●陳朝陽 冉俊寧 文啟友 姚 婷 楊佳麗 鄧奕輝
糖尿?。╠iabetes mellitus,DM)是一組以血糖增高伴脂肪、蛋白質代謝紊亂的慢性內分泌代謝性病群,可導致多器官系統(tǒng)受累并伴有大、小血管及非血管的并發(fā)癥[1]。糖尿病及其并發(fā)癥(如糖尿病心血管病變、視網(wǎng)膜病變、腎病等)的存在導致患者生活質量下降,全球死亡率增加,已成為全球最大的公共衛(wèi)生問題、十大死亡原因之一[2-6]。據(jù)國際糖尿病聯(lián)合會(IDF)評估,若不采取有效的控制方法,至2045年受害患者將增加到6.93億成年人[7]。
脫發(fā)不僅影響美觀更損害心理健康,研究發(fā)現(xiàn)脫發(fā)增加了患者焦慮和抑郁的概率[8]。因此,糖尿病合并脫發(fā)嚴重危害患者身體、心理健康,必須引起重視。關于糖尿病脫發(fā)的病因,相關研究認為:(1)血糖、血脂、血壓升高是導致脫發(fā)的危險因素,同時亦可促進胰島素抵抗(IR),而IR 是造成上述因素的基本環(huán)節(jié)和病理基礎,有研究表明IR 與女性早發(fā)型脫發(fā)存在明顯相關性,而血糖升高在男性脫發(fā)中尤為突出[9];(2)DM 人群毛發(fā)的生長速度較正常人減慢[10];(3)部分降糖藥如利拉魯肽等可通過減少食欲、降低營養(yǎng)吸收或免疫相關反應等直接或間接性導致脫發(fā)[11]。
對于脫發(fā)的中醫(yī)病因病機,趙暉[12]認為可從虛實兩方面探討,其一為虛,“發(fā)為血之余”,腎藏精,肝藏血,肝腎同源,精血互生,肝腎虧虛則發(fā)失所養(yǎng);其二為實,嗜食肥甘厚味使脾失運化,水液運行受阻而停滯,郁而化熱,濕熱上蒸毛發(fā)使毛孔油膩堵塞可致脫發(fā),氣行則血行,氣滯則血停,平素情志抑郁,氣血運行受阻,氣滯血瘀使血無法濡養(yǎng)發(fā)根,或血熱之人外感風熱,耗傷陰血則發(fā)根失去濡養(yǎng)。徐燦坤[13]也發(fā)現(xiàn)程益春教授多將脫發(fā)歸因于血虛和濕熱,治應活血涼血養(yǎng)血及祛濕除熱和疏散風邪為主。而崔偉霞[14]亦發(fā)現(xiàn)大多數(shù)學者認為脫發(fā)的病因病機主要有以下3個方面:濕熱、血虛風燥及肝腎虧虛。
二至丸由滋補肝腎的女貞子、墨旱蓮組成,后者兼涼血止血之功,二者性平和、偏寒,等量(1∶1)配伍,既滋陰補血,又不滋膩礙脾、阻滯氣機,具有補腎養(yǎng)肝、烏須發(fā)之功,為經(jīng)典的平補肝腎之方[15-17]。近幾年研究結果發(fā)現(xiàn),二至丸除具有降糖活性外,還具備改善血液流變性、調節(jié)免疫機能等功效,在治療糖尿病及其并發(fā)癥和相關代謝綜合征方面具有良好的療效[18-22]。本研究通過網(wǎng)絡藥理學多靶點、多通路的研究,進一步探討二至丸治療糖尿病脫發(fā)的作用機制,為臨床治療糖尿病脫發(fā)提供用藥依據(jù)。
1.1 材料TCMSP中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(https://tcmspw.com/tcmsp.php),Pubchem分子庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/),Chemspider 化學結構與文獻數(shù)據(jù)庫(http://www.chemspider.com/),Swiss TargetPrediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/),Genecards、TTD、OMIM 數(shù)據(jù)庫,Draw Venn Diagram 數(shù)據(jù)庫(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/),String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/),DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/),imageGP (http://www.Ehbio.com),Cytoscape3.7.1軟件,Uniprot數(shù)據(jù)庫[23-25]。
1.2 方法
1.2.1 二至丸活性成分篩選及相關靶點預測 將二至丸的墨旱蓮、女貞子兩味藥物在TCMSP 平臺上分別檢索并收集活性成分,篩選條件為:口服生物利用度(OB)≥30%,類藥性(DL)≥0.18[26]。將篩選后的具有較高活性的藥物輸入PubChem 及ChemSpider 數(shù)據(jù)庫進行檢索、獲取相應的化學結構式,不能獲取相應化學結構式的藥物予以剔除。將篩選后的化合物在Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫進行靶點預測,物種設置為“Homo sapiens”,剔除無靶點者,并通過Uniprot數(shù)據(jù)庫使靶點名稱規(guī)范化。
1.2.2 糖尿病脫發(fā)靶點預測 采用Genecards、TTD、OMIM數(shù)據(jù)庫,以“Diabetic hair loss”為檢索詞,收集并篩選糖尿病脫發(fā)的作用靶點,Genecards 數(shù)據(jù)庫篩選條件為:Score>30[25]。
1.2.3 疾病與二至丸共同靶點的收集 通過Draw Venn Diagram 平臺,將墨旱蓮、女貞子與糖尿病脫發(fā)的靶點輸入,分別以MHL、NZZ、Diabetic hair loss 代表,構建韋恩圖,得到疾病與二至丸共同靶點。
1.2.4 構建共同靶點蛋白互作網(wǎng)絡 將共同靶點導入String數(shù)據(jù)庫,選定Multiple protein,物種選擇Homo sapiens,最低互動分數(shù)為默認值(0.400),得到蛋白互作網(wǎng)絡PPI 信息,將從PPI 獲得的信息node1、node2、combined-score值導出至Excel2016,通過Cyto?scape3.7.1進行可視化,利用Network analyzer 進行PPI的拓撲分析,得到Degree值[23]。
1.2.5 共同靶點GO 生物注釋和KEGG 通路富集分析 利用DAVID 數(shù)據(jù)庫將共同靶點進行GO 生物注釋和KEGG 通路富集分析。設定靶點為“OFFICIALGENE-SYMBOL”格式,Background 選擇“Homo sapi?ens”,篩選標準為:P<0.05,Count=2[23]。分別導出基因功能的三個部分細胞組分CC、分子功能MF、生物過程BP,進行GO 分析。取P值的負對數(shù),-lgP越大,說明富集程度越高,根據(jù)-lgP值取CC、MF、BP前10位的相關信息在imageGP 平臺構建氣泡圖[23]。同時,將排名前20通路的Term、Genes、-lgP值導入至Cyto?scape3.7.1進行可視化,構建靶點-通路網(wǎng)絡圖。
2.1 二至丸活性成分信息及藥物相關靶點匯總利用TCMSP共收集到二至丸的活性成分167個,其中墨旱蓮48 個,女貞子119 個,篩選后的候選化合物有23個,其中墨旱蓮10個,女貞子13個,其中墨旱蓮、女貞子共同活性成分2 個(luteolin/木犀草素、quercetin/槲皮素),見表1。剔除無化學結構、靶點的化合物:墨旱蓮(MOL003378),女貞子(MOL005169、MOL005195、MOL005212、MOL005147、MOL004576)。得到二至丸相關靶點764個,其中墨旱蓮326個,女貞子438個。
表1 二至丸候選化合物基本信息
2.2 疾病相關靶點信息利用Genecards、TTD、OMIM 數(shù)據(jù)庫收集并篩選得到糖尿病脫發(fā)相關靶點291個。
2.3 共同靶點信息將糖尿病脫發(fā)相關靶點291 個與二至丸相關靶點764 個通過Draw Venn Diagram 平臺取交集并繪制韋恩圖,得到共同靶點48個,韋恩圖見圖1,具體共同靶點見表2。
表2 二至丸活性成分化合物與糖尿病脫發(fā)共同靶點
圖1 二至丸活性成分化合物與糖尿病脫發(fā)靶點韋恩圖
2.4 共同靶點PPI分析及核心靶點篩選共同靶點的Degree值見表3,其中根據(jù)Degree值設定節(jié)點大小,Degree 值越大,節(jié)點越大;根據(jù)Combine score 值設定邊線粗細,值越大,邊線越粗;設定1≤Degree≤10 為綠色,10<Degree≤20 為藍色,20<Degree≤30 為紫色,30<Degree≤40為紅色。利用Cytoscape3.7.1構建共同靶點蛋白PPI網(wǎng)絡圖,該圖共有48個靶點,包含48個節(jié)點,394條邊,見圖2。由圖及表可知,二至丸治療糖尿病脫發(fā)的重要靶標分別為:AKT 絲氨酸/蘇氨酸激酶1(AKT1)、非受體酪氨酸激酶C(SRC)、V-Ha-Ras 肉瘤病毒癌基因同源物(HRAS)、表皮生長因子受體(EGFR)、信號轉導和轉錄激活因子3(STAT3)、腫瘤壞死因子(TNF)、磷脂酰肌醇3 激酶(PIK3CA)、纖連蛋白1(FN1)等。
圖2 二至丸候選化合物與糖尿病脫發(fā)共同靶點PPI網(wǎng)絡圖
表3 二至丸候選化合物與糖尿病脫發(fā)共同靶點蛋白Degree值
2.5 共同靶點GO、KEGG 注釋信息及富集通路結果48 個共同靶點GO 富集分析得到CC14 個、BP59個、MF13 個,取PValue 值的負對數(shù)(-lgP),-lgP值越大表示富集程度越高,依據(jù)-lgP值對CC、BP、MF分別取前10 位構建氣泡圖,其中氣泡的大小取決于Count值,X軸為關聯(lián)基因數(shù)與GO富集分析上總基因數(shù)的比值(Gene Ratio),Y軸為CC、BP、MF的-lgP前10的靶點名稱,見圖3。結果發(fā)現(xiàn):共同靶點主要分布于質膜、細胞外基質、細胞質核周區(qū)域等細胞成分中,通過類固醇結合、配體激活的序列特異性DNA結合、ATP結合、雌激素激活的序列特異性DNA 結合、去甲腎上腺素結合、腎上腺素結合等方式,參與蛋白質磷酸化、RNA聚合酶II啟動子調控、絲氨酸磷酸化、DNA復制、MAP激酶反饋機制調控、神經(jīng)元的凋亡過程、基因表達調控等生物進程,從而發(fā)揮治療糖尿病脫發(fā)的作用。
圖3 二至丸候選化合物與糖尿病脫發(fā)共同靶點GO富集分析
48 個共同靶點KEGG 富集分析得到80 個信號通路,根據(jù)-lgP值取富集程度前20 的信號通路[25],見表4。同時將富集程度排名前20 位的通路相關信息導入Cytoscape3.7.1 構建共同靶點-通路網(wǎng)絡圖,其中紅色菱形代表信號通路、綠色長方形代表共同靶點,見圖4。結果發(fā)現(xiàn):共同靶點參與的通路以癌癥途徑(包括蛋白聚糖、碳代謝)、催乳素信號通路、HIF-1 信號通路、Rap1信號通路、Ras信號通路、PI3K-Akt信號通路等為主。由此表明,二至丸主要通過以上通路發(fā)揮治療糖尿病脫發(fā)的作用。
圖4 二至丸候選化合物與糖尿病脫發(fā)共同靶點-通路網(wǎng)絡圖
表4 二至丸候選化合物與糖尿病脫發(fā)共同靶點KEGG通路富集分析結果
二至丸具有滋腎養(yǎng)肝、烏須發(fā)的功效,是傳統(tǒng)的平補肝腎之良方。本研究通過對二至丸中墨旱蓮、女貞子的活性成分的收集和篩選,得到具有較高活性的候選化合物23 個,部分活性成分已被證實具有調節(jié)糖類和脂肪代謝等功能,如亞麻酸(Linarin)可降低血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉移酶(AST),減輕肝損傷,從而降低血脂,韋地內酯(wede?lolactone)亦通過ERK(細胞外調節(jié)蛋白激酶)途徑抑制人脂肪組織來源的間充質干細胞(hAMSCs)的脂肪形成分化,有利于血液的流通,促進血液循環(huán),利于頭部供血提供營養(yǎng)[27-28],槲皮素(quercetin)可減少脂質過氧化,抗血小板聚集和提高毛細血管通透性,滑石粉(Taxifolin)通過體外抑制Aβ纖絲的形成,改善腦血流量,同時具有抗氧化和抗糖化活性的功能[2,29-31]。
通過Degree 值預測出二至丸改善糖尿病脫發(fā)作用的前10 位的重要靶點分別為:AKT1、SRC、HRAS、EGFR、STAT3、TNF、PIK3CA、FN1、MTOR、ESR1,PPI網(wǎng)絡圖顯示二至丸靶標與糖尿病脫發(fā)靶標之間存在著復雜網(wǎng)絡關系。AKT1 參與胰島素信號傳導,內皮功能和代謝調節(jié),通過調控細胞增殖和生長,參與葡萄糖代謝的細胞過程,保護內皮細胞和預防異常的血管通透性[32];SRC 通過調節(jié)RAS/ERK 途徑的活性[33],HRAS 通過調控RAS/MAPK 信號通路途徑[34],EGFR激活導致受體酪氨酸激酶的自磷酸化啟動下游信號通路[35],影響細胞的增殖從而在糖尿病脫發(fā)的病理過程中發(fā)揮作用;PIK3CA 的突變可提高PI3Ks 活性,從而使細胞內含有PH 結構域的信號蛋白AKT 和PDK1(phosphoinositide dependent kinase-1)結合,促使PDK1磷酸化AKT 蛋白的Ser308 導致AKT 活化,調節(jié)細胞的功能,減少細胞凋亡[36]。此外,二至丸還可以通過STAT3、TNF發(fā)揮抗炎作用保護血管的通透性,維持血液循環(huán)的暢通,炎癥是使血管粥樣硬化的重要驅動力,STAT3通過促進白細胞介素-6(IL-6)分泌[37],TNF促進T細胞的活化和增殖[38],調節(jié)免疫應答,發(fā)揮抗炎的作用。因此,二至丸可通過調節(jié)上述靶蛋白發(fā)揮調節(jié)胰島素代謝、抗炎、調節(jié)細胞增殖,保護血管通透性等作用防治糖尿病脫發(fā)。
GO 富集分析表明,二至丸防治糖尿病脫發(fā)的靶點存在于多種細胞成分,通過多種方式參與蛋白質磷酸化、DNA復制、基因表達調控等生物過程,從而調節(jié)體內代謝[39],調節(jié)細胞生長、分化、凋亡,通過改善內分泌代謝紊亂、血液循環(huán)等在防治糖尿病脫發(fā)的過程中發(fā)揮重要作用。
KEGG 富集通路分析顯示,共同靶點可通過催乳素信號通路、HIF-1 信號通路、Rap1 信號通路、Ras 信號通路等方式改善糖尿病脫發(fā)。已有研究發(fā)現(xiàn):催乳素(PRL)作為激素和細胞因子在垂體、免疫系統(tǒng)等組織合成,其信號通路通過跨膜催乳素受體(PRL-R)發(fā)生,參與體內代謝,影響繁殖、控制營養(yǎng)細胞的動態(tài)平衡、調節(jié)免疫系統(tǒng)[40-42];HIF-1可參與體內糖代謝和影響血管生成的蛋白(如血管內皮生長因子和促紅細胞生成素)的表達[43];血小板是發(fā)揮止血功效的重要成分,RAP1是影響血小板粘附的關鍵,能通過感應細胞質的微小鈣濃度變化,發(fā)揮調節(jié)血小板的粘附性的作用,從而保持血管的通透性,調節(jié)血液循環(huán)[44];RAS 通過參與控制細胞的過程,影響細胞的增殖、遷移[45],從而發(fā)揮改善糖尿病脫發(fā)的作用。李春夢[46]等網(wǎng)絡藥理學研究還發(fā)現(xiàn)二至丸可通過調節(jié)Regulation of ac?tin cytoskeleton、Insulin signaling pathway 等信號通路,影響細胞遷移、改善胰島素抵抗而發(fā)揮治療糖尿病腎病的作用,與本研究預測靶點契合。
網(wǎng)絡藥理學的多靶點、多通路的藥物分子設計模式,其整體性、系統(tǒng)性的特點與中醫(yī)藥提倡的整體觀、辨證論治原則相統(tǒng)一。本研究通過網(wǎng)絡藥理學方法得到了二至丸改善糖尿病脫發(fā)的作用靶點及其通路,初步揭示了二至丸治療糖尿病脫發(fā)的作用機制,為臨床及相關實驗研究提供了依據(jù)。