杏葉提取物低劑量組每日予銀杏葉提取物25 mg/kg灌胃。各組灌胃容積均為10 ml/kg，造模后29 d處死大鼠取材。由于纖維化模型組在造模過(guò)程中有3只大鼠死亡，因此造模后29 d各組均取8只大鼠進(jìn)行下一步研究。

2.4 取材 氣管內(nèi)給藥后第29 d，按照大鼠體重比例麻醉，麻醉成功后，腹主動(dòng)脈采血處死大鼠，采血后室溫靜置2 h，后放入離心機(jī)低速（3 000 r/min）離心20 min，取上層血清保存于-80℃冰箱中待用，取右肺葉置于4%多聚甲醛的容器中固定待用。

2.5 檢測(cè)指標(biāo)及方法

2.5.1 肺組織病理檢測(cè) 將于4%多聚甲醛溶液中固定的右肺葉行蘇木精-伊紅染色法（hematoxylineosin staining，HE）染色、Masson染色，嚴(yán)格按說(shuō)明書執(zhí)行。根據(jù)SZAPIEL等［8］描述的半定量分級(jí)系統(tǒng)方法，在光學(xué)顯微鏡下分別評(píng)估肺組織肺泡炎癥和纖維化程度。

2.5.2 血清TGF-β1測(cè)定 取已離心的各組大鼠上層血清，采用ELISA法測(cè)定血清中TGF-β1含量，具體方法參見(jiàn)ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。

2.5.3 免疫組化 取固定的右肺葉，常規(guī)石蠟包埋，行MMP-9和NF-κB免疫組化，光鏡下拍攝免疫組化染色圖片，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析，記錄各組織積分光密度（integral optical density，IOD）以及Area，再計(jì)算IOD/Area，以此作為該肺組織的蛋白表達(dá)量。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 HE染色結(jié)果 正常對(duì)照組：大鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)基本清晰，無(wú)明顯炎癥反應(yīng)。肺纖維化模型組：大鼠肺組織表現(xiàn)為肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡融合或塌陷，肺泡壁增厚變形，管腔狹窄，可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。吡非尼酮組：大鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)破壞較少，肺泡間隔少許增寬，可見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。銀杏葉提取物高劑量組：大鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)部分破壞，肺泡腔部分融合，可見(jiàn)部分炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。銀杏葉提取物中劑量組：大鼠肺組織部分肺泡結(jié)構(gòu)被破壞，肺泡壁稍有增厚，可見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。銀杏葉提取物低劑量組：大鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)部分破壞，肺泡壁增厚，部分肺泡融合或塌陷，有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠肺組織病理形態(tài)（HE染色，×100）

3.2 Masson染色結(jié)果 正常對(duì)照組：大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，氣管及血管周圍有少量呈藍(lán)色的膠原纖維。肺纖維化模型組：大鼠肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，藍(lán)色膠原纖維明顯增厚，呈條狀或大片沉積。吡非尼酮組：大鼠肺組織結(jié)構(gòu)少量被破壞，可見(jiàn)散在藍(lán)色膠原纖維沉積，呈點(diǎn)狀、絮狀沉積。銀杏葉提取物高劑量組：肺組織結(jié)構(gòu)破壞較少，可見(jiàn)散在線性及絮狀纖維化病灶。銀杏葉提取物中劑量組：肺組織結(jié)構(gòu)被破壞，肺泡融合塌陷伴有較明顯膠原纖維沉積。銀杏葉提取物低劑量組：肺組織肺泡間隔增厚，藍(lán)色膠原纖維呈絮狀沉積。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠肺組織病理形態(tài)（Masson染色，×100）

3.3 各組大鼠肺組織肺泡炎癥積分及纖維化程度 比較 見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠肺組織肺泡炎癥積分及纖維化程度比較 （分，x±s）

表1結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，肺纖維化模型組肺泡炎癥積分、纖維化積分明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與肺纖維化模型組比較，吡非尼酮組及銀杏葉提取物高、中、低劑量組肺泡炎癥積分、纖維化積分均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；而吡非尼酮組與銀杏葉提取物高、中、低劑量組比較，肺泡炎癥積分、纖維化評(píng)分差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3.4 各組大鼠血清中TGF-β1水平比較 見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清TGF-β1水平比較 （pg/ml，x±s）

表2結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，肺纖維化模型組血清中TGF-β1含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與肺纖維化模型組比較，吡非尼酮組及銀杏葉提取物高、中、低劑量組血清中TGF-β1含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與吡非尼酮組比較，銀杏葉提取物中、低劑量組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而銀杏葉提取物高劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3.5 免疫組化檢測(cè)肺組織MMP-9、NF-κB的表達(dá)情況

3.5.1 各組大鼠肺組織MMP-9、NF-κB免疫組化染色結(jié)果 見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 各組大鼠肺組織MMP-9的表達(dá)情況（免疫組化，×400）

圖4 各組大鼠肺組織NF-κB的表達(dá)情況（免疫組化，×400）

3.5.2 各組大鼠肺組織MMP-9、NF-κB表達(dá)水平 比較 見(jiàn)表3。

表3 免疫組化檢測(cè)肺組織MMP-9、NF-κB的表達(dá)情況 （IOD/Area，x±s）

表3結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，肺纖維化模型組大鼠肺組織中MMP-9、NF-κB表達(dá)染色I(xiàn)OD值明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與肺纖維化模型組比較，吡非尼酮組及銀杏葉提取物高、中、低劑量組MMP-9、NF-κB表達(dá)明顯降低（P＜0.01）；吡非尼酮組與銀杏葉提取物中、低劑量組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而與銀杏葉提取物高劑量組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

4 討 論

肺纖維化是一種呈進(jìn)行性發(fā)展的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，以肺泡壁炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡間隔增寬增厚和肺間質(zhì)纖維化為主要病理表現(xiàn)，目前發(fā)病機(jī)制尚不明確，多認(rèn)為是多種途徑共同作用所致。氣管注射博來(lái)霉素誘導(dǎo)大鼠肺纖維化模型，在造模后第28 d可觀察大鼠肺纖維化改變，且病理改變與人類肺纖維化相似［7］。本實(shí)驗(yàn)中肺纖維化模型組第29 d的HE結(jié)果顯示，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡融合或塌陷，肺泡壁增厚變形，管腔狹窄；Masson染色結(jié)果顯示肺組織大量藍(lán)色膠原纖維沉積，以上結(jié)果提示本實(shí)驗(yàn)大鼠肺纖維化模型造模成功。當(dāng)前，吡非尼酮作為治療特發(fā)性肺纖維化指南中推薦使用的藥物，具有抗炎、抗氧化和抗纖維化等作用，可以延緩肺纖維化的進(jìn)展［9］。但由于吡非尼酮價(jià)格高，臨床應(yīng)用未普遍，且研究表明吡非尼酮并不能減低肺纖維化死亡率［3］。本研究顯示，經(jīng)銀杏葉提取物與吡非尼酮干預(yù)后，肺纖維化大鼠肺組織肺泡炎癥、纖維化以及TGF-β1、MMP-9、NF-κB表達(dá)水平均較肺纖維化模型組降低，說(shuō)明銀杏葉提取物在肺纖維化模型大鼠中顯示出緩解肺泡炎和抗纖維化的作用。

TGF-β1是肺纖維發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵性因子之一，廣泛參與肺纖維化的發(fā)展過(guò)程。參與調(diào)控成纖維細(xì)胞的分化、遷移等過(guò)程，促進(jìn)ECM的過(guò)度分泌，誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞-上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），激活下游的促纖維化因子或信號(hào)級(jí)聯(lián)，促進(jìn)纖維化的發(fā)展。MMP-9可以降解ECM，改變ECM與間質(zhì)膠原的比例，而啟動(dòng)肺纖維［10］，同時(shí)，TGF-β1可刺激MMP-9產(chǎn)生，MMP-9亦能激活TGF-β1，從而促進(jìn)活性TGF-β1的積聚［11］。NF-κB可以通過(guò)對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞、TGF-β等多種細(xì)胞因子過(guò)度表達(dá)，介導(dǎo)肺泡炎和肺纖維化進(jìn)程。NF-κB是TGF-β1表達(dá)的上游調(diào)節(jié)基因，NF-κB激活后與TGF-β1的啟動(dòng)子結(jié)合，誘導(dǎo)TGF-β1的表達(dá)［12］。NF-κB還可以與MMP-9的啟動(dòng)子直接結(jié)合，對(duì)EMT起調(diào)節(jié)作用［13］。慢性阻塞性肺疾病因病情加重會(huì)出現(xiàn)肺間質(zhì)纖維，楊紅梅等［14］在對(duì)慢性阻塞性肺疾病模型大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物可以使大鼠肺組織中MMP-9和金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率明顯降低，并且使MMP-9與TIMP-1的比例趨于平衡，可達(dá)到延緩或抑制肺纖維化的發(fā)生。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇TGF-β1、MMP-9以及NF-κB作為觀察指標(biāo)，觀察銀杏葉提取物通過(guò)抑制其表達(dá)水平而影響肺纖維化的發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肺纖維化模型大鼠中TGF-β1、MMP-9以及NF-κB表達(dá)水平均升高，銀杏葉提取物干預(yù)后使原本升高的表達(dá)因子得到抑制，改善了肺纖維化的進(jìn)展，表明銀杏葉提取物可能通過(guò)抑制TGF-β1、MMP-9以及NF-κB表達(dá)水平，從而改善肺纖維化。

中醫(yī)學(xué)上多將肺纖維化歸屬于“肺痹”和“肺痿”范疇?！胺伪浴敝∶钤缫?jiàn)于《素問(wèn)·玉機(jī)真臟論》，因情志、外感等多種因素導(dǎo)致肺腎虧虛，氣虛血瘀，臟腑經(jīng)絡(luò)痹阻不通而發(fā)病?！胺勿簟辈∶从趶堉倬暗摹督饏T要略》。有研究表明，肺纖維化以“氣虛”“血瘀”為核心病理因素，痰瘀互結(jié)、臟腑氣虛、肺絡(luò)痹阻不通為其發(fā)病關(guān)鍵，辨證分型主要分為臟腑氣虛類及氣滯血瘀類，因此補(bǔ)益肺腎、益氣活血化瘀可作為治療肺纖維化的主要方法［15-16］。銀杏葉作為治療肺虛咳喘歷史悠久的中藥，應(yīng)用于臨床歷史悠久，銀杏葉提取物目前也廣泛應(yīng)用于治療和預(yù)防呼吸系統(tǒng)疾病，且療效顯著。楊志暉等［17］在研究銀杏葉提取物對(duì)高脂血癥大鼠的影響中發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物可以通過(guò)多種途徑抑制NF-κB的表達(dá)，從而減少細(xì)胞凋亡、內(nèi)皮損傷和炎癥反應(yīng)，這一研究與本研究銀杏葉提取物抑制NF-κB的表達(dá)結(jié)果一致。

綜上所述，銀杏葉提取物可抑制肺纖維化大鼠肺組織的炎癥及纖維化程度，下調(diào)TGF-β1、MMP-9與NF-κB表達(dá)水平，從而發(fā)揮其抑制或延緩肺纖維化的作用。