南板藍(lán)根不同提取物中靛藍(lán)、靛玉紅和色胺酮含量及其抑菌活性的研究※

●孫 媛 田秀秀 丁江生

南板藍(lán)根來(lái)源于爵床科植物馬藍(lán)[Baphicacanthuscusia(Nees)Bremek.]的干燥根莖和根，味苦，性寒，具有清熱解毒、涼血消斑等功效，可用于瘟疫時(shí)毒、發(fā)熱咽痛、溫毒發(fā)斑等，已被廣泛應(yīng)用于各種制劑中?，F(xiàn)代研究證明，南板藍(lán)根含有多種化學(xué)成分，如（R,S）-告衣春、腺苷、靛藍(lán)、靛玉紅、多糖、色胺酮等；具有良好的抗病毒、抗菌、抗腫瘤、抗炎等方面的藥理活性，包括滅活甲型流感病毒，延長(zhǎng)流感病毒FM1株感染小鼠的平均存活天數(shù)，抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和皮膚真菌，治療慢性粒細(xì)胞性白血病，抑制一般癌腫細(xì)胞生長(zhǎng)和擴(kuò)散程度等。其中抗病毒、抗腫瘤等方面研究報(bào)道較多，但抗菌方面的許多作用機(jī)理仍待考察。本中心根據(jù)前期研究結(jié)果，擬將其組方開(kāi)發(fā)為治療痤瘡的外用產(chǎn)品。

然而，南板藍(lán)根作為常用中藥，雖大眾接受度高，但在不同產(chǎn)地、野生和栽培品種、不同溶劑提取物之間質(zhì)量差異明顯。同時(shí)，《中國(guó)藥典》南板藍(lán)根項(xiàng)下，未見(jiàn)對(duì)其質(zhì)量指標(biāo)成分的定量控制。為進(jìn)一步研究南板藍(lán)根成分與抑菌活性的相關(guān)性，采用高效液相色譜法，以南板藍(lán)根主要成分靛藍(lán)、靛玉紅和色胺酮為指標(biāo)，對(duì)南板藍(lán)根水、醇等不同溶劑提取物的指標(biāo)成分含量情況和對(duì)丙酸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌的體外抑菌情況進(jìn)行考察，為該藥規(guī)范質(zhì)量，優(yōu)化提取溶劑，拓寬使用范圍，開(kāi)發(fā)外用抑菌產(chǎn)品研究提供依據(jù)[1-10]。

1 材料

1.1 儀器Agilent1100 高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫）；KQ5200DE 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BSA224S-CW 電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（化學(xué)）有限公司]；JJ-2000型電子天平（江蘇常熟市雙杰測(cè)試儀器廠）；BCD-208K/A 海爾冰箱（青島海爾股份有限公司）；DZTW調(diào)溫電熱套（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；DZKW-S-6電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療）；BPZ-6210LC 型真空干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；THZ-D型臺(tái)式恒溫振蕩器（江蘇太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；Thermo Multiskan GO 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)BIO-RAD公司）；GNP-9270隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥靛藍(lán)對(duì)照品（北京世紀(jì)奧科，批號(hào)170404，編號(hào)482-89-3，HPLC≥98%）；靛玉紅對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110717-200204）；色胺酮對(duì)照品(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)M10O8L45439，編號(hào)S31557，HPLC≥98%）；南板藍(lán)根（昆明市官渡區(qū)千草源中藥材經(jīng)營(yíng)部，批號(hào)20170527）；美羅培南[佳友制藥（蘇州）有限公司，批號(hào)20161204]；乙腈（色譜純，默克股份）；水為高純水；N,N-二甲基甲酰胺、95%乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷均為分析醇；酵母提取物（Oxoid Ltd,Basingstoke,Hampshire,England，批號(hào)LP0021）；胰蛋白胨（Oxoid Ltd,Basingstoke,Hampshire,England，批號(hào)LP0042）；氯化鈉（上海試四赫維化工有限公司，批號(hào) 1306101）；MUELLER-HINTON（Oxoid Ltd,Basingstoke,Hampshire,England，批號(hào)CM0405）；沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(青島高科園海博生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品批號(hào)HB0253-7)；瓊脂粉（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)20091102）。

1.3 供試菌種丙酸桿菌Propionibacterium acnesATCC11827；金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC29213；白色念珠菌Canidia albicans ATCC10231 均購(gòu)自美國(guó)特種物品貯藏中心（ATCC），接種、傳代后于4 ℃保存。

2 方法與結(jié)果

2.1 南板藍(lán)根不同溶劑提取物的制備稱(chēng)取相同重量的南板藍(lán)根藥材，分別加入10倍量的水、甲醇、50%乙醇、80%乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮溶劑，分別加熱回流提取2次，每次2 h，過(guò)濾提取液，60 ℃真空濃縮，干燥，即得南板藍(lán)根不同溶劑提取物。密封陰涼保存，備用。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 ECOSIL 120-5-C18 色譜柱(5.0 μm，4.6×250 mm，廣州綠百草)，乙腈∶水=70∶30 為流動(dòng)相，柱溫25 ℃，流速1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)289 nm。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 分別精密稱(chēng)取靛藍(lán)、靛玉紅和色胺酮對(duì)照品2.060 mg、2.520 mg、10.112 mg，置50 mL 容量瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺溶解并定容至刻度，超聲（150 W，40 kHz）5 min，搖勻，即得。

2.2.3 樣品溶液制備 分別精密稱(chēng)取2.1項(xiàng)下的南板藍(lán)根不同溶劑提取物0.5 g，置于50 mL容量瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺40 mL，超聲20 min，放冷，N,N-二甲基甲酰胺定容至刻度，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.2.4 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 取2.2.2 項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，取N,N-二甲基甲酰胺為空白溶液，按2.2.3 項(xiàng)下的制備方法，取南板藍(lán)根80%乙醇提取物，制備樣品溶液；并分別加入靛藍(lán)、靛玉紅和色胺酮對(duì)照品，制備對(duì)照及樣品混合溶液。按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。此條件下靛藍(lán)、靛玉紅和色胺酮分離良好，無(wú)干擾。見(jiàn)圖1。

圖1 專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn)HPLC圖

2.2.5 線(xiàn)性關(guān)系考察 分別精密量取2.2.2 項(xiàng)下靛藍(lán)、靛玉紅和色胺酮混合對(duì)照品溶液1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL 置于10 mL 容量瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺定容，搖勻，分別得到靛藍(lán)濃度為：4.12，8.24，16.48，24.72，32.96，41.20 μg.mL-1；靛玉紅濃度為：5.04，10.08，20.16，30.24，40.32，50.40 μg.mL-1；色胺酮濃度為：20.22，40.45，80.90，121.34，161.79，202.24 μg.mL-1的對(duì)照品溶液，0.45 μm 濾膜過(guò)濾，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。以對(duì)照溶液濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 靛藍(lán)、靛玉紅和色胺酮線(xiàn)性關(guān)系（n=6）

2.2.6 精密度試驗(yàn) 精密量取2.2.5 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積，并計(jì)算RSD值。結(jié)果表明，靛藍(lán)、靛玉紅和色胺酮的日內(nèi)精密度RSD 值分別為1.41%（n=6）、0.77%（n=6）、1.62%（n=6），表明日內(nèi)精密度良好。連續(xù)進(jìn)樣3天，記錄峰面積，并計(jì)算RSD 值。結(jié)果表明，靛藍(lán)、靛玉紅和色胺酮的日間精密度RSD值分別為1.46%（n=6）、0.81%（n=6）、0.71%（n=6），表明日間精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份樣品溶液，分別于0，2，4，6，10，12 h按上述色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算RSD 值。結(jié)果表明，靛藍(lán)、靛玉紅和色胺酮的穩(wěn)定性RSD 值分別為2.90%（n=6）、2.24%（n=6）、1.39%（n=6），表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取0.5 g 南板藍(lán)根80%乙醇提取物6份，按2.2.3項(xiàng)下要求，配制樣品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算RSD 值。結(jié)果表明，靛藍(lán)、靛玉紅和色胺酮的重復(fù)性RSD 值分別為2.36%（n=6）、1.29%（n=6）、1.39%（n=6），表明重復(fù)性良好。

2.2.9 回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知含量的南板藍(lán)根提取物，分別按含量的50%，100%，150%精密加入靛藍(lán)、靛玉紅和色胺酮對(duì)照品，按2.2.3 項(xiàng)制備樣品溶液，每個(gè)濃度平行制備3份，按上述色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.2.10 得率測(cè)定 分別精密稱(chēng)取0.5g 南板藍(lán)根不同溶劑提取物，按2.2.3項(xiàng)制備樣品溶液，并根據(jù)線(xiàn)性范圍適當(dāng)稀釋?zhuān)總€(gè)樣品平行制備2 份，按上述色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算含量，并結(jié)合提取率，計(jì)算各提取物在生藥材中對(duì)應(yīng)靛藍(lán)、靛玉紅和色胺酮的得率。結(jié)果提示，南板藍(lán)根乙酸乙酯提取物中靛藍(lán)和靛玉紅對(duì)應(yīng)的生藥材得率最高，分別為0.6702 mg/g和0.2353 mg/g；80%乙醇提取物中色胺酮對(duì)應(yīng)的生藥材得率最高，為0.1017 mg/g。見(jiàn)表3。

表3 南板藍(lán)根不同溶劑提取物得率測(cè)定結(jié)果

2.3 體外抑菌活性測(cè)定

2.3.1 菌種培養(yǎng) 從菌落平板上挑選丙酸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌分別接種于已滅菌的MH、LB、沙氏液體培養(yǎng)基中，37 ℃，100 rpm/min振蕩培養(yǎng)24 h?；罨?，按1∶100 接種，以37 ℃、200 rpm/min振蕩培養(yǎng)12 h。其中丙酸桿菌、白色念珠菌全程厭氧。

2.3.2 最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板經(jīng)紫外線(xiàn)照射30 min后，采用連續(xù)二倍微孔稀釋法，以美羅培羅為陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)設(shè)立受試樣品（其中極性偏大的提取物，如水、甲醇、50%乙醇、80%乙醇提取物樣品濃度為15.00 mg/mL；極性偏小的提取物，如乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮提取物樣品濃度為6.20 mg/mL）、菌液對(duì)照、培養(yǎng)基對(duì)照和溶媒對(duì)照。調(diào)整菌濃度至含1×106CFU/mL 活菌，每排第一孔內(nèi)加入190 μL 菌液，第二至第十二孔內(nèi)均加入100 μL 菌液。分別將受試樣品10 μL加入第一孔中，混勻后吸取100 μL 菌液加入第二孔中，繼續(xù)混勻后再吸取100 μL菌液加入第三孔。依次操作，最后，第十二孔內(nèi)溶液混勻后吸取100 μL 棄去。37 ℃，培養(yǎng)24 h，其中丙酸桿菌、白色念珠菌全程厭氧培養(yǎng)。未見(jiàn)混濁的最低樣品濃度即為最小抑菌濃度。結(jié)果表明，南板藍(lán)根乙酸乙酯提取物對(duì)丙酸桿菌和金黃色葡萄球菌有明顯抑制作用，MIC分別為0.155 mg/mL和0.310 mg/mL；80%乙醇提取物對(duì)白色念珠菌有抑制作用，MIC為0.750 mg/mL。見(jiàn)表4。

表4 南板藍(lán)根不同溶劑提取物抑菌作用結(jié)果

3 討論

南板藍(lán)根作為歷史悠久的中藥，分布及使用范圍廣，化學(xué)成分復(fù)雜。我中心擬將南板藍(lán)根與重樓等不同抑菌機(jī)理的中藥組合，開(kāi)發(fā)用于痤瘡治療的外用制劑。因此，本研究選用丙酸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌為菌種進(jìn)行評(píng)價(jià)，并優(yōu)先探索南板藍(lán)根成分報(bào)道較集中的靛藍(lán)、靛玉紅和色胺酮在不同溶劑提取物中的生藥材得率及活性情況。本研究結(jié)果表明，南板藍(lán)根以乙酸乙酯為提取溶劑效果更佳。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，南板藍(lán)根乙酸乙酯提取物對(duì)丙酸桿菌、金黃色葡萄球菌均有明顯抑制作用，其中對(duì)丙酸桿菌作用略強(qiáng)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，南板藍(lán)根乙酸乙酯提取物中靛藍(lán)、靛玉紅對(duì)應(yīng)的生藥材得率也高于其它提取物，分別為0.6702 mg/g 和0.2353 mg/g。此外，南板藍(lán)根80%乙醇提取物對(duì)白色念珠菌有抑制作用，其余提取物均未出現(xiàn)，對(duì)比得率，發(fā)現(xiàn)其色胺酮對(duì)應(yīng)的生藥材得率最高，為0.1017 mg/g。因此，推測(cè)南板藍(lán)根的抑菌活性與靛藍(lán)、靛玉紅和色胺酮有一定相關(guān)性。

研究發(fā)現(xiàn)，不同來(lái)源的南板藍(lán)根采用同一溶劑提取，提取率和指標(biāo)成分含量差異明顯。因此，評(píng)價(jià)南板藍(lán)根不同溶劑提取物中靛藍(lán)、靛玉紅和色胺酮的含量，以最終可從生藥材中獲得的得率為指標(biāo)，更具實(shí)用和指導(dǎo)意義。