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    沙苑子苷A對(duì)L02細(xì)胞脂肪變性模型的降脂作用和機(jī)制探討

    2021-07-18 04:19:24孟靚魏益謙高晶李麗邵紫萱孟智睿高學(xué)敏王景霞
    環(huán)球中醫(yī)藥 2021年7期
    關(guān)鍵詞:沙苑子批號(hào)脂肪酸

    孟靚 魏益謙 高晶 李麗 邵紫萱 孟智睿 高學(xué)敏 王景霞

    由于遺傳因素、飲食習(xí)慣、生活方式和年齡、絕經(jīng)、疾病及藥物等原因引起的血清膽固醇或甘油三酯的水平過(guò)高或高密度脂蛋白水平過(guò)低,稱為血脂代謝異常[1]。脂質(zhì)代謝異常與許多疾病都密切相關(guān),如動(dòng)脈粥樣硬化[2]、肥胖癥[3]、胰島素抵抗[4]、高脂血癥[5]、脂肪肝[6]等,因此對(duì)血脂代謝異常的防治有著極為重要的意義。沙苑子(SemenAstragaliComplanati)為豆科植物扁莖黃芪(AstragaluscomplanatusR.Br.)的干燥成熟種子,是中醫(yī)傳統(tǒng)補(bǔ)陽(yáng)藥,功能補(bǔ)腎助陽(yáng)、滋補(bǔ)腎精[7]。藥理研究顯示[8-10],沙苑子的總黃酮有明顯的調(diào)脂作用,能夠降低血清甘油三酯(triglyceride,TG)、膽固醇(cholesterol,TC)水平,沙苑子苷A是含量較高的黃酮類成分之一[11],本實(shí)驗(yàn)選擇沙苑子苷A為研究對(duì)象,采用游離脂肪酸(free fatty acid,F(xiàn)FA)誘導(dǎo)的肝脂肪變L02細(xì)胞模型,觀察沙苑子苷A對(duì)肝脂質(zhì)異常的調(diào)節(jié)作用,并針對(duì)TG的合成途徑深入探討沙苑子苷A的降脂機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

    正常人肝細(xì)胞株L02,購(gòu)于武漢普諾賽生命科技有限公司。

    1.2 藥物與試劑

    沙苑子苷A(美國(guó)Apexbio公司,批號(hào):A8425),高糖DMEM培養(yǎng)基(hyclone,批號(hào):sh30284.01)、胰蛋白酶-EDTA消化液(批號(hào):T4299)、青鏈霉素(批號(hào):V900929),牛血清白蛋白(批號(hào):V900933)、棕櫚酸鈉(Sodium Palmitate,PA,批號(hào):P9575)、油酸鈉(Sodium Oleate,OA,批號(hào):07501)、二甲基亞礬(Dimethyl sulfoxide,DMSO,批號(hào):C6295)、蛋白裂解液(RIPA,批號(hào):r0278)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,胎牛血清(美國(guó)Gibco公司,批號(hào):10099-141)、CCK8試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所,批號(hào):CK04),油紅O細(xì)胞染色試劑(北京索萊寶生物公司,批號(hào):g1262),BCA法蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒(凱基生物公司,批號(hào):KGP902),TG試劑盒(批號(hào):A110-1-1)、TC試劑盒(批號(hào):A111-1-1)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(glutamic pyruvic transaminase,ALT)試劑盒(批號(hào):C00902-1)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Glutamic oxaloacetic transaminase,AST)試劑盒(批號(hào):C010-2-1)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)試劑盒(批號(hào):A020-2-2)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)試劑盒(批號(hào):A003-1-2)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)試劑盒(批號(hào):A001-3-2)均來(lái)源于南京建成生物工程研究所;實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè)主要實(shí)驗(yàn)材料:引物(北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成),Trizol(美國(guó)Invitrogen公司,批號(hào):15596018),RNase Inhibitor(批號(hào):eo0382),RNase-free H2O(批號(hào):en0521)均購(gòu)自美國(guó)Fermentas(MBI)公司,轉(zhuǎn)錄酶、qPCR Mix(APEXBIO,批號(hào):k1070-5000),固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(sterol regulatory element-binding protein 1C,SREBP-1c)抗體(批號(hào):ab133125)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,F(xiàn)AS)抗體(批號(hào):EPR5700)、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator activated receptor α,PPARα)抗體(批號(hào):epr18516)、肉毒堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶1A(carnitine palmitoyl transferase 1A,CPT-1A)抗體(批號(hào):ab189182)、抗兔IgG HRP辣根過(guò)氧化物酶(批號(hào):ab6721)均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

    1.3 主要儀器與設(shè)備

    超凈工作臺(tái)(青島海爾股份有限公司),二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司),高速低溫離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司),倒置顯微鏡(德國(guó)Leica),全自動(dòng)生化分析儀(Rayto),酶標(biāo)儀(Thermo),7500時(shí)實(shí)定量PCR儀(美國(guó)BIO-RAD公司),電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-Rad) ,凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó) UVP)。

    1.4 脂肪變肝細(xì)胞模型的建立

    1.4.1 CCK8檢測(cè)確定FFA濃度范圍 將L02細(xì)胞鋪于96孔板中進(jìn)行培養(yǎng),待貼壁后,分別加入不同濃度的FFA(OA∶PA為2∶1),誘導(dǎo)24小時(shí),用CCK8試劑盒測(cè)定細(xì)胞增殖情況,測(cè)出OD值,篩選出FFA濃度范圍。

    1.4.2 油紅O染色的細(xì)胞形態(tài)觀察 油紅O染色可以對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)的脂滴進(jìn)行定性觀察,以0.8×105/mL的密度鋪于6孔板中,每孔2 mL,24小時(shí)貼壁后加入不同劑量的FFA(OA∶PA為2∶1)作用于L02細(xì)胞,培養(yǎng)24小時(shí)后,進(jìn)行染色處理,PBS漂洗2~3遍,4%多聚甲醛固定,光鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴的數(shù)量和大小。

    1.4.3 細(xì)胞內(nèi)TG的檢測(cè) 將L02細(xì)胞以1×105/mL種植于24孔板,每孔1 mL,分為對(duì)照組和模型組,每組3孔。待細(xì)胞貼壁后,加入不同濃度的FFA(OA∶PA為2∶1)干預(yù),培養(yǎng)24小時(shí)后,檢測(cè)TG含量。

    1.5 沙苑子苷A對(duì)L02 細(xì)胞活力的影響

    稱取沙苑子苷 A 溶于 DMSO 中,獲得沙苑子苷 A 儲(chǔ)備液。分裝后放置于-20℃冰箱保存。臨用前用完全培養(yǎng)基稀釋,得到沙苑子苷 A 溶液。經(jīng)過(guò)直徑為 0.22 μm 的一次性針頭濾器,至容積為 15 mL 的經(jīng)過(guò)滅菌處理的離心管中。沙苑子苷 A 溶液終濃度為 1×10-6mM,1×10-5mM,1×10-4mM,1×10-3mM,1×10-2mM,1×10-1mM,1 mM。沙苑子苷 A 溶液中 DMSO 終濃度小于等于0.1%(V/V)。加入貼壁生長(zhǎng)的 L02 細(xì)胞中,每個(gè)濃度設(shè)置 3 個(gè)重復(fù)孔。孵育 24 小時(shí),隨后每孔加入 10μL 的 CCK8 試劑,避光室溫反應(yīng) 30 分鐘。使用酶標(biāo)儀 520 nm 波長(zhǎng)檢測(cè)其 OD 值,計(jì)算細(xì)胞活力百分率。

    1.6 分組與給藥

    用完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清的高糖DMEM)傳代培養(yǎng)正常人肝細(xì)胞株L02,待細(xì)胞呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)是即開始實(shí)驗(yàn)。以0.5×105/mL的密度鋪板種植,將體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞分為對(duì)照組(Control)、模型組(Model)、沙苑子低、中、高劑量組(S-Low 25 μM、S-Middle 50 μM、S-High 100 μM)。對(duì)照組:加入完全培養(yǎng)基;模型組:待細(xì)胞貼壁后,加入1 mM FFA(1.4.1中確定的造模濃度)孵育24 小時(shí);沙苑子低、中、高劑量組:細(xì)胞貼壁后,沙苑子低、中、高劑量先預(yù)處理24小時(shí),再加入1 mM FFA干預(yù)24小時(shí)。然后測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

    1.7 指標(biāo)檢測(cè)

    1.7.1 L02細(xì)胞TG、TC、ALT、AST、LDH、MDA含量,SOD活性水平的測(cè)定 收集各組細(xì)胞,PBS沖洗并1000 r/min離心2~3遍,酶標(biāo)儀測(cè)出相應(yīng)OD值,同時(shí)用BCA蛋白濃度試劑盒檢測(cè)蛋白含量。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書,應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。

    1.7.2 L02細(xì)胞炎性因子IL-6、TNF-α的測(cè)定 收集各組細(xì)胞,ELISA法檢測(cè)白細(xì)胞介素-6(interleukin 6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的含量。

    1.7.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)SREBP-1c、FAS、PPARα、CTP-1A mRNA表達(dá) 提取各組細(xì)胞總RNA,根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書操作。用生物分光光度計(jì)測(cè)定 RNA濃度和純度。取 2 μg RNA 樣本,用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA,并以此為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄和 PCR反應(yīng)條件按照試劑盒說(shuō)明書設(shè)置。PCR進(jìn)行35~40個(gè)循環(huán):預(yù)變性 95℃,2分鐘;變性95 ℃,30秒;58 ℃退火,30秒 ;72 ℃延伸30秒。以β-actin 為內(nèi)參,所得 CT 值按照2-△△CT的方法進(jìn)行均一化處理后再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。引物序列見表1。

    表1 引物序列

    1.7.4 蛋白免疫印跡法檢測(cè)SREBP-1c、FAS、PPARα、CTP-1A蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞,RIPA裂解液裂解細(xì)胞,5000 rpm 離心去除沉淀,BCA 法測(cè)定蛋白含量,總蛋白50 μg上樣,經(jīng)10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,電轉(zhuǎn)移至 NC膜上,用含5%脫脂奶粉的TBST封閉后加入1∶1000稀釋的相應(yīng)的一抗,4℃搖床孵育過(guò)夜,TBST洗3次,加入1∶2000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗,室溫孵育1小時(shí),TBST洗3次后,用Western blot熒光檢測(cè)試劑盒顯影、定影。結(jié)果用圖象分析儀分析。

    1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    2 結(jié)果

    2.1 L02細(xì)胞脂肪變模型的建立

    2.1.1 CCK8法檢測(cè)不同濃度FFA對(duì)L02細(xì)胞活性的影響 分別將0.25 mM、0.5 mM、0.75 mM、1 mM、1.5 mM不同濃度FFA干預(yù)L02細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后觀察細(xì)胞存活狀況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,F(xiàn)FA濃度在1 mM以下時(shí),細(xì)胞死亡漂浮較少。CCK8結(jié)果顯示,當(dāng)FFA濃度超過(guò)1mM是吸光度顯著降低,細(xì)胞增殖影響較大(見表2)。

    表2 CCK8檢測(cè)不同濃度的FFA對(duì)L02細(xì)胞活性的影響

    2.1.2 油紅O染色觀察不同濃度FFA對(duì)L02細(xì)胞內(nèi)脂滴形成的影響 光鏡下觀察可見,對(duì)照組細(xì)胞邊緣完整,胞漿豐富,細(xì)胞內(nèi)未見紅色脂滴,實(shí)驗(yàn)組隨著游離脂肪酸造模濃度的增加,細(xì)胞內(nèi)脂滴呈遞增趨勢(shì),當(dāng)FFA濃度大于1mM時(shí),細(xì)胞數(shù)量明顯減少(見圖1)。

    注:A:對(duì)照組;B:0.25 mM劑量組;C:0.50 mM劑量組;D:0.75 mM劑量組;E:1.00 mM劑量組;F:1.5 mM劑量組圖1 油紅O染色法觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴(油紅O染色,×200)

    2.1.3 不同濃度FFA對(duì)L02細(xì)胞TG含量的影響 當(dāng)FFA作用濃度為1 mM時(shí),細(xì)胞活性及增殖不受大的影響,且在該作用濃度時(shí),細(xì)胞內(nèi)脂滴形成最多、甘油三酯含量最高。而當(dāng)FFA作用濃度高于1 mM時(shí),細(xì)胞的活性與增殖均受到很大影響,且細(xì)胞內(nèi)脂滴與脂質(zhì)含量減少較多,因此,選擇1 mM作為FFA誘導(dǎo)造模的最佳濃度(見表3)。

    表3 不同濃度的FFA對(duì)L02甘油三酯水平的影響

    以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,當(dāng)FFA作用濃度為1 mM時(shí),細(xì)胞活性及增殖不受大的影響,且在該作用濃度時(shí),細(xì)胞內(nèi)脂滴形成最多、甘油三酯含量最高。而當(dāng)FFA作用濃度高于1 mM時(shí),細(xì)胞的活性與增殖均受到很大影響,且細(xì)胞內(nèi)脂滴與脂質(zhì)含量減少較多,因此,選擇1 mM FFA誘導(dǎo)24小時(shí)造模成功。

    2.2 沙苑子苷A對(duì)正常L02細(xì)胞活性的影響

    CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示,當(dāng)沙苑子苷 A 濃度很小時(shí),低濃度的沙苑子苷 A 對(duì) L02 細(xì)胞有增強(qiáng)活性的作用,隨著沙苑子苷 A 濃度的升高,細(xì)胞活力逐漸與空白對(duì)照組相近(見表4)。

    表4 CCK8檢測(cè)不同濃度沙苑子苷A對(duì)L02細(xì)胞活性的影響

    2.3 沙苑子苷A對(duì)脂肪變L02細(xì)胞TG、TC、ALT、AST、LDH的影響

    與空白對(duì)照組比較,模型組L02細(xì)胞TG、TC、ALT、AST、LDH含量均明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,沙苑子低、中、高劑量組L02細(xì)胞TG、ALT、AST、LDH含量均顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),沙苑子苷A中、高劑量組L02細(xì)胞TC含量均顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表5)。

    表5 沙苑子苷A對(duì)L02細(xì)胞內(nèi)TG、TC、ALT、AST、LDH含量的影響

    2.4 沙苑子苷A對(duì)脂肪變L02細(xì)胞MDA、SOD、IL-6、TNF-α水平的影響

    與空白對(duì)照組比較,模型組L02細(xì)胞MDA、IL-6、TNF-α含量明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,沙苑子苷A中、高劑量組L02細(xì)胞MDA含量均顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),沙苑子苷A低、中、高劑量組L02細(xì)胞IL-6、TNF-α含量均顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與空白對(duì)照組比較,模型組L02細(xì)胞SOD活力水平明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);沙苑子低、中、高劑量組L02細(xì)胞SOD活力水平均顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表6)。

    表6 沙苑子苷A對(duì)L02細(xì)胞內(nèi)MDA、SOD、IL-6、TNF-α含量的影響

    2.5 沙苑子苷A對(duì)脂肪變L02細(xì)胞SPEBP-1c、FAS、PPARα、CPT-1A mRNA表達(dá)水平的影響

    與對(duì)照組比較,模型組L02細(xì)胞SPEBP-1c、FAS mRNA的表達(dá)均明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),PPARα mRNA的表達(dá)有升高趨勢(shì),但是無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,CTP-1A mRNA的表達(dá)顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,沙苑子苷A低、中、高劑量L02細(xì)胞FAS、SPEBP-1c mRNA的表達(dá)均顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),沙苑子中、高劑量組L02細(xì)胞PPARα、CPT-1A mRNA的表達(dá)顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表7)。

    表7 沙苑子苷A對(duì)L02細(xì)胞SPEBP-1c、FAS、PPARα、CTP-1α mRNA的影響

    2.6 沙苑子苷A對(duì)脂肪變L02細(xì)胞SREBP-1c、FAS、PPARα、CPT-1A蛋白表達(dá)水平的影響

    與對(duì)照組比較,模型組L02細(xì)胞SREBP-1c、FAS蛋白表達(dá)均明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),PPARα蛋白的表達(dá)有升高趨勢(shì),但是無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,CPT-1A蛋白的表達(dá)顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,沙苑子苷A低、中、高劑量L02細(xì)胞SREBP-1c、FAS蛋白的表達(dá)均顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),沙苑子中、高劑量組L02細(xì)胞PPARα、CPT-1A蛋白的表達(dá)顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表8,圖2)。

    表8 沙苑子苷A對(duì)L02細(xì)胞SREBP-1c、FAS、PPARα、CPT-1A蛋白的影響

    注:A:空白對(duì)照組;B:1mM游離脂肪酸;C:沙苑子苷A低劑量組;D:沙苑子苷A中劑量組;E:沙苑子苷A高劑量組圖2 甘油三酯代謝相關(guān)蛋白免疫印跡圖

    3 討論

    目前,西醫(yī)常用的調(diào)脂藥有他汀類、貝特類、膽酸螯合樹脂類、煙酸類及其衍生物等,但都有一定的胃腸道不良反應(yīng)、頭痛或者肌肉疼痛,嚴(yán)重的可出現(xiàn)肝功能損害或橫紋肌溶解癥[12]。黃酮類化合物是一種廣泛存在于自然界中的天然有機(jī)化合物,具有較高的安全性和廣泛的生物活性[13],越來(lái)越多的研究顯示黃酮類化合物在調(diào)節(jié)血脂和預(yù)防冠心病方面發(fā)揮了重要作用[14],如:羅布麻葉總黃酮能減輕高血脂導(dǎo)致的血管內(nèi)皮損傷和改善體內(nèi)氧化應(yīng)激水平[15],山楂葉總黃酮可調(diào)控法尼醇受體(farnesoid X receptor,F(xiàn)XR)/ SREBP-1c通路改善非酒精性脂肪肝大鼠肝臟脂質(zhì)代謝紊亂[16],還有沙棘總黃酮[17],銀杏葉總黃酮[18]等等,具有良好的開發(fā)和應(yīng)用前景。沙苑子黃酮是沙苑子中含量較高的一類化合物,目前已經(jīng)從沙苑子中提取到超過(guò)16 種的黃酮類化合物,其中沙苑子苷A是含量較高的黃酮類成分之一[11,19]。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)沙苑子總黃酮的藥理作用研究較多,但是對(duì)單體成分的藥理研究還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用FFA誘導(dǎo) L02 構(gòu)建肝細(xì)胞脂肪變模型,觀察沙苑子苷A對(duì)脂肪變L02細(xì)胞的影響,探討其降脂作用及分子機(jī)制。

    肝臟脂肪變的細(xì)胞模型較高脂飼養(yǎng)建立的動(dòng)物模型個(gè)體差異較小,可較好的對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行把控,其中油酸和棕櫚酸以2∶1比例而成的FFA混合物建立細(xì)胞脂肪變模型更符合人體脂肪變的病理過(guò)程[20]。本實(shí)驗(yàn)采用CCK8法測(cè)定了不同濃度FFA對(duì)細(xì)胞活性的影響,同時(shí)結(jié)合油紅O染色光鏡下細(xì)胞內(nèi)脂滴形成情況和定量檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)TG水平,最終確定1 mM FFA誘導(dǎo)24小時(shí)可成功造模。沙苑子苷A干預(yù)治療后,能顯著降低L02細(xì)胞TG、TC、ALT、AST、LDH含量,同時(shí)降低MDA含量、提高SOD活性,降低IL-6、TNF-α的水平,說(shuō)明沙苑子苷A能減輕脂毒性造成的肝細(xì)胞損傷,緩解氧化應(yīng)激狀態(tài)和炎癥反應(yīng),提示沙苑子苷A是沙苑子降脂保肝的有效單體成分。

    研究表明,TG合成途徑中兩個(gè)重要的核受體轉(zhuǎn)錄因子SPEBP-1c和PPARα對(duì)其起關(guān)鍵作用。SREBP-1c是脂肪酸和甘油三酯合成中的關(guān)鍵分解因子,主要參與肝臟脂肪酸合成和脂肪前體細(xì)胞的分化,其過(guò)表達(dá)會(huì)引起與脂質(zhì)異常相關(guān)的疾病如糖尿病、高脂血癥、代謝綜合征的發(fā)生[21-22],可通過(guò)調(diào)節(jié)其下游靶基因FAS、ACC、GPAT的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)肝臟中TG的合成[23]。其中乙酰輔酶A羧化酶(ACC)催化乙酰輔酶A形成丙二酰輔酶A,合成長(zhǎng)鏈脂肪酸前體,脂肪酸合成酶(FAS)是一種多功能復(fù)合酶,催化乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A,參與長(zhǎng)鏈脂肪酸生產(chǎn)的內(nèi)源性蛋白酶[24],在合成脂肪酸方面發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[25]。GPAT是TG生物合成的限速酶[26]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,給予沙苑子苷A預(yù)處理,模型細(xì)胞SREBP-1c、FAS mRNA和蛋白的表達(dá)量均顯著,表明沙苑子苷A可通過(guò)抑制肝臟SREBP-1c的表達(dá),下調(diào)肝臟FAS,抑制肝臟中TG的合成。

    PPARα是核受體超家族的成員之一,可顯著改善血脂異常和減輕動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)[27]。PPARα激活后與配體形成異二聚體[27],可調(diào)控與脂質(zhì)代謝相關(guān)的多種基因編碼的蛋白質(zhì),如脂肪酸轉(zhuǎn)位酶、乙酰輔酶A氧化酶等[28],從而介導(dǎo)TG和脂肪酸的代謝分解。CPT-1A是線粒體內(nèi)脂肪酸β氧化途徑的限速酶[29],其作用是將長(zhǎng)鏈脂肪酸從胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)如線粒體內(nèi)部,進(jìn)行β氧化[30]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,給予沙苑子苷A預(yù)處理,模型細(xì)胞PPARα、CPT-1A mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著升高,說(shuō)明沙苑子苷A通過(guò)上調(diào)肝臟PPARα的表達(dá)水平,提高CPT-1A的活性,加速了脂肪酸的β氧化分解,進(jìn)而使TG的合成減少。

    綜上所述,沙苑子苷A對(duì)脂肪變性L02肝細(xì)胞模型具有良好的降脂和保肝作用,其降脂機(jī)制可能是沙苑子苷A通過(guò)抑制肝細(xì)胞SREBP-1c的表達(dá),降低TG合成途徑中限速酶FAS水平,降低TG合成速度;同時(shí)上調(diào)PPARα蛋白表達(dá),提高脂肪酸β氧化途徑中CPT-1A水平,加速脂肪酸的β氧化,減少TG合成,從兩方面共同作用從而達(dá)到降脂和保肝效果。

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