基于GC-IMS對勐?？h曬青毛茶的揮發(fā)性組分分析

劉學(xué)艷，王 娟，彭 云，呂才有，李若愚

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)龍潤普洱茶學(xué)院，云南昆明 650201）

云南省西雙版納勐海縣是聞名中外的普洱茶故鄉(xiāng)，有豐富的古茶樹群。勐?？h具有“中國普洱茶第一縣”的美譽(yù)，其南糯山、賀開、納卡、布朗山是全國著名的茶葉產(chǎn)地，擁有“老班章”等著名普洱茶品牌。勐海普洱茶“湯色黃綠明亮、香氣純正持久、滋味醇厚回甘”，具有獨(dú)特“勐海味”[1]，其豐富的文化底蘊(yùn)及國內(nèi)外公認(rèn)的保健功效賦予了普洱茶無窮的發(fā)展?jié)摿途C合價(jià)值[2?3]。勐海曬青毛茶作為純正勐海普洱茶的唯一原料，其主要內(nèi)含成分、揮發(fā)性香氣物質(zhì)，加工工藝的研究尤其重要。勐海曬青毛茶一般選用國家級茶樹良種—勐海大葉種茶樹鮮葉經(jīng)攤晾、殺青、揉捻后，采用太陽光曬干而成[4]。勐海曬青毛茶水浸出物含量高達(dá)40%以上[5]，氨基酸、可溶性糖和咖啡堿等含量與普洱、保山等地的曬青毛茶有極顯著差異[6]，豐富的兒茶素等內(nèi)含物質(zhì)為勐海曬青毛茶的抗氧化等功效奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)[7,8]。作為普洱茶的原材料，曬青毛茶的品質(zhì)是優(yōu)質(zhì)普洱茶的基礎(chǔ)[9]。近年來，越來越多的人追求未經(jīng)后發(fā)酵的曬青茶，認(rèn)為曬青茶更能體現(xiàn)勐海茶“一山一味”的特征。為了探明“一山一味”的形成原因，很多學(xué)者做過相關(guān)研究。例如蔡麗等[10]使用HPLC 法測定了勐?？h10 個(gè)曬青毛茶樣品的兒茶素，發(fā)現(xiàn)各鄉(xiāng)鎮(zhèn)曬青毛茶樣品中兒茶素單體含量差異顯著，田小軍等[11]研究發(fā)現(xiàn)曬青毛茶主要香氣為醇類、酮類和碳?xì)浠衔?，與未經(jīng)儲藏的普洱生茶品質(zhì)相似。劉敏等[12]研究認(rèn)為曬青毛茶的主要香氣成分由芳樟醇，其次為α-松油醇、香葉醇、4-苯基吡啶和葉綠醇等構(gòu)成。Wu等[13]選取了景邁和無量山的云南大葉種曬青毛茶分析其香氣特點(diǎn)，還有人研究了人工光源對曬青綠茶品質(zhì)的影響[14]。

近年來，常用于茶葉揮發(fā)性組分分離鑒別方法主要有拉曼光譜、高效液相色譜、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等[15]。氣相離子遷移譜GC-IMS 是最近幾年常用于用于食品風(fēng)味檢測的技術(shù)[16]，例如橄欖油的分類[17]，細(xì)菌的檢測鑒定[18]，金華火腿[19]腌豬肉[20]等食用肉類的香氣鑒別分析。此技術(shù)將氣相色譜GC與離子遷移譜IMS 相結(jié)合[21]，兩者聯(lián)用既可提高GC 技術(shù)的檢測靈敏度，還能顯著提高IMS 技術(shù)的分辨率和線性響應(yīng)范圍[22]。GC-IMS 技術(shù)沒有復(fù)雜的樣品前處理過程，可以保證茶葉中香氣物質(zhì)不因前處理發(fā)生改變或流失，更準(zhǔn)確地對茶葉香氣物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析[23]。林若川[24]、江津津[25]、金文剛[26]分別將此技術(shù)應(yīng)用于綠茶、柑普茶、“漢中仙毫”的氣味指紋差異分析，均認(rèn)為此技術(shù)可用于茶葉揮發(fā)性組分的快速鑒別，也可用于茶葉產(chǎn)地區(qū)分，質(zhì)量評估等。

前人大量的研究集中于普洱茶的研究[27?28]，或者是勐海曬青毛茶的常規(guī)成分測定以及安全性研究[29]，對于勐?？h曬青毛茶的揮發(fā)性組分研究極少。因此，本文選取了勐?？h3 個(gè)主產(chǎn)地的12 份曬青毛茶樣品，使用GC-IMS 技術(shù)，較準(zhǔn)確地分離和定性樣品中的揮發(fā)性有機(jī)物組分，旨在深入研究勐海曬青毛茶的揮發(fā)性組分以及三個(gè)主產(chǎn)地樣品之間的異同點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

曬青毛茶 共12 份，分別來自勐?？h的布朗山鄉(xiāng)、勐宋鄉(xiāng)、格朗和鄉(xiāng)，每個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)4 份樣品，均為2019年春茶，詳細(xì)信息見表1，由云南省西雙版納州勐?？h農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測站提供。

表1 勐海縣12 份曬青毛茶樣品信息Table 1 12 Sun-dried green tea samples’ informations of Menghai county

FlavourSpec 食品風(fēng)味分析儀（含CTC 自動(dòng)頂空進(jìn)樣器、Laboratory Analytical Viewer（LAV）分析軟件、GC×IMS Library Search 軟件及軟件內(nèi)置的NIST 數(shù)據(jù)庫和IMS 數(shù)據(jù)庫） 德國G.A.S 公司。

1.2 GC-IMS 測試方法

1.2.1 樣品處理 使用感量為0.01 g 的精密電子天平，分別稱取1 g 曬青毛茶樣品于20 mL 頂空瓶中，80 ℃條件下頂空孵育15 min 后進(jìn)樣。每份樣品做3 組平行實(shí)驗(yàn)，頂空進(jìn)樣后用FlavourSpec?風(fēng)味分析儀直接測試，測定結(jié)束后，使用用儀器自帶的VOCal 和三款插件（Reporter、Gallery Plot、Dynamic PCA）進(jìn)行離子遷移譜、差異圖譜和主成分分析。頂空進(jìn)樣體積為500 μL；進(jìn)樣針溫度為85 ℃；孵化轉(zhuǎn)速為500 r/min。

1.2.2 GC-IMS 條件 色譜柱類型：MXT-5（15 m×0.53 mm×1 μm）；柱溫：60 ℃；載氣：高純N2，純度≥99.999%；運(yùn)行時(shí)間：20 min；氣體流量：載氣起始流速2 mL/min，保持2 min 后，18 min 內(nèi)線性增至100 mL/min，漂移氣持續(xù)20 min 保持150 mL/min的流速。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用儀器配套的分析軟件 LAV （Laboratory Analytical Viewer）和三款插件以及GCIMS Library Search.我們先用LAV 軟件繪制并分析譜圖，圖中每一個(gè)點(diǎn)代表一種揮發(fā)性有機(jī)物；利用Reporter 插件直觀對比樣品之間譜圖差異；利用Dynamic PCA 插件進(jìn)行動(dòng)態(tài)主成分分析，可以將樣品進(jìn)行聚類；利用GC×IMS Library Search 應(yīng)用軟件內(nèi)置的NIST 數(shù)據(jù)庫和IMS 數(shù)據(jù)庫對茶樣揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行二維定性分析；利用Gallery Plot 插件建立茶樣HS-GC-IMS 譜圖中VOCs 的指紋圖譜，對不同樣品之間的揮發(fā)性有機(jī)物差異進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 曬青毛茶樣品中揮發(fā)性有機(jī)物指紋圖譜對比

利用Gallery Plot 插件建立了12 份茶樣HSGC-IMS 譜圖中VOCs 的指紋圖譜（如圖1）。圖中從上到下分別為1-12 號樣品的有機(jī)物信號峰信息，每一行代表一個(gè)樣品，每個(gè)樣品平行測定3 次，由該樣品所含的全部揮發(fā)性有機(jī)物信號峰組成，每一列為同一保留時(shí)間及漂移時(shí)間下的有機(jī)物信號峰。

從圖1中VOCs 的離子峰排列可明顯看出，12 個(gè)曬青毛茶樣品中，平行測定的樣品組內(nèi)含有共有VOCs，即組內(nèi)樣品具有明顯的相似性，僅區(qū)別于濃度大??；由此也說明GC-IMS 儀器對樣品揮發(fā)性有機(jī)物信號響應(yīng)值具有很強(qiáng)的的穩(wěn)定性。不同茶葉樣品含有對應(yīng)時(shí)間內(nèi)所特有的VOCs，樣品組間則呈現(xiàn)出明顯的差異。即12 個(gè)茶葉樣品中有相似的揮發(fā)性香氣物質(zhì)，也有不同種類和含量的揮發(fā)性香氣物質(zhì)。圖1中橫排揮發(fā)性有機(jī)物信號峰可以看出各個(gè)茶葉樣品中所含有的揮發(fā)性有機(jī)物的種類，比較圖1中豎排信息，則可以看出12 份樣品中，所對應(yīng)的同種揮發(fā)性有機(jī)物在含量上的差異。

圖1 曬青毛茶樣品揮發(fā)性香氣化合物的指紋圖譜Fig.1 Fingerprint of volatile compounds of sun-dried green tea samples

2.2 曬青毛茶樣品的差異圖譜分析

為了更加清晰地比較樣品間的差異，采用差異對比模式，將12 個(gè)茶葉樣品的二維圖譜繪制成差異圖譜（如圖2）。差異圖譜以1 號樣品的譜圖作為參比，剩余11 個(gè)樣品的譜圖扣減參比，圖2中白色區(qū)域表示二者揮發(fā)性有機(jī)物一致，扣減后沒有差異，紅色代表該物質(zhì)的濃度高于1 號茶樣，藍(lán)色代表該物質(zhì)的濃度低于1 號茶樣。

由圖2可知，12 份樣品得到揮發(fā)性物質(zhì)有明顯的差異。如圖中“a 區(qū)域”黃色分布較廣，且顏色較深，說明2 號樣品的多種香氣物質(zhì)含量比1 號樣品高，“b 區(qū)域”的黃色和藍(lán)色都比較分散，且顏色很淺，說明3 號樣品與1 號樣品差異較小。“c 區(qū)域”藍(lán)色分布較廣，且顏色較深，說明11 號樣品的很多揮發(fā)性香氣含量物質(zhì)較1 號樣品低。

圖2 曬青毛茶樣品的GC-IMS 差異圖譜Fig.2 Differences fingerprint of volatile compounds in sun-dried green tea samples

2.3 勐海曬青毛茶樣品揮發(fā)性香氣成分定性分析

為了定性比較12 份樣品中揮發(fā)性香氣物質(zhì)的相對差異，利用VOCal 插件處理數(shù)據(jù)，得到12 份曬青毛茶樣品的離子遷移譜圖（如圖3為1 號樣品的離子遷移圖譜），圖中一個(gè)點(diǎn)代表一種揮發(fā)性有機(jī)物，有機(jī)物的濃度由這些點(diǎn)的顏色深淺表示?？v坐標(biāo)表示保留時(shí)間（s），橫坐標(biāo)表示遷移時(shí)間，紅色垂直線表示反應(yīng)離子峰（RIP）。有的化合物有2 個(gè)斑點(diǎn)，分別代表濃度和性質(zhì)不同的單體和二聚體。數(shù)字編號所代表的化合物名稱及相關(guān)信息見表2。

通過比較12 組樣品特征性風(fēng)味物質(zhì)的保留時(shí)間和遷移時(shí)間，使用外標(biāo)正酮 C4～C9作為參考標(biāo)準(zhǔn)，校正得到各種揮發(fā)性物質(zhì)的保留指數(shù)，并繪制各揮發(fā)性香氣物質(zhì)信息表（表2），圖3種數(shù)字編號與表2種編號一一對應(yīng)。

結(jié)合圖2～圖3，表2可以看出12 份茶葉樣品的揮發(fā)性有機(jī)組分有明顯的差異。其中，老曼峨（3 號樣品）揮發(fā)性組分與曼囡曼班一隊(duì)茶樣（1 號樣品）揮發(fā)性組分相似，都是壬醛、辛醛、苯甲酸甲酯、1-辛烯-3-酮、1-己醇、2-乙基呋喃、2-乙基己醇等物質(zhì)的含量稍高；曼囡道坎茶樣（2 號樣品）的揮發(fā)性組分種類和濃度遠(yuǎn)高于曼囡曼班一隊(duì)茶樣（1 號樣品），主要表現(xiàn)在醛類（E-2-戊烯醛、癸醛、（E,E）-2,4-庚二烯醛、E-2-己烯醛、丁醛）、酮類（6-甲基-5-庚烯-2-酮、2-丁酮）、酯類（2-苯乙酸乙酯、苯甲酸乙酯）、醇類（芳樟醇、氧化芳樟醇）及烯類（檸檬烯、α-蒎烯）和3-甲基丁酸；曼邁河邊寨茶樣（5 號樣品）中苯乙酮、丁內(nèi)酯、1-戊醇乙酸等物質(zhì)的含量較高；曼金囡茶樣（6 號樣品）中醛類（2-十一烯醛、E-2-壬烯醛、E-2-辛烯醛）和2-乙酰基呋喃等物質(zhì)的含量較高；曼金曼開茶樣（7 號樣品）是醇類（1-辛烯-3-醇、甲醇）和酮類（2-庚酮、2-己酮）占優(yōu)勢。帕真茶樣（9 號樣品）中醛類（甲基丙醛、苯甲醛、苯乙醛、糠醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛）揮發(fā)性有機(jī)組分含量極高；南糯石頭一隊(duì)（11 號樣品）中丁酸丁酯、2-甲基噻吩、乙酸乙酯、2-甲基丁醇、戊醛、丙酮、乙醇、二甲基硫醚等物質(zhì)的含量較高；南糯水河寨（12 號樣品）中香茅醇、β-羅勒烯、2-戊基呋喃等物質(zhì)的含量較高；曼囡新寨（4 號樣品）、曼邁（8 號樣品）與南糯新路茶樣的（10 號樣品）差異圖譜相似，都是醛類和酯類良種揮發(fā)性組分含量較高，主要是庚醛、己醛、丙酸丁酯、水楊酸甲酯、2-甲基己醛、乙酸丁酯、丙酸乙酯、3-甲基-1-戊醇等物質(zhì)的含量較高，曼囡新寨毛茶、曼邁曬青毛茶與南糯新路曬青毛茶來自于3 個(gè)不同的鄉(xiāng)鎮(zhèn)，曼邁與南糯新路地理位置很近，兩個(gè)樣品揮發(fā)性組分非常相似。但曼囡新寨（4 號樣品）、曼邁（8 號樣品）與南糯新路茶樣（10 號樣品）地理位置間隔很遠(yuǎn)，卻有相似的揮發(fā)性組分，綜上可知，不同產(chǎn)區(qū)曬青毛茶揮發(fā)性組分在類別及含量上都有一定的差異。

圖3 1 號曬青毛茶樣品中揮發(fā)性化合物特征峰位置點(diǎn)Fig.3 Characteristic peak location point of volatile compounds in sun-dried green tea sample

表2 曬青毛茶樣品的揮發(fā)性組分信息Table 2 Sun-dried green tea samples’ volatile component informations

續(xù)表2

2.4 曬青毛茶樣品的主成分分析

由圖4可知，本次試驗(yàn)的12 份曬青毛茶樣品可以分為兩大組，其中，曼囡新寨（4 號樣品）、曼邁（8 號樣品）與南糯新路茶樣（10 號樣品）為B 組，剩下的9 份樣品為A 組。兩組樣品的揮發(fā)性組分具有較大的差異，再次說明勐?？h3 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的曬青毛茶在揮發(fā)性有機(jī)組分之間沒有明顯的鄉(xiāng)鎮(zhèn)聚集性。

圖4 12 組樣品的PCA（主成分分析）圖Fig.4 Analylsis of PCA in 12 tea samples

3 討論與結(jié)論

西雙版納州勐?？h格朗和鄉(xiāng)、布朗山鄉(xiāng)、勐宋鄉(xiāng)均是曬青毛茶的主要產(chǎn)地，三個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)在地理位置上比較接近，由PCA 分析結(jié)果可知各個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)之間的曬青毛茶樣品沒有明顯的鄉(xiāng)鎮(zhèn)聚集性，每一個(gè)地區(qū)的茶都有特殊的揮發(fā)性組分物質(zhì)，進(jìn)而形成勐?？h“一山一味”的感官品質(zhì)特征。曬青毛茶的揮發(fā)性組分是多種物質(zhì)協(xié)調(diào)作用的復(fù)雜體系，其種類及含量是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)變化的過程，前人研究認(rèn)為兒茶素類生化成分變異系數(shù)很高[30]，會受茶樹品種、樹齡[26]、修剪方式[27]、加工工藝、儲存條件等多種因素影響。根據(jù)GC-IMS 結(jié)果可知，勐?？h曬青毛茶樣品的主要揮發(fā)性香氣物質(zhì)包括醇類、醛類、酮類、酯類、烯類、雜環(huán)類等，這與前人研究結(jié)果一致，但此次試驗(yàn)中檢出的醛類物質(zhì)種類高于醇類物質(zhì)，可能是因?yàn)镚C-IMS技術(shù)對醛類物質(zhì)的檢測靈敏度極高，可以把不同性質(zhì)和濃度的單體和二聚體區(qū)分開來，也可能是因?yàn)楦鞣N檢測技術(shù)對揮發(fā)性組分的分類方法不一致導(dǎo)致。

本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)布朗山鄉(xiāng)曼囡道坎的茶樣醛、醇、酮、酯等揮發(fā)性組分種類和含量都很高，格朗和鄉(xiāng)帕真茶樣和勐宋鄉(xiāng)曼邁河邊寨茶樣的醛類物質(zhì)含量很高，而格朗和鄉(xiāng)南糯山石頭一隊(duì)的茶樣酯類揮發(fā)性組分很豐富，這些新發(fā)現(xiàn)為認(rèn)識和開發(fā)利用勐?？h曬青毛茶資源提供了理論依據(jù)。此外，尚未發(fā)現(xiàn)其他學(xué)者采用GC-IMS 技術(shù)檢測勐?？h的曬青毛茶揮發(fā)性香氣物質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)說明使用GC-IMS 技術(shù)，可以快速對茶葉樣品進(jìn)行分離鑒定，定性比較不同產(chǎn)地之間的樣品揮發(fā)性物質(zhì)差異。但是，本文只對樣品進(jìn)行了定性比較，對于各地區(qū)樣品不同揮發(fā)性香氣物質(zhì)的具體含量還需繼續(xù)探索。

通過本實(shí)驗(yàn)可知，來自于相同產(chǎn)地的曬青毛茶，其香氣物質(zhì)也有一定的差異。即便是非常著名的茶葉產(chǎn)地，其覆蓋范圍內(nèi)也有揮發(fā)性香氣物質(zhì)較差的茶葉，進(jìn)一步說明單純從茶葉產(chǎn)地來判斷茶葉品質(zhì)的好壞是不可行的。當(dāng)然，要全面判斷茶葉品質(zhì)，需要從結(jié)合智能儀器和人體感官，從茶葉外形和內(nèi)質(zhì)（內(nèi)含成分、香氣、滋味）兩個(gè)方面分析，結(jié)合樣品的揮發(fā)性物質(zhì)具體含量綜合判斷，這也是課題組后期實(shí)驗(yàn)的方向。